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        高效液相色譜-質(zhì)譜法測定畜肉中的卡拉膠

        2019-06-11 06:07:02張會亮黃傳峰李佩璇孫姍姍
        食品科學(xué) 2019年10期
        關(guān)鍵詞:畜肉注膠卡拉膠

        張會亮,黃傳峰,李佩璇,江 豐,孫姍姍,丁 宏,曹 進,*

        (1.中國食品藥品檢定研究院,北京 100050;2.臨沂市食品藥品檢驗檢測中心,山東 臨沂 276000;3.湖北省食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗研究院,湖北 武漢 430073)

        卡拉膠是紅藻的細胞壁多糖,是由半乳糖及半乳糖衍生物構(gòu)成的半乳聚糖硫酸酯。根據(jù)重復(fù)結(jié)構(gòu)特征以及1,3-連接的D-半乳糖上的硫酸基位置,卡拉膠可分為11種不同構(gòu)型,主要構(gòu)型為κ-型、ι-型和λ-型卡拉膠,尤其以κ-型多見[1]。藻體中不存在理想的重復(fù)二糖結(jié)構(gòu)的卡拉膠,均為多種卡拉膠結(jié)構(gòu)的混合體,食品級卡拉膠也可看作各種構(gòu)型卡拉膠的混合物[2]。

        “注水肉”是指在生豬、牛、羊屠宰前或屠宰過程中,不法分子以灌胃或向血管泵注等形式,將水摻入動物體內(nèi)得到的生、鮮肉品。畜肉注水是存在已久的行業(yè)亂象,是食品安全聚焦點之一??ɡz因具有強大的保水性、增稠性,被不法分子所青睞,用于“注水升級”版本的“注膠肉”,各類媒體已多有報道。注入“卡拉膠水”的肉品,水分黏度增大,不易外流,較“注水肉”更加難以識別。制備“注膠肉”不僅屬于欺詐行為,因灌注的膠水中往往摻雜有防腐劑、血、工業(yè)色素等物質(zhì),改變了肉品組成,引入致病微生物和外來物質(zhì)污染、重金屬超標等風(fēng)險,還會危害食品安全[3]。

        目前“注膠肉”尚無相關(guān)檢測標準或規(guī)范,僅可通過相關(guān)水分含量標準判斷。相關(guān)標準中規(guī)定的豬肉的水分質(zhì)量分數(shù)不得高于77%[4],由于識別的有效性欠缺,對違法樣品打擊力度不足[5-6]。國外報道了用聚合物基質(zhì)管狀膜傳感器作為電極,以電位測定方法定量測定卡拉膠含量[7]。目前國內(nèi)研究中采用最多的檢測“注膠肉”的技術(shù)是低場核磁共振(low field nuclear magnetic resonance,LF-NMR)技術(shù)和近紅外光譜(near infrared spectroscopy,NIR)技術(shù)?;跇悠稬F-NMR弛豫特性的判別分析可實現(xiàn)對肉糜注膠程度的分段預(yù)測[8];利用LF-NMR結(jié)合主成分分析法,根據(jù)肉品中的水分存在狀態(tài)及分布結(jié)果,實現(xiàn)對豬肉中的卡拉膠的檢測[9]。NIR方法報道的有結(jié)合主成分分析和判別分析法[10]、結(jié)合偏最小二乘法[11]建立注膠肉和正常肉的定性判別模型;使用一階導(dǎo)數(shù)對光譜進行預(yù)處理,采用因子化法建立定性判別模型[12]等。

        上述方法均依賴于判別模型、主成分分析等化學(xué)計量學(xué)手段,不易推廣;判定參數(shù)不明確,難以作為定性特別是執(zhí)法檢驗的依據(jù),限制了其應(yīng)用。本實驗針對卡拉膠主要來源為人為添加,在新鮮肉品中并不存在的特性,提供了一種利用高效液相色譜-質(zhì)譜法對卡拉膠特征性降解產(chǎn)物,即標志物進行檢測的方法。經(jīng)多家實驗室驗證表明,該方法對畜肉中存在的卡拉膠可實現(xiàn)靈敏、特異性識別,可作為打擊“注膠”畜肉的有效技術(shù)手段。

        1 材料與方法

        1.1 材料與試劑

        不含卡拉膠畜肉來源于養(yǎng)殖廠,并全程跟蹤屠宰過程,其他畜肉樣品采購于超市;卡拉膠(食品添加劑級) 石獅市環(huán)球瓊脂工業(yè)有限公司。甲酸銨(批號LH80P38,優(yōu)級純) 百靈威公司;鹽酸(批號20150930,分析純) 北京化工廠。實驗所用水均為一級水。

        1.2 儀器與設(shè)備

        1290-6460液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜儀、1290-6540液相色譜-飛行時間質(zhì)譜儀 美國安捷倫公司;vortex-5型渦旋混勻器 海門市其林貝爾儀器制造有限公司;AL 204電子天平 瑞士梅特勒公司;INTEGRAL 3純水儀美國Milipore公司;ZWY240恒溫水浴 上海智城公司;Pro 200高速勻漿機 美國Pro公司。

        1.3 方法

        1.3.1 對照品儲備液

        稱取卡拉膠0.1 g,用8 mL 60 ℃溫水溶解,轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中,冷卻后用水定容,配制成質(zhì)量濃度為10 mg/mL的儲備液。

        1.3.2 樣品處理

        待測樣品用食品料理機充分打碎混勻,稱取10 g于50 mL離心管中,加入23 mL水,10 000 r/min勻漿1 min,加入2 mL 12 mol/L鹽酸,加蓋渦旋30 s后置于80 ℃水浴中20 min,每10 min振搖一次。取出放冷至室溫后,4 000 r/min離心5 min,上清液用乙腈1∶1稀釋,過0.22 μm尼龍濾膜,供高效液相色譜-質(zhì)譜檢測。

        1.3.3 標準工作液的制備

        稱取打碎混勻的不含卡拉膠的畜肉10 g于50 mL離心管中,分別加入卡拉膠對照品儲備液0.1、0.2、0.3、0.4 mL,加入水使液體量為23 mL,10 000 r/min勻漿1 min,以下操作同1.3.2節(jié),供高效液相色譜-質(zhì)譜檢測。

        1.3.4 儀器條件

        1.3.4.1 液相色譜條件

        色譜柱:W a t e r s B E H A m i d e色譜柱(50 mm×2.1 mm,1.8 μm);流動相:A為10 mmol/L甲酸銨溶液,B為乙腈;流速:300 μL/min;柱溫:30 ℃;進樣量:5 μL。梯度洗脫,流動相B相比例為:初始80%,3 min內(nèi)變至40%,保持至5 min結(jié)束。

        1.3.4.2 串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜條件

        離子源:電噴霧離子源;掃描方式:負離子模式掃描;毛細管電壓4 000 V;檢測方式:多反應(yīng)監(jiān)測;干燥氣溫度200 ℃,流量5 L/min;鞘氣溫度280 ℃,鞘氣流量8 L/min;霧化氣壓力30 psi。監(jiān)測離子對信息見表1。1.3.5 高分辨質(zhì)譜條件

        表1 串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜中的卡拉膠特征離子對Table 1 Triple quadrupole mass spectrometric parameters for carrageenan

        離子源:電噴霧離子源;掃描方式:負離子模式掃描;干燥氣溫度325 ℃;流量10 L/min;霧化氣壓力40 psi;碎裂電壓:135 V;毛細管電壓4 000 V;檢測方式:一級質(zhì)譜掃描,用于定性的離子信息見表2。

        表2 高分辨質(zhì)譜中的卡拉膠特征離子Table 2 Characteristic ions of carrageenan by high resolution mass spectrometry

        1.3.6 定性和定量方法

        表1中兩對離子均可用于定性和定量。樣品溶液中多反應(yīng)監(jiān)測色譜峰的保留時間、豐度比與標準工作液色譜峰一致時,可判定檢出卡拉膠成分。使用高分辨質(zhì)譜確認時,出現(xiàn)2 種或2 種以上表2中離子時,可確證檢出。

        定量測定以標準工作溶液中含卡拉膠的質(zhì)量為橫坐標,以表1中定量離子的色譜峰面積為縱坐標繪制標準工作曲線。按外標法計算待測樣品中卡拉膠的含量。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 標志物離子的確定方法

        卡拉膠的降解方式有酶法、酸法和物理方法[13-16]。不同降解方式可得到不同系列的卡拉膠寡糖[16-18]。使用酸法降解得到的m/z500左右的低分子質(zhì)量端寡糖的種類多于酶法和物理方法[18],因此本實驗優(yōu)先使用酸法降解。

        圖1 卡拉膠標志物的確定過程Fig. 1 Flow chart for determination of carrageenan markers

        實驗條件下對卡拉膠溶液降解,使用1.3.5節(jié)中的條件進行高分辨一級質(zhì)譜采集,得到一系列與文獻報道一致的產(chǎn)物離子[2,13-19]。為了從中篩選可用的標志物,取陰性畜肉3 份作為本底組,卡拉膠溶液3 份作為對照組,進行了平行處理,采集高分辨一級質(zhì)譜。數(shù)據(jù)經(jīng)過分子特征提取,使用Mass Profiler Professional軟件進行差異組分查找,確定可能的標志物。增加血液、臟器作為本底進一步驗證,排除本底中存在的離子,最終得到了表2中的特異性標志物,流程見圖1所示。

        圖2展示了Mass Profiler Professional軟件描繪的本底組和對照組中化合物分布示意圖。圖中每條折線均代表一種化合物,縱坐標代表化合物含量水平,橫坐標代表樣品標簽:標簽2、3、4為卡拉膠溶液樣品,標簽7、8、9為陰性畜肉樣品。卡拉膠標志物的含量應(yīng)滿足在2、3、4中較高,在7、8、9中較低,如圖2橢圓圈示的折線。

        圖2 差異組分分析結(jié)果Fig. 2 Re sults of differential component analysis

        在串聯(lián)四極桿質(zhì)譜方法中,最終使用豐度較大的單電荷離子:κ-卡拉膠基本結(jié)構(gòu)單元[G4S-A]和ι-卡拉膠基本結(jié)構(gòu)單元[G4S-A2S]作為特征離子,見圖3。

        圖3 用于檢測的卡拉膠標志物離子信息Fig. 3 Information about carrageenan ions used as markers

        2.2 前處理條件的優(yōu)化

        卡拉膠溶液在0.1 mol/L稀酸存在的條件下即可發(fā)生降解生成寡糖[20]。但卡拉膠與蛋白質(zhì)共存時可形成牢固的交聯(lián)體系,使用卡拉膠酶或稀酸降解體系中的卡拉膠很難得到降解產(chǎn)物[21-22];在強酸和高溫條件下,體系中的蛋白質(zhì)先被破壞,隨后發(fā)生卡拉膠的降解[23]。此外,酶法降解卡拉膠對試劑和成本要求都較高,而使用超聲物理降解法所需時間過長,酸法降解是最簡便的方法。

        考察體系中不同濃度鹽酸對降解效率的影響,見圖4。對于卡拉膠的水溶液,體系中鹽酸濃度為0.1 mol/L時,80 ℃水浴20 min即可得到標志物離子;但當卡拉膠與肉共存時,體系中0.1 mol/L鹽酸不能使卡拉膠降解;0.5 mol/L鹽酸僅可得到少量降解產(chǎn)物;當體系中酸濃度增大至1 mol/L時,可以獲得降解產(chǎn)物,當酸濃度增至2 mol/L時,降解產(chǎn)物濃度沒有明顯提高,最終選擇體系中存在1 mol/L鹽酸進行降解,見圖4。

        圖4 鹽酸濃度對降解效率的影響Fig. 4 Effect of HCl concentration on degradation efficiency

        卡拉膠的熱降解遵循偽一級動力學(xué),延長反應(yīng)時間有助于得到更多產(chǎn)物[24],但本實驗使用的降解條件較強,延長降解時間對降解產(chǎn)物豐度改善不明顯,見圖5。最終,本實驗使用1 mol/L濃度鹽酸和80 ℃條件下20 min完成了卡拉膠的降解。

        圖5 反應(yīng)時間對降解效率的影響Fig. 5 Effect of reaction time on degradation efficiency

        2.3 色譜-質(zhì)譜條件與峰形

        降解得到的卡拉膠寡糖標志物具有較強極性,在C18色譜柱上保留較弱。一些卡拉膠寡糖的表征研究中使用庚胺等離子對試劑-反相色譜[25-26]或凝膠排阻色譜[15,27],以達到多種寡糖之間的分離,在此基礎(chǔ)上研究降解產(chǎn)物分布,并進行以一級質(zhì)譜為主的定性分析[15,19,28]。本實驗?zāi)康牟辉谟诜蛛x不同寡糖,因此未引入庚胺等離子對試劑,而是使用親水保留色譜達到分離。

        在[A]、[G4S]、[A2S]等六元環(huán)中,m/z 403為母離子的多反應(yīng)監(jiān)測峰形較m/z 483差,這可能是因為[A]環(huán)的空間位阻小、六元環(huán)構(gòu)象差異導(dǎo)致[10,29]。實驗考察水-乙腈和10 mol/L甲酸銨溶液-乙腈體系對分離效果的影響。含甲酸銨的流動相體系中,目標化合物峰形得到一定程度改善。由于使用反-反相分離模式,進樣前用乙腈對處理得到的溶液進行稀釋,以減少溶劑效應(yīng)。

        2.4 方法學(xué)考察

        分別使用牛肉、羊肉、豬肉3類畜肉,描繪基質(zhì)加標工作曲線,并在0.1、0.2 g/kg和0.4 g/kg三水平分別進行加標,其中0.2 g/kg水平重復(fù)測定6 次。計算回收率和方法重復(fù)性精密度。串聯(lián)四極桿質(zhì)譜中的代表性圖譜見圖6。

        圖6 使用串聯(lián)四極桿質(zhì)譜采集得到的色譜圖Fig. 6 Representative chromatograms from triple quadrupole mass spectrometry

        本實驗在0.1~0.4 g/kg的含量范圍內(nèi)考察方法學(xué)指標。原因如下:用于“注膠”的卡拉膠溶液適宜的質(zhì)量分數(shù)在0.2%~1%之間,質(zhì)量分數(shù)高于1%,溶液易凝固成膠狀而無法進行灌注;質(zhì)量分數(shù)低于0.2%,溶液注入后被體液進一步稀釋,起不到保水作用。問題畜肉注入水的質(zhì)量分數(shù)一般大于5%。0.1 g/kg含量的卡拉膠相當于向牲畜體內(nèi)注入了活體質(zhì)量分數(shù)5%的0.2%卡拉膠溶液,屬于較低含量水平,以0.1 g/kg作為標曲最低點,可滿足實際應(yīng)用中對靈敏度的要求。

        表3 串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜法的方法學(xué)指標Table 3 Methodological parameters of triple quadrupole mass spectrometry

        從表3可見,豬、牛、羊肉3 種基質(zhì)各3 個添加水平的加標回收率在90%~120%之間。添加量為0.2 g/kg重復(fù)6 份平行測定的相對標準偏差均小于5%。兩對離子對的主要差異在于靈敏度和線性系數(shù)。m/z403>241離子對的線性相關(guān)系數(shù)在0.99以上;m/z483>403離子對的線性系數(shù)較差,僅能達到0.95以上。從曲線斜率上看,m/z403>241離子對的靈敏度要優(yōu)于m/z483>403離子對。兩對離子的靈敏度和線性差異的原因是其來源不同:產(chǎn)生m/z403母離子的是κ型基本單元[G4S-A],其在卡拉膠聚合鏈中占比較高;產(chǎn)生m/z483母離子的是ι-卡拉膠基本結(jié)構(gòu)單元[G4S-A2S],其在卡拉膠聚合鏈中占比較低。同時,降解過程中,ι-卡拉膠硫酸基團容易脫去[27,30],也導(dǎo)致m/z483離子強度降低,影響線性。

        2.5 實際樣品分析結(jié)果

        對采購于不同正規(guī)超市的豬、牛、羊肉樣品各10 份進行檢測,未檢出陽性結(jié)果。同時采購了標簽標識添加卡拉膠的調(diào)理牛排(生肉)5 批次,均檢出卡拉膠,含量為0.086~0.39 g/kg。此外,檢測一批標識含卡拉膠的豬肉火腿腸(熟肉),檢出含量為0.087 g/kg。實際檢測的標識含卡拉膠樣品,結(jié)果未出現(xiàn)假陰性。

        3 結(jié) 論

        本實驗建立生、鮮畜肉中卡拉膠測定的液相色譜-串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜和液相色譜-串聯(lián)高分辨質(zhì)譜法,可實現(xiàn)摻入卡拉膠的“注膠肉”的定性和定量測定。該法前處理過程簡單,檢測指標明確,方法線性范圍、準確度、精密度及檢出限均滿足相關(guān)標準的要求,可作為打擊“注膠肉”亂象的有效手段。

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