陳雨薇，王 蕾，吳永寧，宮智勇,*

（1.武漢輕工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，大宗糧油精深加工省部共建教育部重點實驗室，湖北 武漢 430030；2.國家食品安全風(fēng)險評估中心重點實驗室，北京 100032）

大米是中國居民最重要的主食之一，2015年中國稻谷的播種面積和產(chǎn)量分別占糧食播種總面積和總產(chǎn)量的26.7%和33.5%，稻谷產(chǎn)量在全世界占比更是高達(dá)31%[1]。但是由于大量工業(yè)重金屬廢棄物排入環(huán)境中，空氣、土壤和灌溉水等污染越來越嚴(yán)重，糧食特別是稻谷的重金屬污染問題日漸突出[2]。

水浸是加工米線、米糕等食物的重要工序[3]，將這個必要工序進(jìn)行條件優(yōu)化，利用水浸最大程度地降低大米粉中鎘含量，可以對鎘污染不太嚴(yán)重的稻谷加工利用有著很好的經(jīng)濟效益和社會效益。大米粉的水浸是自然發(fā)酵的過程，此過程中的微生物主要為細(xì)菌、霉菌、酵母菌等，其中乳酸菌在發(fā)酵過程中占據(jù)絕對優(yōu)勢，是優(yōu)勢菌種。Lu Zhanhui等[4]從大米粉的浸泡液中分離出32 株植物乳桿菌、28 株纖維二糖乳桿菌、23 株彎曲乳桿菌、21 株發(fā)酵乳桿菌。因此，大米粉浸泡過程中產(chǎn)酸明顯，其中有機酸以乳酸為主，醋酸次之[5]。酸液形成低pH值環(huán)境，使大米粉顆粒結(jié)構(gòu)變疏松[6]，酸液的殘留可加快乳酸菌的生長繁殖，進(jìn)一步促進(jìn)大米中鎘元素的溶出[9]，削減大米粉中的鎘殘留。

有學(xué)者對大米中鎘的水浸法削減進(jìn)行研究，如劉晶等[7]以30 ℃浸泡30 h為終點，大米粉中鎘含量降低33.71%；陸金鑫等[8]經(jīng)過浸泡使精米中的鎘含量降低約40%；傅亞平等[9]采用乳酸菌發(fā)酵技術(shù)對大米粉中鎘進(jìn)行處理，脫除率達(dá)85.73%；Mihucz等[5]在研究大米中鎘的提取方法時發(fā)現(xiàn)水浸處理可以從精米粉中去除大約50%的鎘。但是目前，水浸法削減大米粉中鎘的最佳工藝及其品質(zhì)影響的研究鮮見報道，因此本研究采用鎘含量為（0.459±0.006）mg/kg的大米，研究水浸法去除大米粉中鎘的最優(yōu)工藝條件并對其品質(zhì)影響進(jìn)行研究，為工業(yè)化批量生產(chǎn)大米制品時降低其鎘含量的加工工藝提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鎘污染大米（秈稻）采自湖南省，用微波消解-石墨爐原子吸收光譜法檢測稻米鎘含量，湖南秈稻大米鎘含量為（0.459±0.006） mg/kg，超過我國現(xiàn)行的食品中污染物限量（GB 2762—2016《食品中污染物限量》）[10]對大米中鎘限量標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定。

1 000 μg/mL鎘標(biāo)準(zhǔn)儲備液 國家有色金屬及電子材料分析測試中心；濃硝酸、溴化鉀、乙醚（均為優(yōu)級純） 國藥集團化學(xué)試劑有限公司；Megazyme總淀粉測定試劑盒 愛爾蘭Megazyme公司。

1.2 儀器與設(shè)備

THU358礱谷機、TM05C碾米機 日本佐竹公司；JXFM110錘式旋風(fēng)磨 上海嘉定糧油有限公司；Multiwave PRO超高壓微波消解系統(tǒng) 奧地利Anton Paar公司；趕酸儀 上海博通化學(xué)科技有限公司；Milli-Q Integral超純水制備裝置 美國Millipore公司；PinAAcle 900T石墨爐原子吸收 美國Perkin Elmer公司；恒溫?fù)u床培養(yǎng)箱 中國培安有限公司；LXJ II離心機 上海醫(yī)用分析儀器廠；Vario MICRO cube元素分析儀 德國Elementar公司；全自動脂肪測定儀 成都市蘇凈科學(xué)器材有限公司；Empyrean X射線衍射儀 荷蘭帕納科公司；NEXUS670傅里葉變換紅外光譜儀 美國尼高力儀器公司；S-3000N掃描電鏡 日本日立公司；差示掃描量熱儀（differential scanning calorimetry，DSC）美國TA公司。

1.3 方法

1.3.1 鎘去除工藝流程

大米→磨粉（過80 目篩）→加入蒸餾水（選擇合適的料液比、水浸溫度、水浸時間）→搖床洗脫→離心（4 000 r/min，10 min）→40 ℃烘干粉碎→鎘含量測定→指標(biāo)測定。

1.3.2 大米粉中鎘含量的測定

采用微波消解-石墨爐原子吸收光譜法測定大米粉中鎘含量。鎘去除率按下式計算：

式中：C0為處理前大米粉中鎘含量/（mg/kg）；C為處理后大米粉中鎘含量/（mg/kg）。

1.3.3 單因素試驗

在大米粉中加入一定量體積的蒸餾水，在料液比1∶3（g/mL）、水浸時間48 h條件下，分別在20、30、40、50、60 ℃進(jìn)行浸泡；在水浸溫度40 ℃、水浸時間48 h條件下，分別以料液比為1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5（g/mL）進(jìn)行浸泡；在水浸溫度40 ℃、料液比1∶3（g/mL）條件下，分別浸泡12、24、36、48、60 h，以考察料液比、水浸溫度、水浸時間3 個因素對重金屬鎘去除率的影響。

1.3.4 響應(yīng)面試驗優(yōu)化

通過單因素試驗確定影響鎘去除率的主要因素和最佳水平范圍，根據(jù)響應(yīng)面中的Box-Behnken原理，選擇料液比、水浸溫度、水浸時間設(shè)計3因素3水平試驗，響應(yīng)面試驗因素與水平如表1所示。

表1 Box-Behnken試驗因素與水平Table 1 Coded levels and corresponding actual levels of the independent variables used in response surface design

1.3.5 水浸前后主要化學(xué)成分的測定

準(zhǔn)確稱取50.0 g大米粉，在最優(yōu)條件下水浸，水浸后用蒸餾水洗2 遍，于恒溫鼓風(fēng)干燥箱中40 ℃干燥48 h，測定水分、淀粉、蛋白質(zhì)、脂肪和灰分含量，淀粉、蛋白質(zhì)、脂肪和灰分含量均以干質(zhì)量計。

水分含量的測定：根據(jù)GB 5009.3—2016《食品中水分的測定》[11]中的恒重法測定；淀粉含量的測定：采用總淀粉含量測定試劑盒；蛋白質(zhì)含量的測定：元素分析儀測定氮含量，根據(jù)GB 5009.5—2016《食品中蛋白質(zhì)的測定》[12]中的凱氏定氮法進(jìn)行蛋白質(zhì)含量換算；脂肪含量的測定：以乙醚為溶劑，用脂肪測定儀進(jìn)行脂肪浸提，用恒重法測定。

灰分的測定：根據(jù)GB 5009.4—2010《食品中灰分的測定》[13]中直接灰分法進(jìn)行測定。

1.3.6 水浸前后大米粉掃描電鏡觀察

米粉經(jīng)IB-13離子濺射儀噴鍍金膜后，于S-3000N掃描電鏡下觀察并攝影，加速電壓20 kV，放大2 000 倍。

1.3.7 大米粉熱力學(xué)特性測定

稱取過100 目篩的2.0 mg米粉于鋁制坩堝中，加入2 倍體積的蒸餾水，壓蓋密封并靜置過夜；初始溫度20 ℃，以10 ℃/min速率升至110 ℃，用DSC測定糊化溫度和糊化過程中熱焓的變化，以真空鋁制坩堝作為參比，每個樣品重復(fù)3 次。

1.3.8 大米粉淀粉晶體結(jié)構(gòu)的觀察

室溫下采用X-射線衍射儀對原料大米粉和水浸大米粉進(jìn)行檢測。檢測條件：石墨單色器，靶為Cu-Kα，管壓為45 kV，電流為40 mA，發(fā)射狹縫為1°，防散射狹縫為1°，接受狹縫為7.5 mm，2θ掃描區(qū)間為3°～50°，掃描速率為2°/min。通過JADE 5.0軟件進(jìn)行結(jié)晶度的計算。

1.3.9 大米粉紅外光譜分析

分別取2.0 mg干燥的原料大米粉和水浸大米粉與150.0 mg干燥的KBr粉末混合，于紅外燈下研磨后壓片，置于紅外光譜儀中進(jìn)行4 000～400 cm－1波段掃描，分辨率為4 cm－1，得到原料大米粉和水浸大米粉樣品的紅外光譜圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

圖1 3 種因素對鎘去除率的影響Fig. 1 Effects of three factors on the removal rate of cadmium

如圖1所示，水浸過程中pH值不斷下降，標(biāo)志著微生物生長繁殖產(chǎn)生有機酸，因此通過自然發(fā)酵，乳酸使大米變得具有柔性并帶有獨特酸味，但在后期會夾帶臭味。pH值的下降一方面抑制了其他微生物的生長，使乳酸菌成為優(yōu)勢菌種，在一定程度上抑制腐敗[14]，另一方面，通過pH值的下降，大米粉中的鎘溶于發(fā)酵液中，降低大米粉中鎘濃度。水浸法去除米粉中的重金屬鎘主要原理是大米粉在水中自然發(fā)酵，部分微生物代謝產(chǎn)生有機酸而達(dá)到去除大米粉中鎘的目的。

由圖1A所示，當(dāng)料液比1∶3（g/mL）、水浸時間48 h時，鎘去除率隨溫度的變化呈現(xiàn)先升后降趨勢，在40 ℃達(dá)到最大去除率。當(dāng)水浸溫度低于30 ℃或高于50 ℃，鎘去除率明顯下降，這可能是因為大米粉自然發(fā)酵中生長的微生物最適代謝溫度為30～50 ℃[15]。

如圖1B所示，在水浸溫度40 ℃、水浸時間48 h條件下，當(dāng)料液比為1∶1～1∶3（g/mL）時，隨著加水量的增大，大米粉中的鎘去除率逐漸增大，這可能是由于大米粉吸水膨脹有利于微生物作用[16]，而當(dāng)料液比為1∶4～1∶5（g/mL）時，鎘去除率急劇下降，這可能因為微生物數(shù)量及酸濃度被稀釋。

如圖1C所示，在水浸溫度40 ℃、料液比1∶3（g/mL）時，大米粉的鎘去除率在12～48 h之間隨著水浸時間的延長而提高，超過48 h后鎘去除率隨時間的延長而趨于平緩。魯戰(zhàn)會等[17]研究自然發(fā)酵大米的安全性問題，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵前期有霉菌數(shù)量增加緩慢，大腸菌群在發(fā)酵2 d后降低到不可檢出水平。這得益于乳酸發(fā)酵對病原微生物有抑制和殺滅作用。因此，出于經(jīng)濟和安全考慮，以48 h的水浸時間為宜，此時大米粉中的鎘去除率達(dá)到了（56.51±2.52）%，大米粉中的鎘含量為（0.197±0.011）mg/kg，未超出國家標(biāo)準(zhǔn)。

2.2 響應(yīng)面試驗結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，使用Design-Expert 8.0軟件，以鎘去除率為指標(biāo)，設(shè)計3因素3水平的響應(yīng)面試驗，結(jié)果如表2所示。通過對表2數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到回歸方程為Y=72.73+3.67A+16.15B+1.18C+0.04AB－0.01AC+0.06BC－0.04A2－3.12B2－0.01C2。

表2 響應(yīng)面試驗分析結(jié)果（ =3）Table 2 Experimental design and results for response surface analysis ( = 3)

表3 方差分析Table 3 Analysis of variance of regression model

對回歸方程進(jìn)行方差分析，結(jié)果如表3所示?；貧w模型P值為0.030 1，小于0.05，說明此回歸方程顯著，失擬項P值為0.716 2，大于0.05，不顯著，說明所建立的二次回歸模型成立，與實際情況擬合較好，可用此模型來分析和預(yù)測水浸工藝條件。由表3可知，相關(guān)系數(shù)R2較高，為0.852 6，表明該回歸方程適用于水浸法去除大米粉中鎘的理論預(yù)測。A、B2對大米粉中鎘去除率有顯著影響（P＜0.05），A2對大米粉中鎘去除率有極顯著影響（P＜0.01）。影響大米粉中鎘去除率的主次因素依次為A＞B＞C，即水浸溫度＞料液比＞水浸時間。

2.2.2 交互作用分析

圖2 各因素間的響應(yīng)面圖及等高線圖Fig. 2 Response surface plots and contour plots showing the interactive effects between the factors

等高線圖的橢圓形表示兩因素之間交互作用明顯，圓形表現(xiàn)兩交互關(guān)系不明顯[18]。由圖2可知，水浸溫度和水浸時間、水浸時間和料液比交互作用對鎘去除率的影響較顯著。

根據(jù)所得的模型，預(yù)測最優(yōu)的水浸條件為水浸溫度42.67 ℃、料液比1∶3.3（g/mL）、水浸時間46.94 h，鎘去除率為60.00%。但考慮到實際情況，將水浸條件改為水浸溫度42 ℃、料液比1∶3（g/mL）、水浸時間47 h。在預(yù)測最優(yōu)水浸條件下，進(jìn)行5 次驗證實驗，水浸后大米粉鎘含量為（0.176±0.003）mg/kg，鎘去除率為（61.75±4.31）%，與理論值較為接近。因此，該回歸模型能較好地預(yù)測實際鎘去除情況。

2.3 水浸對大米粉營養(yǎng)物質(zhì)的影響

圖3 最佳工藝條件對營養(yǎng)成分的影響Fig. 3 Effect of the optimized treatment on nutrient retention

由圖3可知，水浸后，大米粉脂肪含量略有下降，由0.442%下降至0.438%。這是由于浸泡過程中游離脂肪酸的流失和發(fā)酵過程中微生物作用使脂肪分解成游離的脂肪酸。另外，由于脂肪的自動氧化，游離脂肪酸分解成低分子的醛、酮物質(zhì)，致使大米粉出現(xiàn)不良?xì)馕禰19]。水浸后大米粉的淀粉含量略有下降，這是由于微生物的淀粉酶對淀粉產(chǎn)生酶解作用。大米粉水浸后蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)有較為顯著地下降，從（12.76±0.87）%下降到（10.95%±0.86）%，一個原因是水溶性蛋白質(zhì)溶出，另一個原因是微生物產(chǎn)生蛋白酶將蛋白質(zhì)分解成小分子肽或氨基酸，而后被微生物用作生長過程中的氮源[20]。大米粉水浸后，灰分質(zhì)量分?jǐn)?shù)從0.028%降至0.015%，這主要是由于蛋白質(zhì)和脂肪發(fā)生降解，使其中的礦物質(zhì)元素更容易溶出?；曳值娜艹霾粌H使大米粉鎘濃度降低，還使大米粉的白度增加，使外觀更好[21]。

2.4 水浸對大米粉形態(tài)的影響

圖4 原料大米粉（A）和水浸大米粉（B）表面電鏡掃描圖Fig. 4 SEM photos of rice fl our before and after soaking

如圖4所示，原料大米粉結(jié)構(gòu)緊致，而水浸米粉孔徑更大，這些小孔可能是發(fā)酵過程中鎘和其他營養(yǎng)物質(zhì)的流出通道[16]。

2.5 水浸對大米粉熱力學(xué)特征的影響

DSC是在程序升溫下，保持待測物質(zhì)與參照物溫度差為零，測量待測物質(zhì)和參照物的熱量差隨溫度變化的一種技術(shù)[22-23]。由圖5和表4可知，大米粉水浸后糊化起始溫度從67.83 ℃降低至67.17 ℃，這是由于淀粉粒晶體片層被破壞，其穩(wěn)定性低，所需糊化溫度變低。一般情況下，直鏈淀粉含量與糊化溫度呈負(fù)相關(guān)[24]，所以水浸后大米粉中的直鏈淀粉含量可能升高。淀粉DSC峰值糊化溫度可以反映淀粉粒晶體成分的質(zhì)量，不穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)會導(dǎo)致峰值糊化溫度降低。從表4可以看出，水浸后的米粉峰值溫度僅下降0.01 ℃，說明水浸處理沒有破壞米粉內(nèi)的淀粉粒晶體成分?？傮w來說，水浸后米粉糊化溫度降低，糊化時間延長，糊化焓增大，其產(chǎn)品的拉伸力可能增強，彈性、硬度和咀嚼性可能下降[25-26]。

圖5 原料大米粉和水浸大米粉的DSC糊化曲線Fig. 5 DSC curves of raw and soaked rice fl our

表4 原料大米粉和水浸大米粉的DSC結(jié)果Table 4 DSC measurements of raw and soaked rice flfl our

2.6 水浸對淀粉晶體結(jié)構(gòu)的影響

圖6 原料大米粉和水浸大米粉淀粉的X射線衍射圖譜Fig. 6 X-ray diffraction of raw and soaked rice fl our

表5 原料大米粉和水浸大米粉淀粉顆粒的X射線衍射晶區(qū)結(jié)構(gòu)Table 5 X-ray diffraction parameters of starch granules in raw and soaked rice fl our

由圖6、表5可知，所有的淀粉顆粒都在15°、17°、18°和23°有很強的衍射峰，這些都是A型結(jié)晶[27]。由于淀粉分子在大米粉中形成了結(jié)晶區(qū)域、半結(jié)晶區(qū)域和非結(jié)晶區(qū)域，而非結(jié)晶區(qū)域主要是由直鏈淀粉構(gòu)成[16]，X射線衍射在結(jié)晶區(qū)域會形成尖銳的特征峰而在非結(jié)晶區(qū)域則是彌散峰形[28]。圖6顯示大米粉水浸后峰的強度略微變?nèi)?，?也說明水浸大米粉的淀粉結(jié)晶度從21.61%下降至20.88%，這可能是因為水浸后大米粉的直鏈淀粉含量增加，導(dǎo)致非結(jié)晶區(qū)域面積增大，從而使淀粉結(jié)晶度下降，此結(jié)果也與DSC實驗結(jié)果一致。表5顯示大米粉水浸后，其面間距略有降低，根據(jù)許金東[29]的研究，米飯的硬度、回彈性、黏聚性與面間距呈正相關(guān)，所以，水浸可能導(dǎo)致大米粉產(chǎn)品較原料產(chǎn)品的硬度、咀嚼度、回彈性、黏聚性下降。

2.7 水浸對大米粉官能團的影響

圖7 原料大米粉和水浸大米粉淀粉的紅外光譜圖Fig. 7 FTIR spectra of raw and soaked rice fl our

紅外光譜分析常用于化合物定性分析和分子結(jié)構(gòu)的測定，因此可以鑒定水浸大米粉結(jié)構(gòu)是否發(fā)生變化或產(chǎn)生新的官能團，其中紅外區(qū)（4 000～400 cm－1）常用于淀粉吸收光譜分析[30]。

對原料大米粉和水浸大米粉進(jìn)行4000～400 cm－1全掃描，結(jié)果如圖7所示。4 000～3 000、2 900～3 000、1 550～1 700、1 300～1 400、750～1 000 cm－1區(qū)間的吸收峰（分別對應(yīng)O—H的伸縮振動、C—H伸縮振動、C=O伸縮振動、C—H面內(nèi)彎曲振動、C—H面外彎曲振動[16,31]）形狀沒有發(fā)生改變，位置沒有大的偏移，強度稍有增強，但沒有新的吸收峰。因此，大米粉在水浸過程中并沒有發(fā)生劇烈的化學(xué)變化而產(chǎn)生新的化學(xué)鍵或基團。

3 結(jié) 論

綜合單因素和響應(yīng)面法對大米粉水浸削減鎘的條件優(yōu)化：在水浸溫度42 ℃、料液比1∶3（g/mL）、水浸時間47 h時，大米粉中的鎘去除率達(dá)到（61.75±4.31）%，大米粉中的鎘含量由（0.459±0.006）mg/kg下降至（0.176±0.003）mg/kg，未超出國家限量標(biāo)準(zhǔn)。且大米粉中的鎘含量與發(fā)酵液pH值呈負(fù)相關(guān)，說明大米粉在水浸過程中乳酸菌成為優(yōu)勢菌，在有機酸的作用下使大米粉中的鎘溶出，從而達(dá)到鎘削減的目的。

在最佳工藝條件下，大米粉中的水分和蛋白質(zhì)含量顯著降低，脂肪、淀粉、蛋白質(zhì)、灰分含量也有一定量的下降，一方面是由于大米粉中的水溶性物質(zhì)溶出，另一方面自然發(fā)酵產(chǎn)生的微生物的脂肪酶、淀粉酶、蛋白酶等降解了大米粉中一部分營養(yǎng)物質(zhì)。由于脂肪和蛋白的減少，大米粉中的鎘和其他礦物質(zhì)更易溶出，使得大米粉中鎘含量和灰分都有一定程度的降低。

通過DSC測定大米粉水浸后的熱力學(xué)變化，發(fā)現(xiàn)其糊化起始溫度降低，而峰值溫度變化很小，說明大米粉晶體片層被破壞，穩(wěn)定性降低，大米粉中的直鏈淀粉含量可能升高，但水浸處理并沒有破壞米粉內(nèi)的淀粉粒晶體成分。

通過X射線衍射儀測定大米粉的淀粉晶體結(jié)構(gòu)變化發(fā)現(xiàn)水浸大米粉的淀粉結(jié)晶下降，這可能是因為水浸后大米粉的直鏈淀粉含量增加，導(dǎo)致非結(jié)晶區(qū)域面積增大，從而使淀粉結(jié)晶度下降，此結(jié)果也與DSC實驗結(jié)果一致。水浸大米粉面間距略有降低，說明水浸可能導(dǎo)致大米粉產(chǎn)品較原料產(chǎn)品的硬度、咀嚼度、回彈性、黏聚性下降。

紅外光譜測定結(jié)果顯示，大米粉在水浸過程中并沒有產(chǎn)生新的化學(xué)鍵或基團。