趙 鳳，許 萍，曾詩雨，楊 興,*

（1.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水產(chǎn)研究所，貴州 貴陽 550025；2.通標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)（上海）有限公司農(nóng)產(chǎn)食品部，上海 200030）

發(fā)酵酸魚是貴州侗族的傳統(tǒng)美食之一，其腌制方式獨(dú)特，味道香美[1]，深受當(dāng)?shù)鼐用竦南矏郏彩钦写腿说拿牢都央?，具有豐富的飲食文化內(nèi)涵[2]。其制作方式簡單，只需將魚肉放在干凈的容器內(nèi)魚與糯米粉交替平鋪，然后在適宜的溫度下進(jìn)行密封發(fā)酵。鱘魚是貴州山區(qū)的特色冷水魚，目前主要以鮮活銷售為主，為填補(bǔ)鱘魚加工市場的空白，需開發(fā)一種發(fā)酵鱘魚產(chǎn)品。

揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)種類較多，包括酸類、醇類、醛類、酯類、酮類、芳香烴、酚類等，其中酸、醇、酯、酮、醛具有較低的閾值，對風(fēng)味的形成具有重要作用，因此檢測食品中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)非常重要，尤其是對發(fā)酵產(chǎn)品等氣味顯著的食品。

固相微萃?。╯olid phase micro-extraction，SPME）的主要特點(diǎn)是樣品需求量少、溶劑消耗少、靈敏度高、重復(fù)性和線性好，而且還可以將采樣、萃取、濃縮、進(jìn)樣集為一體，操作簡單快捷，結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）聯(lián)用可以萃取和分析鑒定很多種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)[3]。目前水產(chǎn)品中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的主要研究方法是SPME-GC-MS技術(shù)[4-8]，主要方法是利用SPME萃取樣品中的揮發(fā)性物質(zhì)，然后GC-MS進(jìn)行分離和鑒定。近年來一些學(xué)者對各種腌魚的風(fēng)味進(jìn)行研究[9-11]，但是關(guān)于發(fā)酵魚肉的風(fēng)味研究很少，如李春萍[12]研究臭鱖魚發(fā)酵過程中的風(fēng)味物質(zhì)，發(fā)現(xiàn)醇類含量最高，而丁酸、三甲胺和芳樟醇對風(fēng)味貢獻(xiàn)較大，管娟[13]研究固態(tài)發(fā)酵鰳魚，發(fā)現(xiàn)接種清酒乳桿菌發(fā)酵時揮發(fā)性羰基類以及醇類、酸類化合物的種類和含量明顯增加。本實(shí)驗(yàn)以鱘魚為原料，采用傳統(tǒng)的發(fā)酵工藝，利用SPME-GC-MS方法分析從原料到發(fā)酵成熟過程中鱘魚肉中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)種類和含量的變化，探討發(fā)酵鱘魚風(fēng)味形成的過程，旨在研究整個發(fā)酵過程鱘魚的風(fēng)味品質(zhì)，以期為鱘魚的綜合加工利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鱘魚由惠眾漁業(yè)有限公司惠水養(yǎng)殖基地提供。

氫氧化鈉、氯化鈉、磷酸鹽（均為分析純） 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；亞油酸標(biāo)準(zhǔn)品 德國CNW科技公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SPME裝置：手動進(jìn)樣手柄、65 μm聚二甲基硅氧烷/二乙基（polydimethylsiloxane/divinylbenzene，PDMS/DVB）萃取頭 美國Supelco公司；GC6890-MS5975 GC-MS儀、HP-5MS彈性毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm） 美國Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

工藝流程：新鮮鱘魚→取肉→腌制→發(fā)酵→成品。

操作要點(diǎn)：取鮮活的鱘魚宰殺，去頭、尾、內(nèi)臟，取肉瀝干，魚片切成每塊質(zhì)量20～30 g，添加魚塊質(zhì)量3%食鹽和各種香辛料（辣椒、花椒、姜等），攪拌均勻，在4 ℃腌制2 d，然后在50～60 ℃干燥3 h，干燥至水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)約55%～60%，冷卻至室溫，在容器的底部鋪上部分糯米粉，然后魚與糯米粉交替平鋪，壓緊，頂部鋪上一層糯米粉后夯實(shí)，加蓋，封嚴(yán)，20～24 ℃發(fā)酵5～6 周，直至pH 4.1～4.4制得即食休閑風(fēng)味發(fā)酵魚制品。

樣品采集：選擇新鮮、腌制、發(fā)酵5、10、20、25、35 d的鱘魚發(fā)酵樣品（編號分別為CX、CTA、CTB、TCC、CTD、CTE、CTF），每個時期取3 個平行作為重復(fù)，其中發(fā)酵階段取3 個不同位置作為3 個樣品。

1.3.2 SPME-GC-MS檢測

研究報道萃取時添加飽和NaCl溶液可以有效終止魚肉酶活性，降低揮發(fā)性風(fēng)味成分的溶解度，促進(jìn)揮發(fā)性化合物的揮發(fā)，從而提高萃取效率[14]。將各組樣品分別與0.18 g/mL的NaCl溶液按1∶1質(zhì)量比混合，勻漿后稱取5 g樣品到頂空瓶中待測，平行測定3 次。

SPME條件：65 μm萃取頭250 ℃老化30 min后，插入樣品瓶中，距頂端4 mm左右，在35、45、60、80、95 ℃水浴溫度吸附40 min，然后插入GC進(jìn)樣口中，250 ℃解吸5 min后，取出萃取頭，GC-MS分析檢測。

GC條件：HP-5MS彈性毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；不分流模式進(jìn)樣；升溫程序：柱初溫40 ℃，保持2 min，以4 ℃/min升至160 ℃，而后以10 ℃/min升至250 ℃，保持5 min；進(jìn)樣口溫度250 ℃；載氣（He）流量1.0 mL/min。

MS條件：傳輸線溫度280 ℃；離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；電子能量70 eV；質(zhì)量掃描范圍m/z 35～450。

1.3.3 定性與定量分析

定性：利用系統(tǒng)自帶NIST 02和Wiley質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫分析，且僅當(dāng)正反匹配度均大于800（最大值1 000）的化合物才予以報道[15-16]。具體以C7～C40的正構(gòu)烷烴為標(biāo)準(zhǔn)品，通過和文獻(xiàn)中的保留指數(shù)比對計算標(biāo)準(zhǔn)品的保留指數(shù)，再結(jié)合數(shù)據(jù)庫的分析，最終對化合物進(jìn)行定性。

定量：利用面積歸一化法計算各成分在樣品中揮發(fā)性成分的相對含量，峰面積積分由安捷倫工作站完成；每個樣品3 個重復(fù)，結(jié)果作方差分析，利用SPSS 21.0軟件分析處理[17]。

1.3.4 關(guān)鍵風(fēng)味化合物的確定

采用相對氣味活度值（relative odor activity value，ROAV）法[18]，選擇樣品中總體風(fēng)味貢獻(xiàn)最大的組分定義ROAVstan=100，其他揮發(fā)性物質(zhì)ROAV則按下式計算：

式中：Cri為揮發(fā)性物質(zhì)的相對含量/%；Ti為相應(yīng)物質(zhì)感覺閾值/（μg/L）；Crstan為對總體風(fēng)味貢獻(xiàn)最大組分的相對含量/%；Tstan為對應(yīng)物質(zhì)的感覺閾值/（μg/L）。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用Xcalibur軟件分析GC-MS數(shù)據(jù)；所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)通過Excel、SPSS 17.0分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同發(fā)酵階段鱘魚中揮發(fā)性成分分析

采用SPME-GC-MS對各發(fā)酵階段鱘魚樣品的揮發(fā)性成分進(jìn)行測定，得到不同發(fā)酵階段樣品的GC-MS總離子流圖，見圖1。將取得的色譜峰在NIST譜庫檢索以及參考文獻(xiàn)，確定鱘魚發(fā)酵過程中共鑒定出108 種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，其中烴類、酯類、芳香類、酮類、醛類、酸類、酚類、醇類以及其他類分別為17、13、6、11、21、7、1、29 種和3 種。

圖1 不同發(fā)酵階段鱘魚揮發(fā)性成分總離子流圖Fig. 1 Total ion current (TIC) chromatogram of volatile compounds in fermented sturgeon meat sampled at different fermentation stages

由表1可得，不同發(fā)酵階段鱘魚肉的揮發(fā)性風(fēng)味成分的種類以及相對含量的變化比較明顯。鮮魚、腌制、發(fā)酵5、10、20、25 d和35 d 7個階段的揮發(fā)性風(fēng)味成分的種類分別為38、48、66、72、75、76 種和84 種；隨著發(fā)酵時間的延長，揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的種類由前期的38 種增至成熟時的84 種，酯類、酸類和酚類的相對含量增加最為明顯，由前期的未檢出到發(fā)酵成熟時相對含量已達(dá)到19.63%。發(fā)酵成熟時，醛類、醇類、烴類及酮類是發(fā)酵鱘魚的主要揮發(fā)性成分，說明發(fā)酵過程中這些物質(zhì)的變化反應(yīng)鱘魚發(fā)酵風(fēng)味的形成過程。

2.2 鱘魚發(fā)酵過程中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)變化分析

2.2.1 醇類化合物

在鱘魚發(fā)酵過程中醇類化合物的種類由新鮮時的12 種增加至發(fā)酵成熟時的26 種，但是醇類化合物的相對含量逐漸降低。在新鮮魚肉中的主要醇類物質(zhì)是2-辛炔醇和1-辛烯-3-醇，但在腌制后相對含量明顯下降且隨發(fā)酵時間的延長相對含量越來越低；腌制后的主要醇類物質(zhì)是1-戊烯-3-醇和桉油醇，其中相對含量也是隨發(fā)酵時間的延長逐漸降低，但是桉油醇在新鮮魚肉中未 檢測出。己醇在發(fā)酵初期的相對含量最高，隨后逐漸降低，到發(fā)酵成熟時相對含量比在新鮮和腌制2個階段的相對含量都高。相對含量較高的桉油醇和芳樟醇僅發(fā)酵鱘魚中產(chǎn)生，主要原因是這2種物質(zhì)不是水產(chǎn)品本身所含物質(zhì)，而是添加香辛料進(jìn)入魚體的，成為加工類魚制品的新風(fēng)味成分[12]。同樣雪松醇和松油醇也有可能是通過添加劑進(jìn)入魚體，成為發(fā)酵鱘魚的特有風(fēng)味物質(zhì)。2-丁醇僅在發(fā)酵成熟后檢測出。其中飽和醇類的閾值高，所以對風(fēng)味的貢獻(xiàn)就小[19]。不飽和醇閾值低，有特殊的香氣[20]，對魚類風(fēng)味的貢獻(xiàn)大。1-辛烯-3-醇在水產(chǎn)品中非常常見，本實(shí)驗(yàn)中此物質(zhì)在新鮮魚肉中的相對含量最大，但隨著發(fā)酵時間延長，相對含量明顯下降，它是亞油酸的氫過氧化物降解產(chǎn)物[21]，可產(chǎn)生蘑菇風(fēng)味[22]，普遍存在于淡水魚及海水魚的揮發(fā)性物質(zhì)中[23]，因其閾值低，故對鱘魚的風(fēng)味形成貢獻(xiàn)很大。

2.2.2 烴類化合物

在鱘魚發(fā)酵過程中檢出的烴類化合物共17 種，各個階段均檢測到大量烴類化合物，相對含量較高，但飽和烴化合物閾值一般都很高，所以對鱘魚發(fā)酵產(chǎn)品的風(fēng)味貢獻(xiàn)較小。2,6,10,14-四甲基十五烷能夠賦予食品清香和甜香[24]。十四烷、十五烷、十六烷、十七烷和十七烷可能是由高分子質(zhì)量的非不飽和脂肪酸降解產(chǎn)生，發(fā)酵過程中相對含量逐漸降低可能是被進(jìn)一步分解為小分子化合物。研究發(fā)現(xiàn)，C6～C19存在于魚類和甲殼動物類的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)中，但因其閾值高，對水產(chǎn)品的整體風(fēng)味貢獻(xiàn)不大[25]。在整個發(fā)酵過程中檢測到多種萜烯類化合物，其在其他水產(chǎn)研究中也有相關(guān)報道[26-28]檢測到。在一定條件下，烴類化合物可形成醛、酮和醇類等風(fēng)味物質(zhì)[29]，所以對鱘魚風(fēng)味的形成具有潛在作用。

2.2.3 酯類化合物

酸和醇可發(fā)生酯化反應(yīng)形成酯類化合物[30]。在整個鱘魚發(fā)酵過程中，新鮮鱘魚和腌制階段未檢測到酯類物質(zhì)，發(fā)酵成熟后累積了大量的酯類物質(zhì)，酯類物質(zhì)可賦予食品水果香味[31-32]，是促進(jìn)鱘魚發(fā)酵風(fēng)味形成的重要物質(zhì)。在發(fā)酵成熟時，乙酸乙酯相對含量在酯類物質(zhì)中最高，又因其閾值低，故對鱘魚發(fā)酵樣品的風(fēng)味貢獻(xiàn)率較大，使得發(fā)酵鱘魚具有特殊的酯香味。

2.2.4 醛類化合物

醛類化合物主要是酶和微生物氧化脂類化合物形成的[33]，閾值低，因氣味加和作用，即使微量也會對產(chǎn)品的風(fēng)味產(chǎn)生很大影響[34]，因此被認(rèn)為是腌臘魚的主要特征風(fēng)味物質(zhì)。鱘魚發(fā)酵過程中共檢測到21 種醛類物質(zhì)，隨著發(fā)酵時間的延長醛類化合物的種類增多。己醛濃度高時產(chǎn)生酸敗味，濃度低時則產(chǎn)生清香味和香草味[35]，是亞油酸的氧化產(chǎn)物[36]，在鱘魚發(fā)酵過程中其相對含量隨著發(fā)酵時間的延長逐漸降低，使得發(fā)酵成熟產(chǎn)品產(chǎn)生更好的香味。壬醛有柑橘的香味[37]，閾值低，在發(fā)酵過程中均檢測到壬醛的存在，是發(fā)酵鱘魚的關(guān)鍵性風(fēng)味物質(zhì)。2,4-庚二烯醛是魚類的腥味物質(zhì)[11]，是生魚肉的特征揮發(fā)物質(zhì)，隨著發(fā)酵的延長其相對含量逐漸降低，使得發(fā)酵鱘魚的腥味減弱。2,4-癸二烯醛具有油炸的脂香味，在新鮮和腌制過的鱘魚中被檢出[38]。苯甲醛有甜橙氣息[39]，在發(fā)酵過程中檢測到這種物質(zhì)，因其閾值低，所以對風(fēng)味的貢獻(xiàn)大。十二醛、十三醛、十四醛、十六醛、7-十六烯、9,17-十八碳二烯醛這些分子質(zhì)量大的物質(zhì)只在腌制和發(fā)酵的樣品中被檢出，在新鮮魚肉中未檢測到，說明這些物質(zhì)對發(fā)酵鱘魚的特征風(fēng)味有重要貢獻(xiàn)。

2.2.5 酮類化合物

酮類化合物具有特殊的香味，大多數(shù)呈現(xiàn)脂肪味和焦燃味，因其閾值高于其同分異構(gòu)體的醛[40]，所以對魚肉風(fēng)味的貢獻(xiàn)比醛類小。酮類化合物可增強(qiáng)魚肉的腥味，本實(shí)驗(yàn)中新鮮和腌制的鱘魚酮類化合物在揮發(fā)性物質(zhì)中的相對含量比發(fā)酵各個階段的相對含量都高，這就可解釋發(fā)酵成熟的鱘魚腥味很弱的原因。3,5-辛二烯-2-酮具有動物油脂味，普遍存在新鮮的魚中，所以在發(fā)酵樣品中未檢出。

2.2.6 酸類化合物

整個發(fā)酵過程中共檢測到7 種酸類物質(zhì)。這些物質(zhì)在新鮮和腌制后的魚肉中都未檢測到，只是在發(fā)酵過程中或者發(fā)酵結(jié)束才檢測到。有研究表明[41]，酸類物質(zhì)一是由細(xì)菌利用氨基酸發(fā)酵形成，二是脂質(zhì)氧化形成。所以本實(shí)驗(yàn)中酸類的形成是在微生物的作用下發(fā)酵形成還是魚肉中脂質(zhì)物質(zhì)氧化形成還不確定，待進(jìn)一步研究。

表1 不同發(fā)酵階段鱘魚揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)成分的相對含量Table 1 Relative contents of volatile fl avor compounds in fermented sturgeon sampled at different fermentation times%

續(xù)表1%

續(xù)表1%

2.3 不同發(fā)酵階段鱘魚ROAV

表2 不同發(fā)酵階段鱘魚揮發(fā)性風(fēng)味成分的ROAVTable 2 ROAVs of volatile compounds in fermented sturgeon sampled at different fermentation times

ROAV越大說明這種物質(zhì)對樣品的總體風(fēng)味貢獻(xiàn)也越大。一般認(rèn)為ROAV不小于1的物質(zhì)為樣品的關(guān)鍵風(fēng)味化合物，ROAV大于等于0.1且小于1的組分對樣品的總體風(fēng)味具有重要影響[42]。如表2所示，1-辛烯-3-醇、壬醛和癸醛是新鮮鱘魚和整個鱘魚發(fā)酵過程中的關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)。苯乙醛和檸檬烯是發(fā)酵開始至成熟的關(guān)鍵風(fēng)味化合物。新鮮鱘魚肉的主體風(fēng)味物質(zhì)為2,4-癸二烯醛、1-辛烯-3-醇、壬醛、癸醛、己醛等；腌制后的鱘魚肉主體風(fēng)味物質(zhì)為壬醛、1-辛烯-3-醇、己醛、癸醛、檸檬烯等；發(fā)酵5 d鱘魚肉的主體風(fēng)味物質(zhì)為1-辛烯-3-醇、檸檬烯、壬醛、乙酸乙酯、庚醇等；發(fā)酵10 d鱘魚肉的主體風(fēng)味物質(zhì)為壬醛、1-辛烯-3-醇、乙酸乙酯、檸檬烯、癸醛等；發(fā)酵20 d鱘魚肉的主體風(fēng)味物質(zhì)為壬醛、檸檬烯、1-辛烯-3-醇、癸醛、乙酸乙酯等；發(fā)酵25 d鱘魚肉的主體風(fēng)味物質(zhì)為壬醛、檸檬烯、1-辛烯-3-醇、乙酸乙酯、癸醛等；發(fā)酵35 d鱘魚肉的主體風(fēng)味物質(zhì)為乙酸乙酯、檸檬烯、壬醛、1-辛烯-3-醇、庚醇等?？梢钥闯銮捌诤秃笃诘年P(guān)鍵風(fēng)味大致相同，與中期的關(guān)鍵性風(fēng)味物質(zhì)略有不同，其具體原因有待進(jìn)一步研究。但蔡瑞康等[43]在研究大黃魚糟制過程中風(fēng)味物質(zhì)發(fā)現(xiàn)糟制前期關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)是壬醛、辛醛和2,3-戊二酮；中期是乙酸乙酯、辛酸乙酯和苯甲醛；成熟時為乙酸乙酯和辛酸乙酯。這可能與發(fā)酵時選擇魚的種類有關(guān)。

3 結(jié) 論

采用SPME-GC-MS技術(shù)可更全面、準(zhǔn)確地鑒定鱘魚整個發(fā)酵時期的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，然后采用ROAV法分析發(fā)酵過程中各樣品的主體風(fēng)味構(gòu)成。結(jié)果表明主要關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)由2,4-癸二烯醛、1-辛烯-3-醇和壬醛、己醛、乙酸乙酯組成。且前期和后期的關(guān)鍵風(fēng)味大致相同，與中期的關(guān)鍵性風(fēng)味物質(zhì)略有不同。通過研究鱘魚發(fā)酵過程中風(fēng)味物質(zhì)種類和相對含量變化，可為風(fēng)味的形成機(jī)理及品質(zhì)控制提供參考依據(jù)，為提高鱘魚發(fā)酵的風(fēng)味品質(zhì)提供方向。