康 寧，王占斌，李德海*，王 鑾

（東北林業(yè)大學林學院，黑龍江 哈爾濱 150040）

三萜類化合物是一種重要的中藥化學成分，并且具有十分廣泛的生理活性[1]。對其生物活性及毒性研究的結(jié)果顯示，其在抗癌、抗炎、抗菌、抗病毒、抗糖尿病等多方面均顯示出值得關(guān)注的藥理特性[2]。三萜類化合物多來自于人參、靈芝、青錢柳、北五味子等植物中，有研究表明粗毛纖孔菌中也含有三萜類化合物[3]。

粗毛纖孔菌（Inonotus hispidus (Bull.) Pat.），又名粗毛黃褐孔菌，屬擔子菌亞門纖毛孔菌屬，是一種十分珍貴的藥用真菌[4]。有研究學者認為粗毛纖孔菌是“桑黃”的一種，寄主主要有水曲柳、榆樹、楊樹、桑樹等，西北地區(qū)以桑樹上常見，東北地區(qū)以水曲柳上常見。粗毛纖孔菌在民間常用來治療消化不良、糖尿病和胃病等疾病[5]。目前已有研究表明粗毛纖孔菌子實體中含有多種抗腫瘤和抗菌活性成分[6-7]。三萜類化合物就是其中重要的一類物質(zhì)，目前獲得粗毛纖孔菌三萜的方法有兩種，第一是通過人工栽培子實體，采用桑枝培養(yǎng)基及復配栽培種培養(yǎng)料可較快培養(yǎng)出粗毛纖孔菌的子實體[8-9]，此種方法費時費力，與之相比，利用液體深層發(fā)酵技術(shù)生產(chǎn)粗毛纖孔菌三萜具有生產(chǎn)周期短、菌絲增殖速度快、三萜類含量相對穩(wěn)定、不受季節(jié)影響等優(yōu)點。據(jù)文獻報道，深層發(fā)酵產(chǎn)物中三萜類化合物產(chǎn)量較低，使得培養(yǎng)成果不理想。目前通過優(yōu)化碳氮源種類[10]、接種量、培養(yǎng)溫度等發(fā)酵條件[11]、篩選菌株[12]及優(yōu)化不同提取條件[13]進行研究使深層發(fā)酵三萜產(chǎn)量和得率得到了一定提高，但與工業(yè)化生產(chǎn)還有一段距離，而研究表明誘導劑能夠促進生物體內(nèi)代謝產(chǎn)物的生物合成量。

誘導劑是提高次級代謝產(chǎn)物的重要手段，它能改變次級代謝途徑中關(guān)鍵酶的活性，通過快速、專一和選擇性地誘導植物特定基因的表達而促進細胞合成和特定代謝產(chǎn)物的積累，具有較強的特異性，從而進一步達到提高次級代謝產(chǎn)物產(chǎn)量的目的[14]。目前，不少學者研究證實利用不同誘導劑增強次級代謝產(chǎn)物的合成遠比單純優(yōu)化培養(yǎng)條件和工藝參數(shù)得到的效果要好得多。常用誘導劑主要有以下幾種：茉莉酸甲酯（methyl jasmonate，MeJA），是茉莉?qū)僦兴剀盎ㄖ邢憔偷挠袣馕痘衔?，也是茉莉?qū)幪厥庀阄兜闹匾煞郑勺鳛橐环N內(nèi)源信號分子參與到植物的防御反應，也可在植物細胞多種逆境反應中起信號介導的作用，陳林等[15]通過實驗發(fā)現(xiàn)MeJA可顯著促進茯苓三萜的生物合成，可比誘導前提高1.15 倍。水楊酸（salicylic caid，SA）是一種廣泛分布于植物體內(nèi)的酸類物質(zhì)，它不僅參與植物許多生理過程，還與植物抗病反應密切相關(guān)，王艷等[16]研究發(fā)現(xiàn)SA可誘導白樺懸浮細胞三萜物質(zhì)（三萜總量、齊墩果酸、白樺脂醇、白樺脂酸）的合成及相關(guān)基因的上調(diào)。不同脂肪酸在各種植物液體培養(yǎng)過程中起到不同作用，姚強等[17]研究發(fā)現(xiàn)硬脂酸和亞油酸對靈芝胞外及胞內(nèi)多糖均具有良好的誘導效果，其中亞油酸對靈芝三萜的合成也具有一定促進作用。金屬離子在液態(tài)深層發(fā)酵中也起著至關(guān)重要的作用，氯化錳是支持植物細胞培養(yǎng)中天然生物合成特性的潛在誘導劑，并且可用于持續(xù)生產(chǎn)有價值的次生代謝產(chǎn)物[18]。近年來關(guān)于粗毛纖孔菌三萜方面的研究僅局限在提取條件的優(yōu)化，而對于粗毛纖孔菌三萜的合成誘導的研究報道較少。

本實驗選擇MeJA、SA、油酸、水曲柳煎汁、Mn2+、Fe2+、Cu2+為誘導劑，研究其對發(fā)酵過程中菌絲體量及三萜類化合物合成的動態(tài)變化，確定誘導劑最佳濃度及誘導時間，最終建立并優(yōu)化誘導劑促進粗毛纖孔菌中三萜類化合物積累的誘導培養(yǎng)體系，提高粗毛纖孔菌三萜類化合物的合成量。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

粗毛纖孔菌IH-69由東北林業(yè)大學森林保護實驗室分離保存。

MeJA、SA、白樺脂醇、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、香草醛美國Sigma公司；油酸 阿拉丁試劑有限公司；MnSO4、FeSO4·7H2O、CuSO4、無水乙醇、鹽酸及其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

PDA培養(yǎng)基：用蒸餾水潤洗鍋壁，加入200 g土豆（1～2 cm小塊），再加入1 000 mL蒸餾水煮沸20 min，8 層紗布過濾得到土豆汁，將20 g葡萄糖與土豆汁一同放入鍋中加熱（固體培養(yǎng)基再加入10 g瓊脂），直至葡萄糖完全溶解，最后定容至1 000 mL，121 ℃滅菌30 min。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CMD超凈工作臺 蘇州蘇潔凈化設(shè)備公司；ZPQ-400智能氣候培養(yǎng)箱 哈爾濱市東明醫(yī)療儀器廠；TGL-16G臺式離心機 上海安亭科學儀器廠；722s紫外分光光度計 上海第三分析儀器廠；DK-8D電熱恒溫水槽 上海森信實驗儀器有限責任公司；RE-52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器公司；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；0.2 μm和0.45 μm濾膜 美國密理博有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株活化及培養(yǎng)

將4 ℃保存的斜面菌種接種于PDA平板上，28 ℃培養(yǎng)活化10 d，截取3 片直徑為12 mm的菌絲片接種于PDA液體培養(yǎng)基中。將活化后的菌種在無菌環(huán)境下使用勻漿機打碎，再以體積分數(shù)8%的接種量接種于PDA液體培養(yǎng)基中，于pH 7、26 ℃、125 r/min條件下振蕩培養(yǎng)10 d。

1.3.2 菌絲體干質(zhì)量的測定

發(fā)酵結(jié)束后將培養(yǎng)液經(jīng)紗布過濾得菌絲體，蒸餾水洗滌數(shù)次后在42 ℃的烘箱中烘干至質(zhì)量恒定，精確稱量菌絲體干質(zhì)量。

1.3.3 粗毛纖孔菌三萜的提取和測定

將質(zhì)量恒定的菌絲體粉碎，過60 目篩，按料液比1∶69（g/mL）加入72%乙醇溶液，210 W功率條件下超聲輔助提取31 min[19]，離心所得上清液為粗提液，－20 ℃貯藏備用。

采用香草醛-冰醋酸比色法計算三萜類物質(zhì)含量。根據(jù)文獻[20]，略作修改。準確稱取白樺脂醇標準品5 mg，溶于50 mL無水乙醇，混合均勻得標準溶液（100 μg/mL）。吸取標準溶液0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mL，分別置于5 mL容量瓶中，在100 ℃水浴上蒸干后加入0.20 mL新制的5%香草醛-冰醋酸溶液和0.80 mL高氯酸搖勻，于70 ℃水浴保溫反應15 min后流水冷卻至室溫，再加入乙酸乙酯定量到5 mL，搖勻，同時做試劑空白。在551 nm波長處以試劑空白為參比，用1 cm比色皿測定體系OD值。以白樺脂醇的質(zhì)量為橫坐標，OD值為縱坐標，繪制標準曲線，得回歸方程Y=0.006 1X+0.031 4（R2=0.999 7）。

準確吸取0.2 mL上述粗提液，按標準曲線的制備方法測定OD值，按式（1）計算三萜類化合物含量：

式中：Y為OD值；N為粗提液的稀釋倍數(shù)；m為粗毛纖孔菌菌絲體質(zhì)量/g。

1.3.4 粗毛纖孔菌菌絲體中三萜總量的測定

粗毛纖孔菌菌絲體中三萜總量即一批發(fā)酵培養(yǎng)液中所獲得的所有粗毛纖孔菌菌絲體中三萜類化合物的總量，計算如式（2）所示：

1.3.5 誘導劑添加量及添加時間的篩選

1.3.5.1 MeJA誘導三萜合成

準確稱取MeJA，將其用無菌水配制成濃度分別為50、100 μmol/L和150 μmol/L的溶液，向其加入質(zhì)量分數(shù)0.2%的助溶劑（吐溫-20或吐溫-80），后搖勻，經(jīng)0.2 μm的濾膜過濾，分別在發(fā)酵第0、3、6天將MeJA溶液添加到PDA培養(yǎng)基中，添加量為2 μL/mL，并以不加助溶劑及MeJA和僅加助溶劑的培養(yǎng)基為空白組和對照組，以1.3.1節(jié)培養(yǎng)條件進行發(fā)酵，發(fā)酵結(jié)束后測定菌絲體干質(zhì)量及粗毛纖孔菌三萜含量。

1.3.5.2 SA誘導三萜合成

配制2 mg/mL SA作為母液，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾。分別在發(fā)酵第0、3、6天添加不同量母液，使SA終質(zhì)量濃度為20、50、100、150、200 mg/L，同時以加入無菌水的培養(yǎng)基作為對照組。以1.3.1節(jié)培養(yǎng)條件進行發(fā)酵，發(fā)酵結(jié)束后測定菌絲體干質(zhì)量及粗毛纖孔菌三萜含量。

1.3.5.3 油酸誘導三萜生物合成

分別在發(fā)酵第0、3、6天添加不同體積分數(shù)（1%、2%、3%、4%、5%）的油酸，同時進行不添加油酸的對照實驗，篩選油酸最佳添加時間與添加量。以1.3.1節(jié)培養(yǎng)條件進行發(fā)酵，發(fā)酵結(jié)束后測定菌絲體干質(zhì)量及粗毛纖孔菌三萜含量。

1.3.5.4 水曲柳煎汁誘導三萜生物合成

取水曲柳條，以1∶3（g/mL）的料液比加入蒸餾水煮沸30 min后，取湯汁，經(jīng)過濾后真空濃縮，60 ℃干燥至質(zhì)量恒定，得水提物干粉。分別在發(fā)酵第0、3、6天向PDA培養(yǎng)基中添加水提物干粉，使其終質(zhì)量濃度達到100、200、300、400、500 mg/L，以1.3.1節(jié)培養(yǎng)條件進行發(fā)酵，發(fā)酵結(jié)束后測定菌絲體干質(zhì)量及粗毛纖孔菌三萜含量。

1.3.5.5 金屬離子Mn2+、Fe2+、Cu2+誘導三萜合成

準確稱取MnSO4、FeSO4·7H2O和CuSO4，用蒸餾水分別配制成不同濃度，在121 ℃滅菌30 min后在發(fā)酵第0、3、6天加入到PDA培養(yǎng)基中，使MnSO4和FeSO4·7H2O的終濃度為2、4、6、8、10 μmol/L；CuSO4的終濃度為50、100、150、200、250 μmol/L，以1.3.1節(jié)培養(yǎng)條件進行發(fā)酵，發(fā)酵結(jié)束后測定菌絲體干質(zhì)量及粗毛纖孔菌三萜含量。

1.3.6 抗氧化活性的測定

將不同誘導劑誘導培養(yǎng)后的粗毛纖孔菌菌絲體經(jīng)1.3.4節(jié)所述方法進行提取，提取液經(jīng)濃縮、冷凍干燥后得到樣品備用。

1.3.6.1 總還原能力的測定

參照Benzie等[21]的方法，準確移取不同質(zhì)量濃度梯度的樣品溶液1.0 mL，隨即快速加入2.5 mL 0.2 mol/L的磷酸鹽緩沖溶液（pH 6.6）和2.5 mL 1%的鐵氰化鉀溶液。將混合溶液置于50 ℃的恒溫水浴鍋中保溫20 min。取出后，加入2.5 mL 10%的三氯乙酸，若產(chǎn)生渾濁，則將混合物在室溫下3 500 r/min離心10 min吸取2.5 mL上清液，加入2.5 mL蒸餾水；若無渾濁則直接加2.5 mL蒸餾水，最后加入0.5 mL 0.1%的三氯化鐵溶液，混勻后反應10 min。在700 nm波長處測得反應物的吸光度，空白以蒸餾水代替樣液。以VC作為陽性對照，研究粗毛纖孔菌的總還原能力，計算如式（3）所示：

式中：A0為空白組的吸光度；A1為樣液的吸光度。

1.3.6.2 DPPH自由基清除能力的測定

參照Ozgen等[22]的方法，分別吸取不同濃度的樣品溶液2 mL，加入1×10－4mol/L DPPH溶液2 mL后充分搖勻，于室溫暗處放置30 min，517 nm波長測其吸光度A1；同時測定2 mL無水乙醇和2 mL 1×10－4mol/L DPPH混合液的吸光度A0；再測定2 mL樣液和2 mL無水乙醇混合液的吸光度A2。DPPH自由基清除率計算如式（4）所示：

1.3.6.3 羥自由基清除能力的測定

參照文獻[23]，在試管中依次加入10 mmol/L硫酸亞鐵溶液1.0 mL，樣品液1.0 mL，10 mmol/L雙氧水溶液2.0 mL，搖勻后靜置10 min，再加入10 mmol/L SA溶液1.0 mL，搖勻后于37 ℃水浴30 min，冷卻后4 000 r/min離心10 min，在510 nm波長處測定吸光度記為A1；以蒸餾水代替樣液，其他操作不變，測得吸光度記為A0；以無水乙醇代替SA溶液，其他操作不變，測得吸光度即為A2。羥自由基清除率計算如式（5）所示：

1.3.6.4 超氧陰離子自由基清除能力的測定

按照Marklund等[24]的方法測定粗毛纖孔菌醇提物的超氧陰離子自由基清除率，分別吸取1.0 mL樣液于試管中，加入4.0 mL pH 8.2的Tris-HCl緩沖溶液，搖勻后25 ℃水浴20 min，然后加入1.0 mL的60 mmol/L鄰苯三酚溶液搖勻并計時5 min，5 min后加入100 μL HCl溶液終止反應，于420 nm波長處測定吸光度記為A1；以蒸餾水代替樣液，其他操作不變，測得吸光度記為A0；蒸餾水代替鄰苯三酚溶液，其他操作不變，測得吸光度記為A2。超氧陰離子自由基清除率計算如式（6）所示：

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

2 結(jié)果與分析

2.1 誘導劑篩選結(jié)果

2.1.1 MeJA誘導粗毛纖孔菌三萜生物合成

MeJA是一種信號分子，能誘導許多植物生長及次級代謝產(chǎn)物的合成，因此本實驗研究不同濃度的MeJA在吐溫-80或吐溫-20助溶下對粗毛纖孔菌生長及三萜類化合物合成的影響，結(jié)果如表1所示。

從表1可以看出，MeJA加入時間、MeJA濃度和吐溫助劑的種類均對粗毛纖孔菌菌絲體的生長及三萜類化合物的合成具有顯著影響。隨著MeJA加入時間的延長，除加入吐溫-80和吐溫-20且MeJA濃度為150 μmol/L培養(yǎng)組的三萜含量變化不顯著外，其余培養(yǎng)組的粗毛纖孔菌菌絲體量、菌絲體中三萜含量及三萜總量均呈增加趨勢，可見在培養(yǎng)后期加入MeJA誘導劑有利于粗毛纖孔菌的生長和三萜的代謝合成，此結(jié)果與西洋參毛狀根發(fā)酵培養(yǎng)后期加入誘導劑有利于人參皂苷生物合成的結(jié)果一致[25]。但是隨著MeJA濃度增加，由于MeJA加入時間不同粗毛纖孔菌菌絲體量、菌絲體中三萜含量及三萜總量變化趨勢亦不相同，在第0天加入100 μmol/L MeJA的培養(yǎng)組顯著高于其他培養(yǎng)組（P＜0.05），而隨著MeJA加入時間延長至第6天時，加入50 μmol/L MeJA的培養(yǎng)組顯著高于其他培養(yǎng)組（P＜0.05），因此可以看出，在發(fā)酵后期添加MeJA時，其濃度的增加不利于粗毛纖孔菌生長及三萜的合成。此外，從表1還可以看出，隨著MeJA加入時間的延長，吐溫-20培養(yǎng)組的粗毛纖孔菌菌絲體量、菌絲體中三萜含量及三萜總量增加量顯著高于吐溫-80培養(yǎng)組，其中加入吐溫-80且MeJA濃度為50 μmol/L組從第0天加入MeJA到第6天加入MeJA，粗毛纖孔菌菌絲體量、菌絲體中三萜含量及三萜總量分別增加15.57%、10.27%、27.43%，而加入吐溫-20且MeJA濃度為50 μmol/L組從第0天加入MeJA到第6天加入MeJA，粗毛纖孔菌菌絲體量、菌絲體中三萜含量及三萜總量分別增加量28.94%、14.28%、47.36%，且第6天加入以吐溫-20為助溶劑的50 μmol/L的MeJA培養(yǎng)組與比空白對照組相比三萜總量提高了48.95%。可見MeJA誘導劑能夠有效促進粗毛纖孔菌菌絲體量、菌絲體中三萜含量及三萜總量的增加。而研究表明，MeJA能夠顯著促進鯊烯合成酶、鯊烯環(huán)氧酶 、氧化鯊烯環(huán)化酶、達瑪烷二醇合成酶、β-香樹脂合成酶基因的相對表達量，而這些酶都是三萜類化合物生物合成途徑中的關(guān)鍵酶[26]。因此后續(xù)實驗研究中進一步揭示MeJA對粗毛纖孔菌三萜合成途徑中哪種關(guān)鍵酶具有誘導表達作用。

表1 MeJA對粗毛纖孔菌菌絲體量及三萜量的影響Table 1 Effects of MeJA on mycelial volume and triterpenoids of I. hispidus

2.1.2 SA誘導粗毛纖孔菌三萜生物合成

SA是一種廣泛分布于植物體內(nèi)的酸類物質(zhì)，它不僅參與植物許多生理過程，還與植物抗病反應密切相關(guān)。SA對粗毛纖孔菌的誘導結(jié)果如表2所示。

由表2可知，在不同SA添加時間，粗毛纖孔菌的菌絲體量、菌絲體中三萜含量及三萜總產(chǎn)量均隨著SA質(zhì)量濃度的增加呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，當SA質(zhì)量濃度達到100 mg/L時，3 個指標值均最大（P＜0.05）。而在不同SA質(zhì)量濃度條件下，隨著SA添加時間的延長，粗毛纖孔菌的菌絲體量呈現(xiàn)增加趨勢，但是不顯著（P＞0.05），而粗毛纖孔菌菌絲體中三萜含量及三萜總量出現(xiàn)顯著下降趨勢（P＜0.05），這種現(xiàn)象說明SA可以促進粗毛纖孔菌發(fā)酵過程中菌絲體的生長，同時在發(fā)酵前期能夠參與誘導三萜類化合物的合成，而在發(fā)酵后期卻不利于粗毛纖孔菌三萜類化合物的合成，這與MeJA在粗毛纖孔菌發(fā)酵后期有利于誘導三萜類化合物合成的結(jié)果相反。目前關(guān)于SA誘導三萜類化合物機制研究表明，SA可提高苯丙氨酸裂解酶、過氧化氫酶和超氧化物歧化酶等抗氧化酶的活性，經(jīng)過酶促反應可生成H2O2，激活抗病途徑中的防御相關(guān)基因，進而刺激次生代謝物三萜的合成和積累[27]。通過本實驗的結(jié)果綜合分析表明，第0天添加100 mg/L SA誘導粗毛纖孔菌三萜類化合物效果最好，在此條件下三萜總量為313.518 mg/L，與對照組相比提高了96.88%。

2.1.3 油酸誘導粗毛纖孔菌三萜生物合成

油酸作為一種單不飽和脂肪酸，存在于動植物體內(nèi)，具有食用安全性，不僅可誘導刺激代謝產(chǎn)物合成，而且價格低廉，是一個良好的選擇。運用油酸對粗毛纖孔菌三萜進行誘導結(jié)果見表3。

表2 SA對粗毛纖孔菌菌絲體量及三萜量的影響Table 2 Effects of SA on mycelial biomass yield and triterpenoid production

表3 油酸對粗毛纖孔菌菌絲體量及三萜量的影響Table 3 Effects of oleic acid on mycelial biomass yield and triterpenoids production

根據(jù)表3可知，隨著添加油酸體積分數(shù)的增加，粗毛纖孔菌的菌絲體量、菌絲體中三萜含量及三萜總量均呈現(xiàn)先升高后下降趨勢，當添加油酸量達到3%時，3 個指標均為最大（P＜0.05），而后隨著油酸體積分數(shù)的增加菌絲體量及三萜含量逐漸下降，尤其加入高體積分數(shù)油酸（4%、5%）后，菌絲體量顯著低于對照組，這可能是由于過大濃度的油酸覆蓋在培養(yǎng)基的表面，減少了可溶性氧，從而抑制了菌絲體的正常生長[28]。而在不同油酸體積分數(shù)條件下，隨著油酸添加時間的延長，油酸對粗毛纖孔菌菌絲體及三萜的誘導合成效果顯著下降（P＜0.05），當加入時間延長至第6天時，僅2%、3%油酸具有誘導效果，可以推斷油酸誘導粗毛纖孔菌三萜的合成主要發(fā)生在菌絲體的生長前期。有研究發(fā)現(xiàn)，油酸可使SQS和CYP51這兩個三萜生物合成途徑中的關(guān)鍵酶基因表達量上調(diào)，從而使菌絲體胞內(nèi)三萜產(chǎn)量大幅度提高，另外油酸可抑制14α-LDM酶基因的表達，從而抑制麥角甾醇這一生成途徑，間接提高三萜產(chǎn)量[29]。由此推測油酸是通過調(diào)節(jié)三萜合成途徑中關(guān)鍵酶的表達量，進而促進三萜類化合物的生物合成。綜上，在第0天添加3%油酸誘導粗毛纖孔菌三萜類化合物效果最好，在此條件下三萜總量為402.870 mg/L，與對照組相比提高了143.74%。

2.1.4 水曲柳煎汁誘導粗毛纖孔菌三萜生物合成

真菌在自然生長環(huán)境中，需要從寄主組織中汲取特殊營養(yǎng)物質(zhì)，因此本實驗將粗毛纖孔菌的寄主植物水曲柳枝條的煎汁作為誘導劑，研究其對粗毛纖孔菌三萜的影響，結(jié)果見表4。

由表4可知，第0天時，加入不同質(zhì)量濃度水曲柳煎汁對粗毛纖孔菌的菌絲體量沒有顯著影響（P＞0.05），當質(zhì)量濃度達到500 mg/L抑制了菌絲體的生長，但隨著添加時間的延長，菌絲體量逐漸提高，當在第6天添加200～400 mg/L水曲柳煎汁時，實驗組與對照組相比，粗毛纖孔菌的菌絲體量有顯著提高（P＜0.05），尤其當添加水曲柳煎汁質(zhì)量濃度為300 mg/L時，菌絲體量達到最大值（6.397±0.020）g/L，與對照組相比提高了24.58%。隨著加入不同質(zhì)量濃度水曲柳煎汁時間的延長，粗毛纖孔菌菌絲體中三萜含量顯著提高（P＜0.05），但僅在第6天加入300～400 mg/L水曲柳煎汁時，實驗組三萜含量顯著高于對照組（P＜0.05），且在質(zhì)量濃度為300 mg/L時，三萜含量達到最大值（36.753±0.870）mg/g，高于對照組14.52%?？梢娫诎l(fā)酵后期加入水曲柳煎汁可以誘導粗毛纖孔菌菌絲體的生長及三萜類化合物的合成，經(jīng)過實驗結(jié)果表明，在發(fā)酵第6天加入300 mg/L水曲柳煎汁可得最大量粗毛纖孔菌三萜，為235.109 mg/L，與對照組相比提高了42.67%。由于目前對于水曲柳煎汁中所含物質(zhì)尚不明確，因此后續(xù)實驗研究中進一步揭示其如何對粗毛纖孔菌三萜進行誘導。

2.1.5 金屬離子誘導粗毛纖孔菌三萜生物合成2.1.5.1 Mn2+誘導粗毛纖孔菌三萜生物合成

Mn元素在液體深層發(fā)酵中參與過氧化物歧化酶的活動，也是磷酸烯醇式脫羧酶、檸檬酸合成酶的輔助因子[30]。所以選擇Mn2+對粗毛纖孔菌進行誘導培養(yǎng)，由表5可以發(fā)現(xiàn)，隨著Mn2+濃度的升高，粗毛纖孔菌菌絲體量及三萜含量均呈現(xiàn)先上升后下降趨勢，且均在4 μmol/L濃度條件下達到最大值，可知4 μmol/L濃度的Mn2+對粗毛纖孔菌菌絲體及菌絲體中三萜有較好的誘導作用。但不同的添加時間對粗毛纖孔菌的影響也存在差異；第3天加入4 μmol/L Mn2+的菌絲體量及三萜含量顯著高于第0、6天（P＜0.05），因此選擇此條件為最佳誘導條件，可得菌絲體量（5.967±0.010）g/L、三萜含量（36.963±0.111）mg/g、三萜總量220.558 mg/L，分別于對照組相比提高了16.67%、16.02%、35.36%。

表4 水曲柳煎汁對粗毛纖孔菌菌絲體量及三萜量的影響Table 4 Effects of willow branch decoction on mycelial biomass yield and triterpenoids production

表5 Mn2＋對粗毛纖孔菌菌絲體量及三萜量的影響Table 5 Effects of Mn2+ on mycelial biomass yield and triterpenoids production

表6 Fe2＋對粗毛纖孔菌菌絲體量及三萜量的影響Table 6 Effect of Fe2+ on mycelial biomass yield and triterpenoids production

表7 Cu2＋對粗毛纖孔菌菌絲體量及三萜量的影響Table 7 Effects of Cu2+ on mycelial biomass yield and triterpenoids production

2.1.5.2 Fe2+誘導粗毛纖孔菌三萜生物合成

由表6可知，F(xiàn)e2+對粗毛纖孔菌菌絲體內(nèi)三萜類化合物的合成沒有顯著誘導作用，甚至在10 μmol/L濃度下抑制了三萜類化合物的合成。但對于粗毛纖孔菌的菌絲體生長有一定促進作用，隨著Fe2+濃度的增加，菌絲體量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，當添加4～6 μmol/L Fe2+時菌絲體量有顯著提高（P＜0.05），超過8 μmol/L時又會顯著降低（P＜0.05），說明僅在一定濃度范圍內(nèi)的Fe2+會促進菌絲體的生長[31]。而隨著Fe2+添加時間的延長，這種誘導效果逐漸降低，在第6天添加4～6 μmol/L Fe2+對粗毛纖孔菌菌絲體并無顯著提高。綜上所述，在第0天添加6 μmol/L的Fe2+可最大程度促進菌絲體的生長，從而提高三萜總量，達到191.271 mg/L，較對照組提高了15.25%。

2.1.5.3 Cu2+誘導粗毛纖孔菌三萜生物合成的研究

由表7可知，隨著添加Cu2+濃度的提高，粗毛纖孔菌菌絲體量及三萜含量呈現(xiàn)先上升后下降趨勢，僅在第3、6天添加50 μmol/L和100 μmol/L Cu2+時菌絲體量有顯著提高（P＜0.05）。但不同濃度Cu2+對于粗毛纖孔菌菌絲體中三萜均有顯著的誘導效果（P＜0.05），且100 μmol/L Cu2+實驗組顯著高于其他濃度實驗組。而且隨著添加Cu2+時間的延長，三萜含量也有顯著變化，根據(jù)實驗數(shù)據(jù)可以發(fā)現(xiàn)，第3天添加Cu2+所得三萜含量顯著高于第0、6天添加Cu2+所得。綜上，在第3天添加100 μmol/L Cu2+可得最大粗毛纖孔菌三萜總量231.714 mg/L，與對照組相比提高了42.56%。有研究發(fā)現(xiàn)Cu2+可能誘導細胞形態(tài)發(fā)生變化，從而引起生理變化，最終影響三萜類化合物的合成[32]。

2.2 抗氧化活性分析

已有大量研究表明三萜類化合物具有較好的抗氧化活性，因此為考察粗毛纖孔菌絲體三萜類化合物的抗氧化能力，同時分析不同誘導劑對粗毛纖孔菌菌絲體合成的三萜類化合物抗氧化能力的影響，本實驗測定了粗毛纖孔菌菌絲體三萜類化合物的總還原力、DPPH自由基、羥自由基和超氧陰離子自由基清除能力等指標，并以VC為對照，結(jié)果如圖1所示。

圖1 不同誘導劑對粗毛纖孔菌三萜類化合物的抗氧化能力影響Fig. 1 Effect of different inducers on antioxidant capacity of triterpenoids from I. hispidus

從圖1可以看出，粗毛纖孔菌菌絲體三萜類化合物具有很好的體外抗氧化能力，并且與三萜類化合物濃度呈正相關(guān)。此外誘導劑能夠提高粗毛纖孔菌三萜類化合物的抗氧化能力，但不同誘導劑對粗毛纖孔菌三萜類化合物的抗氧化能力的影響存在差異。圖1A結(jié)果表明，油酸誘導的粗毛纖孔菌三萜類化合物總還原能力最大，在質(zhì)量濃度為3 mg/mL其值為1.342，是VC的1.10 倍，與未誘導粗毛纖孔菌三萜相比提高了79.48%。圖1B結(jié)果表明，當質(zhì)量濃度達到0.75、1.5 mg/mL和3 mg/mL時，7 種誘導劑誘導下的粗毛纖孔菌三萜類化合物以及VC對DPPH自由基清除能力最大，且3 個質(zhì)量濃度下差異不顯著（P＞0.05），但是都顯著高于未誘導的三萜類化合物，其中油酸誘導的三萜類化合物對DPPH自由基的IC50值為0.099 mg/mL，與VC的DPPH自由基清除力最為接近，與未誘導粗毛纖孔菌三萜相比DPPH自由基清除率提高了66.71%。圖1C結(jié)果表明，油酸誘導的粗毛纖孔菌三萜類化合物對羥自由基清除能力均高于未誘導和其他6 種誘導劑誘導的粗毛纖孔菌三萜類化合物對羥自由基清除能力，但是顯著低于VC，油酸誘導的粗毛纖孔菌三萜類化合物對羥自由基清除能力的IC50值為1.294 mg/mL，與未誘導粗毛纖孔菌三萜相比羥自由基清除率提高了28.10%。圖1D結(jié)果表明，由MeJA和油酸誘導的粗毛纖孔菌三萜類化合物對超氧陰離子自由基清除能力的IC50值分別為0.004 mg/mL和0.001 mg/mL，與VC相比差異性不顯著，但是顯著高于其他誘導劑，與未誘導粗毛纖孔菌三萜相比超氧陰離子自由基清除率提高了29.22%。從抗氧化結(jié)果分析可以看出，經(jīng)過油酸和MeJA誘導能夠提高粗毛纖孔菌三萜類化合物的抗氧化能力，說明經(jīng)過不同誘導劑誘導合成的三萜類化合物成分不同，經(jīng)過誘導劑誘導后三萜類化合物抗氧化能力提高，說明可能增加了有利于抗氧化的三萜類成分或誘導合成了更多具有抗氧化能力的官能團，可以進一步通過對不同誘導劑誘導合成的粗毛纖孔菌三萜類化合物的成分析實驗中進行驗證。

3 結(jié) 論

本實驗表明，MeJA、SA、油酸、水曲柳煎汁、Mn2+、Fe2+和Cu2+7 種誘導劑均能提高粗毛纖孔菌菌絲體產(chǎn)量及三萜含量，其中在第0天添加3%油酸可得到最佳誘導效果，即402.870 mg（1 L培養(yǎng)液）的粗毛纖孔菌三萜類化合物，較對照組提高了143.74%?？寡趸芰嶒灡砻?，7 種誘導劑均能提高粗毛纖孔菌三萜類化合物的抗氧化能力，其中油酸效果最顯著，其次是MeJA和SA。但關(guān)于誘導劑能夠提高粗毛纖孔菌三萜類化合物產(chǎn)量及抗氧化能力的機理尚不明確，還需要進一步實驗研究。本研究為提高粗毛纖孔菌三萜類化合物的產(chǎn)量以及開發(fā)新的抗氧化劑資源提供科學理論依據(jù)。