董玉瑋，周 潔，苗敬芝，李 文，胡傳銀

（1.徐州工程學(xué)院食品（生物）工程學(xué)院，江蘇 徐州 221018；2.徐州天馬敬安食品有限公司，江蘇 徐州 221636）

牛蒡（Arctium lappa L.）俗稱(chēng)東洋參，為菊科兩年生草本植物，主要分布于北歐、西伯利亞和中國(guó)東北地區(qū)，我國(guó)江蘇徐州和山東地區(qū)種植歷史最為悠久。牛蒡的根莖粗大肥碩，含有豐富的粗纖維，含量位居地下根莖類(lèi)蔬菜中之首，同時(shí)富含蛋白質(zhì)[1]、多糖[2]、纖維素[3]、黃酮苷[4]等營(yíng)養(yǎng)成分，是藥食兩用健康食品，已在新型、功能型深加工產(chǎn)品、制藥、保健品等方面形成了較多研究成果[5-7]。

長(zhǎng)勢(shì)好、品質(zhì)佳的牛蒡一般作為出口、生產(chǎn)深加工產(chǎn)品的原料，但也有部分品質(zhì)較低的牛蒡被丟棄，無(wú)法再利用，造成浪費(fèi)和生產(chǎn)企業(yè)的損失。導(dǎo)致這一現(xiàn)象的主要原因是牛蒡本身，以及作為廢棄物的牛蒡根皮、葉等，由于含有大量纖維素，難以再利用。提高低品質(zhì)牛蒡的利用效率，最大化挖掘并提升牛蒡廢棄物的價(jià)值，將有利于提高企業(yè)生產(chǎn)效益。微生物尤其是一些藥食真菌，比如營(yíng)養(yǎng)、保健價(jià)值較高的靈芝、猴頭菇、金針菇等，具有分解、利用纖維素的能力[8]，同時(shí)牛蒡根中含有的蛋白質(zhì)、維生素、礦物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)成分[2]也可作為藥食真菌生長(zhǎng)的原料，如果以牛蒡作為營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)固體發(fā)酵藥食真菌，則提高了牛蒡、藥食真菌的利用價(jià)值，對(duì)促進(jìn)牛蒡產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

真菌中的靈芝是一種藥食同源的健康滋補(bǔ)食品，分類(lèi)隸屬于擔(dān)子菌門(mén)、擔(dān)子菌綱、多孔菌目、多孔菌科、靈芝屬，富含萜類(lèi)、糖類(lèi)、蛋白質(zhì)以及多種氨基酸，其中多糖和三萜類(lèi)含量是衡量靈芝品質(zhì)的重要標(biāo)準(zhǔn)，在抗炎[9]、抗氧化[10]、抗腫瘤[11-12]、降血糖[13]等方面功效突出。固體發(fā)酵靈芝一般以木屑、棉籽殼、麥麩、石膏等作為培養(yǎng)基，如能采用低品質(zhì)牛蒡固體發(fā)酵靈芝，將大大提高牛蒡的利用率，同時(shí)節(jié)約靈芝固體發(fā)酵的成本，有利于牛蒡、靈芝的合理利用以及精深加工產(chǎn)業(yè)發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌種靈芝購(gòu)自徐州市銅山縣食用菌科技開(kāi)發(fā)服務(wù)中心，經(jīng)本實(shí)驗(yàn)室鑒定為多孔菌科靈芝（Ganoderma lucidum (Leyss. ex. Fr.) Karst）。經(jīng)誘變選育后，具有高產(chǎn)多糖的性能，保存于本實(shí)驗(yàn)室；牛蒡由徐州天馬敬安食品有限公司提供，品質(zhì)低于出口標(biāo)準(zhǔn)。

固體發(fā)酵培養(yǎng)基：牛蒡洗凈，去皮后切成小塊，粉碎機(jī)粉碎過(guò)篩后，按比例加水配制。

乙腈（色譜純）、單糖標(biāo)準(zhǔn)品（鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、巖藻糖、半乳糖） 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；葡萄糖、瓊脂粉、三氟乙酸、乙醇、氯仿、正丁醇、硫酸、苯酚等菌種培養(yǎng)、多糖提取和純化所用試劑（均為分析純） 南京晚晴化玻儀器有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

FA21040電子天平 北京精密儀器公司；IXQ-SG46-280A手提式壓力蒸汽滅菌鍋 德州市新恩精密糧儀有限公司：FSD-101A電動(dòng)粉碎機(jī) 上海博訊有限公司；250D恒溫光照培養(yǎng)箱 常州國(guó)華電器有限公司；GZ202-2電熱恒溫干燥箱 上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司；DL-5低速大容量離心機(jī) 上海安亭儀器廠；7230G可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司；Nicolet iS5傅里葉變換紅外光譜儀 上海力晶科學(xué)儀器有限公司；1260液相色譜儀 美國(guó)安捷倫科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 靈芝菌種的活化

馬鈴薯葡萄糖瓊脂斜面培養(yǎng)基：按照GB 4789.15—2010《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn) 霉菌和酵母計(jì)數(shù)》配制，用于菌種的活化及保存。

菌種活化：取靈芝菌株接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂斜面培養(yǎng)基上活化1～2 次。

1.3.2 單因素試驗(yàn)

采用牛蒡固體發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵靈芝，考察液固比、裝瓶量、粉碎程度對(duì)固體發(fā)酵靈芝菌絲多糖含量的影響，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次取平均值。

1.3.2.1 液固比的選擇

粉碎后的牛蒡過(guò)8 目篩后，以0.2 g/mL裝瓶量（每毫升培養(yǎng)瓶加入牛蒡質(zhì)量）將牛蒡裝入100 mL培養(yǎng)瓶中，按照液固比（每克牛蒡加入蒸餾水體積）為0、0.2、0.4、0.6、0.8 mL/g配制固體培養(yǎng)基，無(wú)菌接種，封口膜封口，黑暗條件下28 ℃固體發(fā)酵培養(yǎng)15～25 d至菌絲長(zhǎng)滿(mǎn)培養(yǎng)基，將菌質(zhì)于50 ℃烘干后粉碎，過(guò)60 目篩。

1.3.2.2 裝瓶量的選擇

粉碎后的牛蒡過(guò)8 目篩后，按照0.1、0.15、0.2、0.25、0.3 g/mL的裝瓶量，在100 mL培養(yǎng)瓶中裝入牛蒡，以液固比0.6 mL/g配制固體培養(yǎng)基，無(wú)菌接種，封口膜封口，黑暗條件下28 ℃固體發(fā)酵培養(yǎng)15～25 d至菌絲長(zhǎng)滿(mǎn)培養(yǎng)基，將菌質(zhì)于50 ℃烘干后粉碎，過(guò)60 目篩。

1.3.2.3 粉碎程度的選擇

粉碎后的牛蒡分別過(guò)4、6、8、10、12 目篩，以0.2 g/mL裝瓶量將牛蒡裝入100 mL培養(yǎng)瓶中，以液固比0.6 mL/g配制固體培養(yǎng)基，無(wú)菌接種，封口膜封口，黑暗條件下28 ℃固體發(fā)酵培養(yǎng)15～25 d至菌絲長(zhǎng)滿(mǎn)培養(yǎng)基，將菌質(zhì)于50 ℃烘干后粉碎，過(guò)60 目篩。

1.3.3 牛蒡固體發(fā)酵靈芝響應(yīng)面工藝優(yōu)化

根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，采用Design-Expert 8.06試驗(yàn)設(shè)計(jì)軟件對(duì)牛蒡固體發(fā)酵靈芝工藝進(jìn)行優(yōu)化，設(shè)計(jì)3因素3水平響應(yīng)面試驗(yàn)，因素和水平見(jiàn)表1。

表1 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平Table 1 Factors and levels used for Box-Behnken design

1.3.4 菌絲多糖的提取與檢測(cè)

提取多糖使用水提醇沉法：將靈芝菌絲烘干粉碎，稱(chēng)5 g于燒杯中，加入50 mL水混勻，60 ℃水浴1.5 h，4 000 r/min離心5 min，過(guò)濾取沉淀，重復(fù)提取3 次，合并提取液，置于60 ℃烘箱中濃縮至原體積1/5，濃縮液加入5 倍體積95%乙醇溶液，溶解過(guò)夜。4 000 r/min離心10 min，過(guò)濾取沉淀為粗多糖，60 ℃烘箱烘干，加入10～50 mL水充分溶解。測(cè)定多糖含量采用苯酚-硫酸法，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算每克干菌絲中粗多糖的含量。

1.3.5 粗多糖的純化

1.3.5.1 脫蛋白、透析

采用Sevag法對(duì)粗多糖進(jìn)行脫蛋白處理。按氯仿-正丁醇體積比4∶1配制Sevag試劑，粗多糖溶液置于分液漏斗中，加入1/5溶液體積的Sevag試劑，振蕩20 min，4 000 r/min離心10 min得上清液，繼續(xù)重復(fù)上次操作，直至氯仿層與正丁醇層之間沒(méi)有乳白色變性蛋白質(zhì)析出為止，合并上清液，倒入截流相對(duì)分子質(zhì)量為6 000～8 000的半透膜袋中，蒸餾水透析48 h，期間每2 h更換一次水。

1.3.5.2 脫色

取透析后的多糖配制成5 mg/mL的溶液50 mL，加入30% H2O21 mL，50 ℃保溫脫色3 h，直至色值不再降低，濃縮后凍干得多糖純品。

1.3.6 紅外光譜分析

將純化后的多糖，與KBr粉末混合，置于瑪瑙研缽中，研磨均勻，經(jīng)壓片機(jī)壓片后，紅外光譜上機(jī)掃描，波數(shù)4 000～400 cm－1，分辨率位8 cm－1，掃描次數(shù)64。采用Omnic 8.2分析軟件采集紅外光譜圖。

1.3.7 單糖組成分析

1.3.7.1 酸水解

稱(chēng)取凍干的多糖樣品2 mg，加入2 mol/L三氟乙酸溶液0.5 mL，在120 ℃條件下水解120 min。氮吹儀吹干。

標(biāo)準(zhǔn)品處理：配制10 mg/mL單糖標(biāo)準(zhǔn)品，放置于－20 ℃。用時(shí)取出融化，在密封的玻璃管中加入上述單糖標(biāo)準(zhǔn)品各5 μL，混勻。再加入2 mol/L三氟乙酸溶液0.5 mL，與樣品同時(shí)在120 ℃條件下水解120 min?？諝獗么蹈?。

1.3.7.2 PMP衍生化

向水解干燥后得到的單糖樣品中加入溶于無(wú)水甲醇的0.5 mol/L的1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone，PMP）試劑和0.3 mol/L的NaOH溶液各0.5 mL，充分混勻后，水浴70 ℃反應(yīng)30 min。冷卻至室溫，加入0.3 mol/L HCl溶液0.5 mL，充分混勻。加入0.5 mL氯仿，充分振蕩萃取，5 000 r/min離心5 min去除氯仿層，共萃取3 次。0.22 μm濾膜過(guò)濾后，待上機(jī)。

1.3.7.3 高效液相色譜分析

色譜柱：SHISEIDO C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動(dòng)相為0.1 mol/L pH 7.0磷酸鹽緩沖液-乙腈（82∶18，V/V）；流速1.0 mL/min；柱溫25 ℃；進(jìn)樣量10 μL，波長(zhǎng)245 nm。

1.3.8 菌質(zhì)多糖抗氧化活性測(cè)定

1.3.8.1 清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-trinitrophenylhydrazine，DPPH）自由基能力的測(cè)定[14]

對(duì)DPPH自由基清除率進(jìn)行測(cè)定，空白對(duì)照用蒸餾水代替樣品，以VC作為陽(yáng)性對(duì)照。DPPH自由基清除率計(jì)算如式（1）所示：

式中：Ac為對(duì)照組吸光度；Ai為樣品組吸光度；Aj為空白組吸光度。

1.3.8.2 清除超氧陰離子自由基能力的測(cè)定[15]

采用鄰苯三酚自氧化法進(jìn)行測(cè)定，空白對(duì)照用蒸餾水代替樣品，以VC作為陽(yáng)性對(duì)照，采用式（1）計(jì)算清除率。

1.3.8.3 清除羥自由基能力的測(cè)定[16]

采用鄰二氮菲比色法進(jìn)行測(cè)定，空白對(duì)照用蒸餾水代替樣品，以VC作為陽(yáng)性對(duì)照。羥自由基清除率計(jì)算如式（2）所示：

式中：A1為樣品組的吸光度；A2為樣品參比的吸光度；A3為損傷管的吸光度；A4為未損傷管的吸光度；A0為空白對(duì)照組的吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 液固比的選擇

圖1 液固比對(duì)牛蒡發(fā)酵靈芝工藝的影響Fig. 1 Effect of liquid-to-solid ratio on mycelial polysaccharide production by G. lucidum

由圖1可知，菌絲多糖含量在液固比0～0.8 mL/g范圍內(nèi)先增加后減少，在液固比為0.4 mL/g時(shí)多糖含量達(dá)到最高，為24.21 mg/g。

2.1.2 裝瓶量的選擇

圖2 裝瓶量對(duì)牛蒡發(fā)酵靈芝工藝的影響Fig. 2 Effect of medium-to-culture fl ask ratio on mycelial polysaccharide production by G. lucidum

由圖2可知，菌絲多糖含量在裝瓶量0.1～0.3 g/mL范圍內(nèi)先增加后減少，在裝瓶量為0.2 g/mL時(shí)多糖含量達(dá)到最高，為24.33 mg/g。

2.1.3 粉碎程度的選擇

圖3 粉碎程度對(duì)牛蒡發(fā)酵靈芝工藝的影響Fig. 3 Effects of degree of comminution on mycelial polysaccharide production by G. lucidum

由圖3可知，菌絲多糖含量在牛蒡粉碎后過(guò)4～12 目篩范圍內(nèi)先增加后減少，當(dāng)粉碎后過(guò)8 目篩，多糖含量達(dá)到最高，為23.05 mg/g。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果

根據(jù)響應(yīng)面試驗(yàn)制定詳細(xì)的分析方案，試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Experimental design with predicted and observed results for response surface analysis

2.3 回歸模型的建立和檢驗(yàn)

對(duì)液固比（X1）、裝瓶量（X2）和粉碎程度（X3）3 個(gè)單因素進(jìn)行回歸擬合，得出多糖含量（Y）回歸方程：

表3 回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance of regression model

經(jīng)響應(yīng)面軟件分析，預(yù)測(cè)模型標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.19，平均值22.68，變異系數(shù)0.83，預(yù)測(cè)殘差平方和3.05，如表3所示，此模型的擬合程度較好，決定系數(shù)R2為0.993 9，P＜0.01，為極顯著水平，說(shuō)明該方程與實(shí)際情況相符，具有可靠性。失擬項(xiàng)P值大于0.05，不顯著。液固比、裝瓶量、粉碎程度的P值都小于0.01，對(duì)多糖含量都有極顯著影響。液固比和裝瓶量?jī)蓛山换プ饔脤?duì)多糖含量的影響不顯著，液固比和粉碎程度、裝瓶量和粉碎程度兩兩交互作用對(duì)多糖含量有顯著影響。

2.4 響應(yīng)面分析

圖4 各因素交互作用響應(yīng)面和等高線(xiàn)圖Fig. 4 Response surface and contour plots showing the interactive effects of factors

由圖4可知，交互影響作用大小排序?yàn)椋阂汗瘫扰c粉碎程度＞裝瓶量與粉碎程度＞液固比與裝瓶量。3因素對(duì)多糖含量的影響大小依次為：粉碎程度＞裝瓶量＞液固比?；貧w模型確定的最佳發(fā)酵工藝為液固比0.39 mL/g、裝瓶量0.19 g/mL、粉碎程度6 目，預(yù)測(cè)得到的多糖含量最高為24.93 mg/g。對(duì)此優(yōu)化條件進(jìn)行驗(yàn)證，考慮實(shí)際操作，選擇液固比0.4 mL/g、裝瓶量0.2 g/mL、粉碎程度6目條件下進(jìn)行3 次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，提取的多糖平均含量為24.85 mg/g，和預(yù)期結(jié)果基本相符，回歸模型的預(yù)測(cè)性能較好，可用于優(yōu)化牛蒡固體發(fā)酵靈芝工藝。

2.5 菌絲多糖紅外光譜檢測(cè)結(jié)果

圖5 牛蒡固體發(fā)酵靈芝菌絲多糖紅外光譜檢測(cè)圖Fig. 5 Infrared spectrum of mycelial polysaccharide from G. lucidum

從圖5可知，牛蒡固體發(fā)酵靈芝菌絲多糖具有典型的多糖特征吸收峰，3 343 cm－1處有強(qiáng)的—OH伸縮振動(dòng)吸收峰，2 930 cm－1處有強(qiáng)的—CH3、—CH2、—CH等的—CH伸縮振動(dòng)吸收峰，1 714 cm－1和1 633 cm－1處為羧基和酰胺基的振動(dòng)吸收峰，1 416 cm－1有—CH變角振動(dòng)吸收峰，1 329 cm－1和1 270 cm－1分別為—OH和—CH的變角振動(dòng)吸收峰，1 217 cm－1處有—COOH中—OH變角振動(dòng)吸收峰，1 158 cm－1和1 127 cm－1有吡喃糖環(huán)醚鍵中的C—O伸縮振動(dòng)，1 029 cm－1處的則是醇羥基的變角振動(dòng)吸收峰，935 cm－1處為吡喃型糖環(huán)特征吸收峰，988 cm－1和875 cm－1處存在β-型糖苷鍵的振動(dòng)吸收峰，875 cm－1和818 cm－1處是甘露糖的振動(dòng)吸收峰。

2.6 單糖組成分析

圖6 單糖標(biāo)準(zhǔn)品的PMP柱前衍生高效液相色譜Fig. 6 HPLC profiles of monosaccharide standards with PMP pre-column derivatization

結(jié)合圖6、7結(jié)果，經(jīng)計(jì)算，每100 g牛蒡固體發(fā)酵靈芝菌絲多糖中，單糖組成主要為5.01 g甘露糖、0.67 g鼠李糖、0.66 g葡萄糖、1.54 g半乳糖、0.58 g木糖、1.27 g阿拉伯糖和0.22 g巖藻糖。

圖7 牛蒡固體發(fā)酵靈芝菌絲多糖的PMP柱前衍生高效液相色譜Fig. 7 HPLC profiles of mycelial polysaccharide from G. lucidum with PMP pre-column derivatization

2.7 體外抗氧化活性分析

2.7.1 清除DPPH自由基的能力

圖8 菌絲多糖和VC對(duì)DPPH自由基的清除效果Fig. 8 Scavenging effects of mycelial polysaccharide from G. lucidum and VC on DPPH radical

由圖8可知，菌絲多糖對(duì)DPPH自由基清除效果明顯，在0～1 mg/mL范圍內(nèi)呈現(xiàn)量效關(guān)系，當(dāng)菌絲多糖質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL時(shí)，清除率已經(jīng)達(dá)到69.34%，說(shuō)明菌絲多糖對(duì)DPPH自由基具有較好的清除能力。

2.7.2 清除超氧陰離子自由基的能力

圖9 菌絲多糖和VC對(duì)超氧陰離子自由基的清除效果Fig. 9 Scavenging effects of mycelial polysaccharide from G. lucidum and VC on superoxide anion radical

由圖9可知，菌絲多糖對(duì)超氧陰離子自由基清除效果明顯，在0～1 mg/mL范圍內(nèi)呈現(xiàn)量效關(guān)系，當(dāng)菌絲多糖質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL時(shí)，清除率已經(jīng)達(dá)到65.78%，說(shuō)明菌絲多糖對(duì)超氧陰離子自由基具有較好的清除能力。

2.7.3 清除羥自由基的能力

圖10 菌絲多糖和VC對(duì)羥自由基的清除效果Fig. 10 Scavenging effects of mycelial polysaccharide from G. lucidum and VC on hydroxyl radical

由圖10可知，菌絲多糖對(duì)羥自由基清除效果明顯，在0～1 mg/mL范圍內(nèi)呈現(xiàn)量效關(guān)系，當(dāng)菌絲多糖質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL時(shí)，清除率已經(jīng)達(dá)到66%，說(shuō)明菌絲多糖對(duì)羥自由基具有較好的清除能力。

3 討 論

3.1 牛蒡固體發(fā)酵靈芝工藝的優(yōu)勢(shì)

3.1.1 固體發(fā)酵工藝的優(yōu)勢(shì)

本研究所選擇的固體發(fā)酵工藝，其培養(yǎng)基為固態(tài)且缺少以連續(xù)相存在的水，相對(duì)于液體發(fā)酵工藝，設(shè)備簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)、能耗低，技術(shù)成本不高，后續(xù)處理過(guò)程也較為簡(jiǎn)便，易于產(chǎn)業(yè)化推廣。同時(shí)由于固體發(fā)酵環(huán)境與大部分真菌在自然狀態(tài)下的生長(zhǎng)環(huán)境更為接近，因此也更有利于發(fā)酵活性產(chǎn)物的積累，而液體發(fā)酵由于含水量增加，會(huì)影響菌種的生理代謝過(guò)程，進(jìn)而影響活性物質(zhì)的組成與活性。例如盛悅等[17]對(duì)比了猴頭菌液體、固體發(fā)酵產(chǎn)物多糖抗氧化活性后發(fā)現(xiàn)，固體發(fā)酵產(chǎn)物多糖抗氧化活性略?xún)?yōu)于液體發(fā)酵；段金柱等[18]對(duì)比了固體發(fā)酵與液體發(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶的產(chǎn)率與催化性能，固體發(fā)酵在產(chǎn)量、質(zhì)量和大規(guī)模生產(chǎn)方面均優(yōu)于液體發(fā)酵。

3.1.2 以牛蒡?yàn)榕囵B(yǎng)基固體發(fā)酵的優(yōu)勢(shì)

品質(zhì)較低的牛蒡粗細(xì)不均、易彎曲易折斷、口感差，在傳統(tǒng)牛蒡加工過(guò)程中，不但不能作為出口原料，甚至?xí)蛔鳛閺U棄物處理，無(wú)法再利用，造成極大浪費(fèi)。由于牛蒡中木質(zhì)素、纖維素含量較高，并含有多糖、維生素、氨基酸等成分，為靈芝等藥食真菌固體發(fā)酵提供了適宜的營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)。采用低品質(zhì)牛蒡固體發(fā)酵靈芝，菌絲生長(zhǎng)速度、菌絲多糖含量與傳統(tǒng)固體發(fā)酵無(wú)明顯差異，工藝簡(jiǎn)單，可操作性強(qiáng)，不需額外添加化學(xué)試劑，既節(jié)省了原料和成本，又合理利用了牛蒡。目前本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)利用低品質(zhì)牛蒡，成功液體發(fā)酵了毛木耳、茶新菇、平菇，固體發(fā)酵了茶薪菇、金針菇、杏鮑菇等多個(gè)品種食用菌，顯示出牛蒡在液體、固體發(fā)酵藥食真菌中具有普遍的規(guī)律性和適用性，相關(guān)工藝技術(shù)已在藥食真菌發(fā)酵、牛蒡綜合利用、植物-藥食真菌復(fù)合型飲料制備方面開(kāi)展了系列應(yīng)用，符合現(xiàn)代綠色、高效農(nóng)業(yè)的理念，具有很好的推廣前景。

3.1.3 牛蒡固體發(fā)酵靈芝多糖產(chǎn)量的優(yōu)勢(shì)

對(duì)比采用木屑培養(yǎng)基[19]，其組成為（質(zhì)量百分比）木屑85%、麥麩12%、黃豆粉2%、石膏粉1%，液固比為1.5 mL/g，28 ℃固體發(fā)酵靈芝12 d后，測(cè)定多糖含量為（8.71±1.29） mg/g。付銘等[20]采用大米為基質(zhì)，固體發(fā)酵靈芝；生東明等[21]采用麩皮、蔗糖為培養(yǎng)基，固體發(fā)酵靈芝；周小蘋(píng)等[22]采用麥芽汁和茶葉固體發(fā)酵靈芝，均測(cè)定了菌絲體多糖含量。本研究在最佳工藝條件下牛蒡固體發(fā)酵靈芝后，多糖含量為24.85 mg/g，經(jīng)比較后可知，高于木屑培養(yǎng)基和生東明等[21]的測(cè)定結(jié)果，但是低于付銘[20]、周小蘋(píng)[22]等的研究結(jié)果，說(shuō)明牛蒡固體發(fā)酵靈芝，多糖產(chǎn)量適中，適合進(jìn)一步產(chǎn)業(yè)化推廣。

3.2 牛蒡固體發(fā)酵靈芝菌絲多糖中單糖組分特點(diǎn)

于華崢[23]、黃靜涵[24]等及馮勝平[25]曾對(duì)靈芝多糖中單糖組成進(jìn)行過(guò)研究，Carlotto等[26]曾對(duì)牛蒡多糖中單糖組成進(jìn)行過(guò)分析，經(jīng)對(duì)比后發(fā)現(xiàn)，牛蒡固體發(fā)酵靈芝菌質(zhì)多糖中單糖種類(lèi)和數(shù)量未超出已報(bào)道的，但是各單糖所占比例則有所差異。Ai-Lati等[27]研究發(fā)現(xiàn)靈芝多糖由葡萄糖、甘露糖、半乳糖組成，其中葡萄糖占比最高，為92.33%；鄭一美等[28]報(bào)道牛蒡多糖中單糖由果糖、阿拉伯糖、葡萄糖和半乳糖組成，其中果糖含量最大，達(dá)到9.35%。本研究所獲得的牛蒡固體發(fā)酵靈芝菌絲多糖，經(jīng)紅外光譜分析可知，在400～4 000 cm－1范圍，具有糖類(lèi)的特征吸收峰；經(jīng)液相色譜分析發(fā)現(xiàn)，其單糖組成中甘露糖占比最高，為50.35%，是葡萄糖的7.6 倍，未檢測(cè)出果糖成分。含量上的差異可能意味著靈芝重新分解與合成了牛蒡中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，使得多糖中單糖組成比例發(fā)生了較大變化。甘露糖作為目前被用于臨床上的一種糖質(zhì)營(yíng)養(yǎng)素，能直接被利用合成糖蛋白，參與免疫調(diào)節(jié)，具有調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的作用，提示本實(shí)驗(yàn)所制備的牛蒡固體發(fā)酵靈芝菌質(zhì)多糖具有較好的優(yōu)勢(shì)和進(jìn)一步利用的前景。

3.3 牛蒡固體發(fā)酵靈芝菌絲多糖的抗氧化能力

Tian Xing等[29]研究發(fā)現(xiàn)，牛蒡提取物能夠減少脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物丙二醛的產(chǎn)生，防止活性氧的生成，具有較強(qiáng)的自由基清除能力，對(duì)過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷有保護(hù)作用；靈芝水提物和靈芝多糖也具備清除DPPH自由基、羥自由基和超氧陰離子自由基的能力[30-32]。本研究發(fā)現(xiàn)，牛蒡固體發(fā)酵靈芝菌質(zhì)多糖也具有相似的抗氧化能力。在質(zhì)量濃度大于0.5 mg/mL時(shí)，菌質(zhì)多糖表現(xiàn)出對(duì)3 種自由基都有較好的清除作用，且隨質(zhì)量濃度增大而增大。說(shuō)明牛蒡固體發(fā)酵靈芝菌質(zhì)多糖具有一定的還原能力，通過(guò)發(fā)生氧化還原反應(yīng)，DPPH自由基、超氧陰離子自由基被還原，同時(shí)菌質(zhì)多糖碳?xì)滏溕系臍湓幽苎杆倥c羥自由基結(jié)合成水，多糖的碳原子上留下一個(gè)成單電子，成為碳自由基，經(jīng)進(jìn)一步氧化形成過(guò)氧自由基，最后分解成對(duì)機(jī)體無(wú)害的產(chǎn)物，達(dá)到對(duì)3 種自由基清除的作用。

4 結(jié) 論

通過(guò)響應(yīng)面設(shè)計(jì)優(yōu)化提取工藝，得出最佳方案為液固比0.4 g/mL、裝瓶量0.2 g/mL、粉碎程度6 目，在此條件下，多糖含量的最大值為24.85 mg/g。紅外光譜掃描結(jié)果表明，牛蒡固體發(fā)酵靈芝菌絲多糖具有糖類(lèi)的特征吸收峰，單糖間連接方式以β-糖苷鍵為主。高效液相色譜檢測(cè)菌質(zhì)多糖單糖組成為甘露糖、核糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖等，其中甘露糖含量最高，為50.35%，是葡萄糖的7.6 倍。體外抗氧化性檢測(cè)表明，牛蒡固體發(fā)酵靈芝菌絲多糖對(duì)DPPH自由基、超氧陰離子自由基和羥自由基都具有清除能力，清除率均大于70%，說(shuō)明多糖具有較好的體外抗氧化活性。