高兆建，許 祥，王先鳳，蘆 寧，王旭東，張鐵柱，張抗震，焦 巍

（1.徐州工程學(xué)院食品（生物）工程學(xué)院，江蘇 徐州 221018； 2.江蘇天中牧業(yè)股份有限公司，江蘇 徐州 221018；3.江蘇太合食品有限公司，江蘇 徐州 221018；4.邳州市金大地 肥料有限公司，江蘇 徐州 221100）

阿魏酸酯酶（EC 3.1.1.73）是羧酸酯酶的一個(gè)亞類(lèi)，能水解植物細(xì)胞壁中阿魏酸或酚酸與多糖之間的酯鍵[1]，使植物細(xì)胞壁容易釋放出阿魏酸和多糖[2]。根據(jù)阿魏酸酯酶蛋白質(zhì)初級(jí)結(jié)構(gòu)的特征以及對(duì)4 種羥基化肉桂酸甲酯模式底物阿魏酸甲酯、咖啡酸甲酯、p-香豆酸甲酯和芥子酸甲酯的專(zhuān)一性，阿魏酸酯酶分為A、B、C和D 4 種類(lèi)型[3]。到目前為止，4 種類(lèi)型的阿魏酸酯酶已經(jīng)從黑曲霉中分離鑒定[4-5]，且研究發(fā)現(xiàn)其與內(nèi)切木聚糖酶協(xié)同作用，促進(jìn)了木質(zhì)素的降解并增加阿魏酸的釋放量[5]。木質(zhì)素中阿魏酸酯鍵交聯(lián)結(jié)構(gòu)能極大強(qiáng)化生物質(zhì)的牢固性和對(duì)酶解的抵抗性，阿魏酸酯酶則可解聚多糖鏈和去木質(zhì)化[5]。因此，阿魏酸酯酶作為釋放阿魏酸和促進(jìn)生物質(zhì)降解的一種關(guān)鍵酶，近年來(lái)備受關(guān)注。

阿魏酸酯酶可顯著提高小麥麩皮、玉米芯、玉米糠、草木質(zhì)纖維素材料的生物降解性能[6]，因此可以作為動(dòng)物飼料添加劑加到飼料中提高飼料利用率[7]。在紙漿和造紙工業(yè)中，將阿魏酸酯酶和木聚糖酶以及其他木聚糖降解酶聯(lián)合用于生物制漿和生物漂白的紙漿，酶可部分破壞和松開(kāi)細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，隨后木質(zhì)素-碳水化合物復(fù)合物將更易受到酶的作用，其降解產(chǎn)物更容易被低濃度堿溶解和擴(kuò)散[4]。在漂白階段木質(zhì)素的可萃取性增強(qiáng)，可以降低氯的消耗量，同時(shí)可以提高紙漿的亮度[8]。此外，阿魏酸酯酶在將可再生纖維素材料轉(zhuǎn)化為乙醇燃料方面也發(fā)揮了重要作用[9]。阿魏酸酯酶降解生物質(zhì)釋放出的阿魏酸有抗菌消炎、防止血小板凝集形成血栓、抗腫瘤、增強(qiáng)機(jī)體免疫、抗癌和抗高血壓等功能，是一種無(wú)處不在的羥基肉桂酸衍生物[10]。阿魏酸還可以用作抗氧化劑，已經(jīng)證明它在體外有接近過(guò)氧硝酸鹽和氧化低密度低脂蛋白活性[11]。阿魏酸和多糖在半纖維素網(wǎng)絡(luò)中通過(guò)酯鍵形結(jié)合，通過(guò)形成醚鍵和木質(zhì)素鍵合[12]，利用這些作用阿魏酸可以提高植物細(xì)胞壁的硬度和強(qiáng)度[13]。所以，從植物細(xì)胞壁中釋放的阿魏酸不僅有利于生物質(zhì)的降解[14]，對(duì)醫(yī)藥和食品行業(yè)也有一定潛在的應(yīng)用價(jià)值[15]。由于阿魏酸對(duì)健康的有益作用[10]，有些食品行業(yè)正在通過(guò)添加阿魏酸強(qiáng)化食品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。

迄今為止，已經(jīng)從多種微生物中分離純化出了30多種阿魏酸酯酶，其中許多來(lái)自真菌，如泡盛曲霉[16]、黃曲霉[17]、黑曲霉[18]、互隔交鏈格孢霉[19]等，但也有細(xì)菌的報(bào)道如發(fā)酵乳桿菌[20]。在大多數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道中，阿魏酸酯酶在堿性條件下用于纖維素材料的降解，且大多數(shù)報(bào)道的阿魏酸酯酶在中性或堿性條件下活性高[4]。然而許多飼料在加工時(shí)處于酸性條件，且動(dòng)物胃也為酸性條件，已報(bào)道的阿魏酸酯酶活性會(huì)受到抑制。雖然已經(jīng)從細(xì)菌和真菌生產(chǎn)出了許多類(lèi)型的阿魏酸酯酶，但它們的商業(yè)化應(yīng)用受到低催化活性和昂貴成本的限制[21]。為此，越來(lái)越多的研究者投身于尋找性能更為優(yōu)良的阿魏酸酯酶。這些應(yīng)用領(lǐng)域需要不同類(lèi)型的阿魏酸酯酶適應(yīng)pH值、溫度、穩(wěn)定性或其他一些特征的變化。

針對(duì)這些問(wèn)題，實(shí)驗(yàn)室從深綠木霉XS6的發(fā)酵液中提取到了一種深綠木霉阿魏酸酯酶（Trichoderma atroatroviride feruloyl esterase，TaFAE）。該酶的酸堿穩(wěn)定性強(qiáng)、酸性環(huán)境下活性高，在食品和飼料行業(yè)應(yīng)用前景廣闊。本實(shí)驗(yàn)是從保藏菌株中分離出阿魏酸酯酶，并研究其酶學(xué)性質(zhì)。本實(shí)驗(yàn)旨在為后續(xù)研究提供理論基礎(chǔ)，擴(kuò)大阿魏酸酯酶在生產(chǎn)實(shí)踐中的應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

深綠木霉（Trichoderma atroatroviride）XS6，本實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.2 試劑

阿魏酸甲酯、阿魏酸乙酯、阿魏酸乙酯、對(duì)香豆酸甲酯、芥子酸甲酯、咖啡酸甲酯、對(duì)羥基肉桂酸甲酯美國(guó)Sigma公司；N,N-二甲基甲酰胺、考馬斯亮藍(lán)G-250、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、丙烯酰胺、(NH4)2SO4、甲叉雙丙烯酰胺、牛血清蛋白 生工生物工程（上海）股份有限公司；DEAE-Cellulose DE52、Sephadex G-200 瑞典Pharmacia公司；蛋白分子質(zhì)量Marker 日本TaKaRa公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

KTA Explorer 100/Explorer 10型蛋白質(zhì)純化系統(tǒng)美國(guó)G E公司；2-D E l e c t r o p h o r e s i s電泳系統(tǒng)美國(guó)Hoefer公司；3K30型臺(tái)式冷凍離心機(jī) 德國(guó)Sigma公司；1100 series高效液相色譜儀 美國(guó)Agilent公司；CascadaTMAN型超純水系統(tǒng) 美國(guó)Pall公司；UV-2450紫外-可見(jiàn)光分光光度計(jì) 日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 粗酶液的制備

將菌株接種于PDA平板，28 ℃培養(yǎng)4～5 d。切取1 cm2菌苔接種于PDA種子培養(yǎng)基，28 ℃、150 r/min培養(yǎng)3～4 d，以10%的接種量接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基，30 ℃、180 r/min 培養(yǎng)6 d。將得到的發(fā)酵液12 000 r/min離心10 min，收集上清液即粗酶液。

發(fā)酵培養(yǎng)基配方：2 g/100 mL蔗糖，1 g/100 mL酵母提取物，0.5% NH4H2PO4，0.2% NaNO3，0.2% KH2PO4，0.1% NaCl，0.05% MgSO4·7H2O；pH 5.5。

1.3.2 酶的分離純化

1.3.2.1 (NH4)2SO4分級(jí)沉淀

在取得的粗酶液中加入固體(NH4)2SO4至飽和度為40%，在4 ℃過(guò)夜，12 000 r/min離心10 min后，取上清液加入固體(NH4)2SO4至飽和度為75%，4 ℃過(guò)夜，12 000 r/min離心10 min，收集沉淀。沉淀在10 mmol/L、pH 6.0的磷酸緩沖液中充分透析，除去雜鹽離子，然后用超濾管對(duì)酶液進(jìn)行濃縮。

1.3.2.2 離子交換層析

將上述蛋白溶液選用DEAE-Cellulose DE52陰離子色譜交換柱進(jìn)行分離，緩沖液選用20 mmol/L、pH 6.0磷酸緩沖溶液，流速為1.0 mL/min。超濾脫鹽后的粗酶液上樣至充分平衡后的離子交換層析柱，先用平衡緩沖液洗脫柱子至蛋白吸收線走平，再用含NaCl濃度為0～1.0 mol/L的相同緩沖液線性梯度洗脫，流速為1.5 mL/min。測(cè)定波長(zhǎng)280 nm處紫外吸光度，并檢測(cè)收集管酶活性。

1.3.2.3 分子篩凝膠過(guò)濾層析

收集有酶活性的收集管，進(jìn)行超濾濃縮。上樣于Sephadex G-200分子篩凝膠柱并洗脫，流動(dòng)相為20 mmol/L、pH 6.0的磷酸緩沖液，流速0.8 mL/min。分別測(cè)定各收集管酶活性并收集有活性部分，用于酶純度和酶學(xué)性質(zhì)檢測(cè)。

1.3.3 酶活性檢測(cè)

通過(guò)分析從阿魏酸甲酯釋放的游離阿魏酸測(cè)定TaFAE活性。方法參照文獻(xiàn)[21]略作改動(dòng)：40 ℃條件下，在含有1 mmol/L阿魏酸甲酯的50 mmol/L Na2HPO4-檸檬酸緩沖溶液（pH 4.0）中反應(yīng)20 min，然后通過(guò)高效液相色譜[22]分析釋放的游離阿魏酸。每分鐘酯解阿魏酸甲酯生成1 μmol阿魏酸所需酶量定義為1 個(gè)酶活性單位。

1.3.4 蛋白含量測(cè)定

采用Bradford法[23]，用牛血清白蛋白制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)蛋白進(jìn)行定量。

1.3.5 蛋白質(zhì)分子質(zhì)量測(cè)定

用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）對(duì)該酶進(jìn)行純度鑒定，分離膠為12%，濃縮膠為5%，電壓120 V，以低分子質(zhì)量蛋白質(zhì)Marker為標(biāo)準(zhǔn)，考馬斯亮藍(lán)R-250染色。

1.3.6 酶學(xué)性質(zhì)分析

1.3.6.1 溫度對(duì)TaFAE活性和穩(wěn)定性的影響

酶液在50 mmol/L的Na2HPO4-檸檬酸緩沖溶液（pH 4.0）中適當(dāng)稀釋?zhuān)?0～70 ℃反應(yīng)20 min，測(cè)定酶活性，確定酶的最適反應(yīng)溫度。將酶分別置于不同溫度（30、40、50、60、70 ℃）下保溫4 h，每隔40 min檢測(cè)1 次酶活性，以未經(jīng)過(guò)熱保溫的酶液為空白對(duì)照，檢測(cè)酶的熱穩(wěn)定性。

1.3.6.2 pH值對(duì)TaFAE活性和穩(wěn)定性的影響

使用不同pH值的50 mmol/L緩沖液（pH 2.0～3.0的甘氨酸-鹽酸緩沖溶液、pH 3.0～6.0的醋酸-醋酸鈉緩沖液、pH 6.0～7.5的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液、pH 8.0～8.5的Tris-HCl緩沖液、pH 9.0～11.0的甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液），于40 ℃測(cè)定酶活性，以酶活性最高者為100%，計(jì)算相對(duì)酶活性，以研究TaFAE酶促反應(yīng)最適pH值。將酶液分別置于不同緩沖體系構(gòu)成的不同pH值（2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0）條件下，于30 ℃放置4 h后測(cè)定剩余酶活性，以酶活性最高者為100%，計(jì)算相對(duì)酶活性，以研究TaFAE的pH值穩(wěn)定性。

1.3.6.3 金屬離子及各試劑對(duì)酶活性的影響

TaFAE酶液在最佳pH值條件下的大體積緩沖液中透析24 h除去酶液中的內(nèi)源金屬離子。用蒸餾水配制金屬溶液，反應(yīng)體系中金屬離子K+、Na+、Ca2+、Mg2+、Zn2+、Mn2+、Cu2+、Fe2+、Hg2+、Ba2+、Pb2+、Co2+濃度分別1 mmol/L和5 mmol/L，然后測(cè)定反應(yīng)體系添加金屬離子后TaFAE活性，以未添加金屬離子反應(yīng)體系測(cè)得酶活性為100%，計(jì)算相對(duì)酶活性。

將純化后的酶液與不同濃度的乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）、β-巰基乙醇、二硫蘇糖醇、碘乙酰胺、SDS、Tween 80、苯甲基磺酰氟、二甲基亞砜、Trition X-100、甲醇、乙醇等試劑一起孵育1 h，按照標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定殘余酶活性。分析各化學(xué)試劑對(duì)TaFAE活性的影響，以不加任何試劑的酶活性為100%，測(cè)定不同試劑下的相對(duì)酶活性。

1.3.7 TaFAE的底物特異性及動(dòng)力學(xué)分析

在40 ℃和pH 4.0條件下，測(cè)定TaFAE對(duì)不同底物的反應(yīng)初速度，各底物濃度范圍為0.1～8 mmol/L。通過(guò)高效液相色譜檢測(cè)產(chǎn)物濃度。用Lineweaver-Burk作圖法：1/V-1/[S]作圖，得到動(dòng)力學(xué)曲線，得到TaFAE的Km、Vmax。TaFAE底物包括：阿魏酸甲酯、對(duì)香豆酸甲酯、咖啡酸甲酯、芥子酸甲酯、阿魏酸乙酯和對(duì)羥基肉桂酸甲酯。

1.3.8 TaFAE作用于脫淀粉麩皮釋放阿魏酸的功能

以去淀粉后的粉碎過(guò)篩小麥麩皮為原料，參照文獻(xiàn)[7]堿法提取麩皮中的總阿魏酸。以堿法提取的阿魏酸量為100%參照，判斷TaFAE酶解釋放阿魏酸量。向1 mL 20 mmol/L的Na2HPO4-檸檬酸緩沖液（pH 4.0）中，分別加入20 mg預(yù)處理后的麩皮及2 U純化后的TaFAE。為分析木聚糖酶與TaFAE協(xié)同水解麩皮釋放阿魏酸的作用，另取第2支離心管在以上添加體系的基礎(chǔ)上再加入4 U木聚糖酶。再取第3支離心管加入相同緩沖溶液和底物，再僅加入4 U的木聚糖酶。以體系中不加任何酶為空白對(duì)照。以上離心管均于40 ℃搖床中孵育12 h，沸水中10 min滅活酶，10 000 r/min離心10 min，取上清液高效液相色譜法檢測(cè)阿魏酸量。

1.3.9 TaFAE在生物質(zhì)降解中的應(yīng)用

以粉碎后過(guò)100 目篩的玉米芯、玉米秸稈、脫淀粉小麥麩皮為底物，以水解后產(chǎn)物葡萄糖為測(cè)定指標(biāo)，分析TaFAE及其與木聚糖酶協(xié)同降解生物質(zhì)的作用。具體測(cè)定方法按照文獻(xiàn)[17]，略有改動(dòng)。反應(yīng)體系為：20 mmol/L的Na2HPO4-檸檬酸緩沖液（pH 4.0）6 mL，反應(yīng)底物1 g，2 mg木聚糖酶和2 mg TaFAE，補(bǔ)充去離子水至10 mL。對(duì)照的反應(yīng)體系不加TaFAE，其他相同。在溫度40 ℃、轉(zhuǎn)速100 r/min搖床中，反應(yīng)2 h，3,5-二硝基水楊酸法測(cè)定水解產(chǎn)物葡萄糖含量。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用Microsoft Excel進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析并作圖，結(jié)果用 ±s表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 TaFAE的分離純化

將經(jīng)過(guò)(NH4)2SO4鹽析、透析6 h除鹽后的粗酶液上樣DEAE-Cellulose DE52弱陰離子交換柱，緩沖溶液充分洗脫，去除未結(jié)合的雜蛋白，然后改用線性NaCl濃度對(duì)蛋白進(jìn)行梯度洗脫，得到多個(gè)較大洗脫峰。如圖1所示，將收集管進(jìn)行酶活性檢測(cè)，活性主要分布在40～52號(hào)收集管，對(duì)應(yīng)NaCl洗脫濃度0.5～0.7 mol/L。合并有活性的收集管測(cè)定蛋白濃度和酶活性并進(jìn)一步純化。

圖1 DEAE-Cellulose DE52陰離子交換層析洗脫曲線Fig. 1 Chromatographic profile of protein by DEAE-cellulose DE52

圖2 Sephadex G-200凝膠柱洗脫曲線Fig. 2 Chromatographic profile of protein by Sephadex G-200

離子交換層析后的收集樣超濾濃縮后上樣Sephadex G-200色譜柱，洗脫曲線見(jiàn)圖2，樣品溶液分離后得到了3 個(gè)獨(dú)立的洗脫峰，說(shuō)明TaFAE與其他蛋白有較好分離。對(duì)收集管進(jìn)行酶活性測(cè)定發(fā)現(xiàn)，18～24號(hào)收集管表現(xiàn)出了很強(qiáng)的TaFAE活性，這與2號(hào)蛋白峰完全對(duì)應(yīng)，表明TaFAE集中在峰2。經(jīng)過(guò)分子篩凝膠過(guò)濾層析后，酶比活力顯著增加至134.3 U/mg，純化倍數(shù)31.52，回收率為28.9%，各步純化情況如表1所示。

表1 深綠木霉XS6 TaFAE各步純化情況Table 1 Summary of the purification steps of TaFAE

2.2 TaFAE純度和分子質(zhì)量的測(cè)定

從圖3可以看出，只經(jīng)過(guò)(NH4)2SO4鹽析后的酶液有許多條蛋白條帶，說(shuō)明雜蛋白含量多；再經(jīng)過(guò)離子交換層析后得到的條帶明顯減少，共9 條帶，蛋白質(zhì)得到了較好的純化；最后經(jīng)過(guò)凝膠過(guò)濾層析后只得到1 條帶，說(shuō)明得到了純的TaFAE。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)蛋白的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算出TaFAE的分子質(zhì)量為66.4 kDa。

圖3 TaFAE純化過(guò)程的SDS-PAGE圖譜Fig. 3 SDS-PAGE pattern of proteins during the puri fication of TaFAE

2.3 溫度對(duì)TaFAE活性的影響

圖4 TaFAE的最適反應(yīng)溫度Fig. 4 Optimal temperature of TaFAE

從圖4可以看出，TaFAE的最適反應(yīng)溫度為40 ℃，在30～45 ℃范圍內(nèi)TaFAE均能保持90%以上的活性，當(dāng)溫度超過(guò)50 ℃時(shí)酶活性下降較快。在實(shí)驗(yàn)時(shí)間內(nèi)，30～40 ℃條件下，該酶始終保持85%以上活性；在60～70 ℃時(shí)，實(shí)驗(yàn)時(shí)間內(nèi)，酶幾乎已完全失活。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明TaFAE的最適作用條件為30～40 ℃。

圖5 溫度對(duì)TaFAE穩(wěn)定性的影響Fig. 5 Effects of temperature on stability of TaFAE

如圖5所示，酶在50 ℃孵育120 min后，相對(duì)活性仍可維持在80%以上，60 ℃孵育80 min后，相對(duì)活性在75%以上。而在70 ℃僅孵育40 min，相對(duì)酶活性就降至20%以下。30 ℃或40 ℃孵育200 min，酶活性都能保持90%以上。

2.4 pH值對(duì)TaFAE活性及穩(wěn)定性的影響

圖6 TaFAE的最適pH值及其pH值穩(wěn)定性Fig. 6 Optimal pH and pH stability of TaFAE

從圖6可以看出，TaFAE活性在pH 3.0～7.0內(nèi)略有起伏但均能保持80%以上，最適pH值在4.0。pH值大于7.0時(shí)酶活性急劇下降，在pH 8.0，酶活性驟降至40%，pH值為11.0時(shí)酶幾乎失活。這說(shuō)明堿性條件不利于TaFAE的催化降解反應(yīng)，而中酸性條件酶活性都非常高。

pH值在2.0～9.0內(nèi)，該酶能保持80%以上活性；pH值大于9.0時(shí)酶活性劇烈下降，pH 11.0時(shí)，TaFAE幾乎失活。由此可見(jiàn)TaFAE能夠在較為寬廣的pH值范圍內(nèi)保持穩(wěn)定，特別是在酸性條件下耐受力更強(qiáng)，在極堿性條件下酶活性穩(wěn)定性變差。

2.5 金屬離子及化學(xué)試劑對(duì)TaFAE活性的影響

表2 各種金屬離子對(duì)TaFAE活性的影響Table 2 Effect of various metal ions on TaFAE activity

如表2所示，Ca2+和Mg2+對(duì)酶活 性有較強(qiáng)的促進(jìn)作用，其中Mg2+的促進(jìn)效果最明顯，在1 mmol/L時(shí)達(dá)到107%，隨著Mg2+濃度升高酶活性增強(qiáng)，濃度在5 mmol/L時(shí)，TaFAE相對(duì)活力達(dá)到118.7%；Hg2+和Pb2+有強(qiáng)烈的抑制作用，在高濃度下可以使酶完全失活；Zn2+、Co2+、Cu2+、Fe2+在低濃度時(shí)對(duì)酶活性有輕微的抑制作用，但當(dāng)濃度升高時(shí)，對(duì)酶活性的抑制作用增強(qiáng)；而Mn2+和Ba2+高濃度時(shí)幾乎沒(méi)有抑制作用；其余金屬離子對(duì)酶活性的影響不大，說(shuō)明TaFAE與大多數(shù)離子有良好的配伍性能。

表3 試劑對(duì)TaFAE活性的影響Table 3 Effect of various reagents on TaFAE activity

由表3可知，SDS對(duì)酶活性具有明顯的促進(jìn)作用，相對(duì)酶活性達(dá)到115%；β-巰基乙醇僅次于SDS，相對(duì)酶活性達(dá)到了112%；另外，二硫蘇糖醇和Trition X-100對(duì)酶活性也具有促進(jìn)作用。說(shuō)明硫醇基團(tuán)對(duì)酶的穩(wěn)定性有促進(jìn)作用。苯甲基磺酰氟對(duì)酶活性抑制較明顯，將TaFAE的活性降到原來(lái)的一半，達(dá)到55.6%；碘乙酰胺也有一定的抑制作用，酶活性降到81.7%；其余試劑對(duì)酶活性影響不大，均能保持90%以上酶活性。

2.6 TaFAE底物特異性及動(dòng)力學(xué)分析

表4 純化后的TaFAE底物特異性分析Table 4 Substrate specificity of purified TaFAE

動(dòng)力學(xué)反應(yīng)參數(shù)-米氏常數(shù)（Km）是酶催化反應(yīng)速度達(dá)到最大反應(yīng)速度一半時(shí)底物的濃度。按照米氏方程，采用Lineweaver-Burk作圖法，測(cè)定不同底物（阿魏酸甲酯、對(duì)香豆酸甲酯、咖啡酸甲酯、芥子酸甲酯、阿魏酸乙酯、對(duì)羥基肉桂酸甲酯）的動(dòng)力學(xué)曲線，求出各種底物Km、Vmax。從表4可以看出，TaFAE對(duì)阿魏酸甲酯的親和性最高，芥子酸甲酯次之，對(duì)對(duì)羥基肉桂酸甲酯親和性最小，對(duì)咖啡酸甲酯無(wú)活性。從最大酶促反應(yīng)速率來(lái)看，以芥子酸甲酯為底物時(shí)反應(yīng)速率最大，為32.21 μmol/（min·mg），約是阿魏酸甲酯的2 倍，阿魏酸乙酯的3.3倍，對(duì)羥基肉桂酸甲酯的23 倍。以對(duì)香豆酸甲酯為底物時(shí)的反應(yīng)速率次于芥子酸甲酯，達(dá)到25.98 μmol/（min·mg）。說(shuō)明該酶具有嚴(yán)格的底物特異性。

2.7 TaFAE作用于脫淀粉麩皮釋放阿魏酸的功能

圖7 TaFAE水解麩皮釋放阿魏酸Fig. 7 Release of ferulic acid from wheat bran by TaFAE

如圖7所示，隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，TaFAE和木聚糖酶共同作用產(chǎn)生阿魏酸的量是TaFAE單獨(dú)水解麩皮產(chǎn)生阿魏酸的2 倍以上，這說(shuō)明，TaFAE和木聚糖酶在水解麩皮釋放阿魏酸上具有良好的協(xié)同作用，能夠促進(jìn)阿魏酸的生成。

2.8 TaFAE在生物質(zhì)降解中的應(yīng)用

以不同底物檢測(cè)TaFAE的降解作用，結(jié)果如圖8所示。以玉米芯為底物，不加TaFAE時(shí)，還原糖產(chǎn)量為0.52 g/L，加入TaFAE時(shí)產(chǎn)量達(dá)到0.79 g/L。同樣，在以玉米秸稈和小麥麩皮為底物時(shí)，還原糖產(chǎn)量分別增加了0.2 g/L和0.4 g/L，產(chǎn)量增加了1 倍。再次說(shuō)明TaFAE和木聚糖酶具有良好的協(xié)同作用。

圖8 TaFAE對(duì)生物質(zhì)的水解作用Fig. 8 Synergistic hydrolysis of biomass by TaFAE and xylanase

3 討 論

本研究從深綠木霉中提取出TaFAE，粗酶液經(jīng)過(guò)系列純化后，得到電泳純的TaFAE，利用SDS-PAGE檢測(cè)其分子質(zhì)量約為66.4 kDa，同其他多種來(lái)源的阿魏酸酯酶相接近，如來(lái)源于紅汁乳菇（Lactarius hatsudake）（55 kDa）[7]、尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）（62 kDa）[10]、柄籃狀菌（Talaromyces stipitatus）（69 kDa）[10]。但遠(yuǎn)大于隱球菌屬（Cryptococcus sp. S-2）（34 kDa）[24]、米曲酶（Aspergillus oryzae）（30 kDa）[25]、黃曲霉（Aspergillus flavus）（40 kDa）[26]、Fusarium oxysporum（31 kDa）[27]等來(lái)源的阿魏酸酯酶分子質(zhì)量。真菌產(chǎn)TaFAE的分子質(zhì)量一般在30～70 kDa之間，少數(shù)可達(dá)210 kDa和11 kDa[28-29]。本研究獲得的TaFAE的分子質(zhì)量在以上區(qū)間內(nèi)，但沒(méi)有發(fā)現(xiàn)分子質(zhì)量相同的阿魏酸酯酶報(bào)道。

本研究純化的TaFAE最適反應(yīng)溫度為40 ℃，與Chandrasekharaiah等[30]報(bào)道的40 ℃相一致，而且與多種來(lái)源的相接近，Levasseur等[18]從重組表達(dá)的FA E溫度為40～55 ℃，Vafiadi等[31]報(bào)道的嗜熱孢子菌所產(chǎn)酶最適溫度為45 ℃。此溫度靠近動(dòng)物消化道溫度，能夠更好地促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，因此該酶比較適合作為飼料添加劑。

本實(shí)驗(yàn)所得的酶的最適pH值為4.0，在pH 3.0～9.0范圍內(nèi)具有很高酶活性。最適pH值遠(yuǎn)小于其他報(bào)道過(guò)的TaFAE，比如Wang Xiaomei等[15]在解淀粉芽孢桿菌分離出的酶最適pH值為8.0，Yao Jian等[32]從土壤宏基因組篩到的阿魏酸酯酶最適pH 7.0，從串珠鐮刀菌（Fusarium proliferatum） NRRL 26517[1]分離出的阿魏酸酯酶最適pH值為6.5～7.5，方園等[33]從泡盛曲霉分離出的酶最適pH值為6.0，對(duì)比以往報(bào)道的阿魏酸酯酶，pH值大 都在接近中性或偏堿性[34]，還鮮見(jiàn)在酸性達(dá)到pH 4.0時(shí)還能具有最強(qiáng)活性的阿魏酸酯酶的報(bào)道。本研究的TaFAE不僅在非常酸的環(huán)境下保持高活性，而且能夠在pH 2.0～9.0的廣泛酸堿范圍內(nèi)保持穩(wěn)定性，4 h酶活性都保持在80%以上。TaFAE在高酸環(huán)境的強(qiáng)催化活性，是該酶的突出酶學(xué)特性優(yōu)勢(shì)，使其更能勝任在酸性較低的苛刻環(huán)境下工作。另外，TaFAE還保持了中性偏堿性條件下酶活性的穩(wěn)定性，在溫度適宜的條件下，該酶在食品、飼料和造紙等方面會(huì)有更廣泛的使用。

經(jīng)過(guò)離子濃度影響的測(cè)定后發(fā)現(xiàn)，Ca2+和Mg2+對(duì)酶活性有強(qiáng)烈的促進(jìn)作用，嚴(yán)重抑制酶活性的常用金屬離子并不多，說(shuō)明該酶具有很好的配伍性。從不同化學(xué)試劑對(duì)酶活性影響的結(jié)果來(lái)看，TaFAE不僅對(duì)表面活性劑SDS和Trition X-100表現(xiàn)出強(qiáng)的耐受性，反而酶活性得到顯著激活，表明TaFAE可以在洗滌劑中使用。還原劑β-巰基乙醇和二硫蘇糖醇也增強(qiáng)TaFAE的活性，說(shuō)明TaFAE中存在巰基，以上還原劑同巰基結(jié)合能夠改變到酶的立體結(jié)構(gòu)，從而促進(jìn)酶活性。

對(duì)該酶底物特異性研究表明，TaFAE對(duì)阿魏酸甲酯、阿魏酸乙酯及芥子酸甲酯等多種底物均具有較高催化活力，說(shuō)明TaFAE能夠打斷多種聚合多糖結(jié)構(gòu)的交叉支鏈結(jié)構(gòu)，這對(duì)從纖維素、半纖維素等多聚物中分離木質(zhì)素轉(zhuǎn)化可發(fā)酵糖具有特別重要的意義。以木聚糖含量高的農(nóng)副產(chǎn)物為底物，檢測(cè)TaFAE的降解作用顯示，無(wú)論是水解麩皮產(chǎn)生阿魏酸還是在不同底物下產(chǎn)還原糖，TaFAE與木聚糖酶共同作用下，產(chǎn)生的阿魏酸和還原糖的量均比只用一種酶作用時(shí)的產(chǎn)量高，說(shuō)明TaFAE和木聚糖酶在水解底物方面有良好的協(xié)同作用，TaFAE對(duì)多聚糖側(cè)鏈的降解更有助于木聚糖酶對(duì)木聚糖主鏈的降解作用。Zhang Shuaibing等[26]報(bào)道源于黃曲霉（Aspergillus flavus）基因重組表達(dá)的阿魏酸酯酶同木聚糖酶協(xié)同作用降解汽爆玉米秸稈阿魏酸產(chǎn)量達(dá)到42 μmol/L，高于木聚糖酶單獨(dú)作用13 倍；Gao Le等[4]報(bào)道將阿魏酸酯酶同纖維素酶共同對(duì)玉米芯粉、小麥麩皮和木薯酒糟渣降解，還原糖產(chǎn)量比纖維素酶單獨(dú)作用分別提高了38.6%、15.6%和20.0%；Koseki等[35]將米曲酶（A. oryzae）中的阿魏酸酯酶基因在畢赤酵母中重組表達(dá)，重組酶當(dāng)同木聚糖酶共同作用于小麥阿拉伯糖基木聚糖時(shí)，阿魏酸產(chǎn)量高于木聚糖酶單獨(dú)作用的3.1 倍。本研究的TaFAE在協(xié)同降解特性方面同報(bào)道的相類(lèi)似，因此在食品、飼料等工業(yè)中，TaFAE可以和其他多種多聚糖糖酶協(xié)同作用，促進(jìn)多聚糖的降解。

4 結(jié) 論

本研究從野生菌株深綠木霉XS6中純化出阿魏酸酯酶，與基因工程菌株重組得到的阿魏酸酯酶相比更易為消費(fèi)者所接受。通過(guò)對(duì)TaFAE酶學(xué)特性研究發(fā)現(xiàn)，與以往文獻(xiàn)報(bào)道的阿魏酸酯酶有較大區(qū)別，在多方面有創(chuàng)新特性。TaFAE的突出特點(diǎn)是能夠在非常酸的環(huán)境下保持高穩(wěn)定性和活性，為特定環(huán)境下的酶的需求提供了更好的來(lái)源。另外，TaFAE在較高的溫度下保持了較好的穩(wěn)定性，60 ℃維持80 min，相對(duì)活性在75%以上。在金屬離子、表面活性劑、還原劑等作用下以及底物降解特異性等方面TaFAE也表現(xiàn)出了優(yōu)良的酶學(xué)特性。因此，本研究的TaFAE有潛力在食品、飼料、生物燃料、紡織、造紙、醫(yī)藥等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。