趙建華，李浩霞，尹 躍，王亞軍，李彥龍，樊云芳，安 巍，曹有龍

（1.寧夏農(nóng)林科學(xué)院枸杞工程技術(shù)研究所，國家枸杞工程技術(shù)研究中心，寧夏 銀川 750002；2.寧夏農(nóng)林科學(xué)院荒漠化治理研究所，寧夏 銀川 750002）

木糖異構(gòu)酶（EC 5.3.1.5）在生物體內(nèi)的糖代謝過程中發(fā)揮著重要的作用[1-2]，主要參與醛糖對酮糖的轉(zhuǎn)化，尤其是木糖對木糖的轉(zhuǎn)化；也參與D-葡萄糖轉(zhuǎn)化為D-果糖的異構(gòu)化反應(yīng)。木糖異構(gòu)酶與蛋白酶、淀粉酶等同為重要的工業(yè)用酶，具有極其重要的價(jià)值[3-5]。在細(xì)菌和一些厭氧型真菌中，木糖異構(gòu)酶能直接將木糖轉(zhuǎn)化為木酮糖，不產(chǎn)生副產(chǎn)物，有利于乙醇的生產(chǎn)[6-8]。近年來，隨著生物能源產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，利用木糖異構(gòu)酶構(gòu)建發(fā)酵半纖維素水解產(chǎn)物木糖生產(chǎn)乙醇的重組菌成為研究熱點(diǎn)[9-10]。研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥的木糖異構(gòu)酶能夠在釀酒酵母中表達(dá)活性，且活性可達(dá)到0.51 U/mg[4]，提高了釀酒酵母利用木糖發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的能力；Kristo等[11]成功克隆出大麥的木糖異構(gòu)酶全基因序列4 473 個(gè)核苷酸，含有20 個(gè)內(nèi)含子，編碼的蛋白為二聚體。此外，木糖異構(gòu)酶基因xylA還作為一種正向選擇標(biāo)記基因，該標(biāo)記可以獲得安全的轉(zhuǎn)基因植物[12]。Haldrup等[13]研究以D-木糖為唯一碳源培養(yǎng)基篩選轉(zhuǎn)化的馬鈴薯、煙草和西紅柿等植物細(xì)胞，成功獲得了轉(zhuǎn)基因植株；郭新梅等[14]利用木糖異構(gòu)酶為篩選標(biāo)記，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因玉米的再生植株在木糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%～100%時(shí)，篩選效果較好，但不同基因型的玉米對應(yīng)的最佳篩選濃度存在差異。迄今為止，已在細(xì)菌、真菌和放線菌等多種微生物中以及植物中鑒定出木糖異構(gòu)酶[15-16]，在Swiss-Prot/TrEMBL數(shù)據(jù)庫中已經(jīng)公布了來源于近百種微生物木糖異構(gòu)酶的氨基酸序列[17-18]。

目前，從植物中分離出xylA較少，頓寶慶等[4]分離出擬南芥的xylA，為改善酵母利用木糖提供了新的可用的木糖異構(gòu)酶。枸杞果實(shí)含有豐富糖類物質(zhì)，主要糖為果糖、葡萄和蔗糖[19]，成熟果也含有一定量木糖[20-21]。有關(guān)枸杞木糖異構(gòu)酶基因（Lycium barbarum Linn. xylose isomerase，LbxylA）的克隆表達(dá)研究尚鮮見報(bào)道。本研究以‘寧杞1號’枸杞果實(shí)為材料，基于枸杞果實(shí)轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)，從枸杞果實(shí)中克隆LbxylA的cDNA全長，誘導(dǎo)重組質(zhì)粒pGEX4T-1-LbxylA在大腸桿菌中表達(dá)，并對得到LbxylA融合蛋白進(jìn)行多克隆抗體制備，有助闡明該基因在果實(shí)糖積累過程中作用機(jī)理，為進(jìn)一步改善枸杞果實(shí)品質(zhì)及轉(zhuǎn)基因植株標(biāo)記選取提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試枸杞品種為‘寧杞1號’（15 a生），采自國家枸杞種質(zhì)資源圃（38°380′N，106°9′E，海拔1 100 m），于‘寧杞1號’幼果期（開花后約9 d）、青果期（開花后約15 d）、色變期（開花后約22 d）、初熟期（開花后約29 d）和成熟期（開花后約36 d）分別采樣，選取果粒大小均勻、果色一致的無病蟲害果實(shí)，用液氮迅速凍結(jié)后，運(yùn)送回實(shí)驗(yàn)室后立即放置于－80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

DH5α、Rosetta（DE3）、pGEX4T-1均由本實(shí)驗(yàn)室保存；Trizol試劑盒、質(zhì)粒小量提取試劑盒、NI Crystarose FF天根生化科技（北京）有限公司；逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）試劑盒 美國Thermo Fisher公司；KOD FX Neo酶 日本Toyobo公司；pMD18-T、限制性內(nèi)切酶 德國TaKaRa公司；SYBR Green Master Mix美國Bio-Rad公司；異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropylβ-D-thiogalactoside，IPTG）、二硫蘇糖醇（DL-dithiothreitol，DTT）、乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、溴酚蘭、考馬斯亮蘭R-250、丙烯酰胺、雙丙烯酰胺、四甲基乙二胺（N,N,N’,N’-tetramethylethylenediamine，TEMED）、過硫酸銨德國Amresco公司；辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記山羊抗兔IgG和四甲基聯(lián)苯胺（tetramethylbenzidine，TMB）顯色液、BeyoECL Star kit顯色試劑盒 上海碧云天生物技術(shù)有限公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

GL-20C高速冷凍離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；ProFlex系列PCR儀 美國ABI公司；CFX Connect?熒光定量PCR檢測系統(tǒng)、ChemiDoc?XRS+凝膠成像系統(tǒng)、iMARK酶標(biāo)儀 美國Bio-Rad公司；DYY-6C型電泳儀北京市六一儀器廠；SM-650A超聲波細(xì)胞破碎儀 南京舜瑪儀器設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1LbxylA全長的克隆

采用Trizol試劑盒提取枸杞果實(shí)的總RNA，用RT-PCR試劑盒對提取的總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得單鏈cDNA?；谵D(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)，獲得unigene編號為TR29089|c0_g1的表達(dá)序列標(biāo)簽（expressed sequence tags，EST）序列（數(shù)據(jù)未發(fā)表），利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)全長引物L(fēng)bxylA-F和LbxylA-R（表1）。反應(yīng)體系為：2×PCR Buffer 25 μL，dNTP（2 mmol/L）10 μL，LbxylA-F（10 μmol/L）2 μL，LbxylA-R（ 1 0 μ m o l/L ） 2 μ L， 單 鏈 c D N A 1 μ L ，KOD FXNeo1 μL，Millipore H2O補(bǔ)足50 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?8 ℃預(yù)變性5 min；循環(huán)為98 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，68 ℃延伸2 min，共30 個(gè)循環(huán)；68 ℃延伸5 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到pMD18-T載體上進(jìn)行測序。

1.3.2 實(shí)時(shí)熒光定量表達(dá)分析

表1 引物序列Table 1 Primer sequences used in this experiment

根據(jù)LbxylA基因序列設(shè)計(jì)熒光定量引物L(fēng)bxylA-qRTF和LbxylA-qRTR（表1）。18S基因作為內(nèi)參基因。在熒光定量PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)體系為：SYBR Green Master Mix 12.5 μL，上下游引物（10 μmol/L）各1 μL，cDNA模板5 μL，Millipore H2O補(bǔ)足25 μL。反應(yīng)條件為：95.0 ℃預(yù)變性3 min；循環(huán)為95.0 ℃變性10 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，75 ℃讀板5 s，共40 個(gè)循環(huán)；溶解曲線從65 ℃上升到95 ℃，每次讀板上升0.5℃。LbxylA在不同發(fā)育期果實(shí)中的相對表達(dá)量采用比較閾值法測定。通過計(jì)算2－ΔΔCt值確定該基因的相對表達(dá)量。

1.3.3 生物信息學(xué)分析

用DNAman軟件推導(dǎo)出LbxylA相應(yīng)氨基酸序列。利用ProtParam（http：//web.expasy.org/protparam/）完成蛋白基本性質(zhì)分析。采用PSORT Prediction（http：//psort1.hgc.jp/form.html）完成亞細(xì)胞定位分析。使用NCBI Conserved Domains（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）對序列的結(jié)構(gòu)域和功能進(jìn)行分析。在NCBI網(wǎng)站運(yùn)行的BLASTP程序數(shù)據(jù)庫中對LbxylA氨基酸序列進(jìn)行相似性搜索。利用MEGA 7軟件中提供的比對功能進(jìn)行多序列比對并基于鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.3.4 原核表達(dá)載體構(gòu)建與鑒定

利用分別帶有BamHI和SalI酶切位點(diǎn)的xylA-F和xylA-R引物對LbxylA基因開放閱讀框（open reading frame，ORF）全長進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所獲PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切、純化，連接到pGEX4T-1載體相同酶切位點(diǎn)，連接體系（10 μL）為10×T4 DNA Ligase Buffer 1 μL、目的基因3 μL、pGEX4T-1 1 μL、T4 DNA Ligase（5 U/μL）1 μL、ddH2O 4 μL，16 ℃連接2 h，置于4 ℃冰箱過夜保存。將過夜連接產(chǎn)物直接轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α，挑選單克隆進(jìn)行酶切驗(yàn)證后，陽性克隆送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

通識模塊包括英語、計(jì)算機(jī)、形勢與政策、毛澤東思想和中國特色社會(huì)主義理論體系等。這一模塊使學(xué)生初步確立將來為第一線服務(wù)的意識，掌握實(shí)驗(yàn)基本技能和方法。

1.3.5 重組質(zhì)粒的誘導(dǎo)純化及十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分析

將測序正確的重組質(zhì)粒pGEX4T-1-LbxylA轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，并進(jìn)行菌落PCR鑒定。陽性克隆接種于4 mL LB培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)過夜。按照1%接菌量將過夜培養(yǎng)液接種于400 mL LB培養(yǎng)基中，28 ℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)5 h，加入0.5 mmol/L IPTG，18 ℃、220 r/min繼續(xù)振蕩誘導(dǎo)10 h，離心收集菌體。未加入IPTG誘導(dǎo)的pGEX4T-1-LbxylA作為陰性對照。另取菌液按照每克濕質(zhì)量菌體/2～5 mL平衡緩沖液的比例，充分懸浮起收集的菌體，超聲波破碎菌體，20 000 r/min離心15 min，收集上清液，或用0.45 μm濾膜過濾。使用10 倍介質(zhì)體積緩沖液A（平衡緩沖液：10 mmol/L Na2HPO4，1.8 mmol/L KH2PO4，140 mmol/L NaCl，2.7 mmol/L KCl，調(diào)節(jié)pH值至7.4）過柱，平衡介質(zhì)（介質(zhì)為Ni瓊脂糖凝膠），上樣；用5～10 倍介質(zhì)體積緩沖液A過柱，洗去層析柱中剩余上樣液并重新平衡介質(zhì)；用5～10 倍介質(zhì)體積緩沖液B（洗脫緩沖液：300 mmol/L咪唑，10 mmol/L Na2HPO4，1.8 mmol/L KH2PO4，500 mmol/L NaCl，2.7 mmol/L KCl，調(diào)節(jié)pH值至7.4）洗脫，收集洗脫液；用5～10 倍介質(zhì)體積緩沖液A重新平衡介質(zhì)。

1.3.6 多克隆抗體制備

取純化的LbxylA融合蛋白，用Bradford法測定蛋白含量，并配成2 mg/mL的溶液。將上述溶液與等量完全弗氏佐劑乳化，注射于大白兔皮下進(jìn)行初次免疫，每只注射0.5 mg；14 d后的加強(qiáng)免疫用弗氏不完全佐劑乳化，加強(qiáng)免疫于肌肉注射，劑量為每只注射0.3 mg，每14 d加強(qiáng)免疫1 次。第60天后從耳緣靜脈采血，每只兔子采集1 mL，采用間接酶聯(lián)免疫吸附測定（enzymelinked immunosorbent assay，ELISA）法測定抗血清的效價(jià)。以純化的GST-LbxylA融合蛋白包被ELISA板，覆膜，置于4 ℃過夜，TBST（50 mmol/L Tris-HCl，150 mmol/L NaCl，1% Tween-20，pH 7.5）洗滌3 次，5%的脫脂奶粉37 ℃封閉1 h，加入不同稀釋比例的抗血清及免疫前的血清作對照，100 μL/孔，37 ℃孵育1 h，洗滌3 次，加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG（1∶1 000），37 ℃孵育1 h。洗滌3 次，加TMB底物顯色10 min，各反應(yīng)孔中加入2 mol/L硫酸終止反應(yīng)。用酶標(biāo)儀檢測450 nm波長處吸光度，免疫后的血清A450nm/免疫前的血清A450nm大于2.1，判斷為陽性?？寡逍r(jià)超過1∶3 200，可用于抗體純化和后期檢測。將免疫好的白兔禁食24 h，頸部動(dòng)脈取血，5 000 r/min離心15 min獲得抗血清，采用ProteinA親和層析法，對抗血清進(jìn)行純化。以上多克隆抗血清由武漢轉(zhuǎn)導(dǎo)生物實(shí)驗(yàn)室（Bio-transduction Lab，動(dòng)物使用許可證編號為SYXK（鄂）2012-0065）完成。

1.3.7 Western blot檢測

新鮮植物組織，液氮研磨后，按照0.22 g/mL比例加入預(yù)冷的蛋白提取緩沖液，4 ℃裂解2 h。12 000 r/min離心20 min，收集上清液。取一份樣本，按照BCA法進(jìn)行蛋白含量檢測。按照蛋白含量檢測結(jié)果，將另一份樣品進(jìn)行稀釋，調(diào)成相同蛋白濃度。加入2×SDS-PAGE上樣緩沖液，100 ℃沸水浴5 min。12% SDS-PAGE分離總蛋白條帶。將SDS-PAGE條帶轉(zhuǎn)移至0.22 μm PVDF膜。以5 g/L脫脂奶粉4 ℃封閉過夜，抗重組LbxylA融合蛋白兔血清（1∶400）4 ℃過夜，TBST洗3 次，每次5 min。山羊抗兔IgG HRP（1∶1 000）37 ℃孵育45 min，TBST洗6 次，每次5 min。加入超敏發(fā)光液，在凝膠成像系統(tǒng)成像，對條帶進(jìn)行分析。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用Microsoft Excel 2010和DPS 8.05統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 LbxylA克隆分析

圖1 1 LbxylAbxylA的PCR擴(kuò)增檢測結(jié)果Fig. 1 Agarose gel electrophoresis of PCR amplified LbxylA

圖2 2 LbxylAbxylA測序結(jié)果及預(yù)測氨基酸序列分析Fig. 2 Nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of LbxylA

2.2 LbxylA所編碼氨基酸序列及進(jìn)化樹分析

將LbxylA所編碼氨基酸序列進(jìn)行BLASTP分析，該序列與其他植物xylA基因編碼的氨基酸序列有較高一致性，該基因命名為LbxylA，NCBI注冊號為KX775441。

進(jìn)一步使用NCBI Conserved Domains（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）對其結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)該基因Asn17～Leu481位氨基酸序列與木糖異構(gòu)酶結(jié)構(gòu)域（PLN02923）有較高相似性，其E-value為0×100。該蛋白具有木糖異構(gòu)酶顯著特征，同時(shí)在序列中發(fā)現(xiàn)了可能的酶活性位點(diǎn)（His147）以及7 個(gè)金屬離子結(jié)合位點(diǎn)（圖2），分別為Glu277、Glu313、His316、Asp341、Asp352，跨膜區(qū)域疏水區(qū)錨定到ER膜（其可信度系數(shù)為5.5）。利用Uniprot數(shù)據(jù)庫BLASTP比對發(fā)現(xiàn)，LbxylA氨基酸序列與馬鈴薯和煙草xylA氨基酸序列相似性較高，序列同源性達(dá)到95%。利用MEGA 7軟件構(gòu)建包括LbxylA及數(shù)據(jù)庫中獲得的xylA氨基酸序列的系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果（圖3）表明，枸杞的LbxylA與茄科物種，如煙草、辣椒、馬鈴薯聚類到一個(gè)分支，這與該物種間具有較高的同源性相一致。

圖3 枸杞與其他植物xylA蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹分析Fig. 3 Phylogenetic tree of xylA proteins in L. barbarum Linn. and other plants

2.3 重組質(zhì)粒pGEX4T-1-LbxylA的構(gòu)建與鑒定

利用分別帶BamHI和SalI酶切位點(diǎn)的引物對LbxylA基因ORF全長進(jìn)行擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳檢測，與目的片段1 443 bp大小一致（圖4A）。將PCR產(chǎn)物酶切純化后，連接至pGEX4T-1載體多克隆位點(diǎn)，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落進(jìn)行菌落PCR（圖4B）和雙酶切驗(yàn)證（圖4C），均能檢測到目的條帶，且測序結(jié)果正確，表明重組質(zhì)粒pGEX4T-1-LbxylA構(gòu)建成功。

圖4 4 LbxylAbxylA的PCR及重組質(zhì)粒pGEX4T-1-4T-1-LbxylAbxylA的鑒定Fig. 4 PCR amplification of LbxylA and identification of recombinant plasmid pGEX4T-1-LbxylA

2.4 枸杞融合蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)及抗體制備

挑取重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化Rosetta（DE3）的陽性菌落，過夜培養(yǎng)，轉(zhuǎn)接到新鮮的培養(yǎng)基后，當(dāng)OD600nm為1.0時(shí)，加入終濃度為1 mmol/L的IPTG，37 ℃誘導(dǎo)4 h，利用SDS-PAGE檢測，結(jié)果見圖5A，重組質(zhì)粒pGEX4T-1-LbxylA得以表達(dá)，且在77 kDa左右的位置有特征蛋白條帶出現(xiàn)，與理論大小76.2 kDa基本相符，說明融合蛋白中LbxylA蛋白得到表達(dá)。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)1號克隆和3號克隆的表達(dá)水平相對較高，隨后選取1號克隆進(jìn)行下一步研究。為檢測LbxylA蛋白在大腸桿菌中重組表達(dá)時(shí)的可溶性，加入終濃度為0.1 mmol/L IPTG，18 ℃誘導(dǎo)表達(dá)10 h。結(jié)果表明（圖5B）LbxylA部分可溶，在上清液和沉淀中均能檢測到LbxylA蛋白的表達(dá)。分別純化了可溶蛋白和包涵體蛋白（圖5C），可溶蛋白用于后期血清的檢測實(shí)驗(yàn)，包涵體蛋白用于兔多克隆抗血清制備。

圖5 重組大腸桿菌pGEX4T-1-LbxylA的SDS-PAGE分析Fig. 5 SDS-PAGE analysis of the expressed and purified LbxylA protein

將純化后可溶蛋白作為檢測對象，通過間接ELISA法檢測抗血清效價(jià)，結(jié)果表明，獲得的抗血清效價(jià)高于1∶243 000，為高品質(zhì)抗血清。進(jìn)一步使用Protein A純化血清中的IgG，結(jié)果為純化后抗體效價(jià)高于1∶81 000，同時(shí)，Western blot檢測結(jié)果表明，說明獲得的LbxylA抗體與抗原之間有特異性條帶（圖6），可以用于后續(xù)研究。

圖6 LbxylA抗體有效性的Western blot檢測Fig. 6 Western blot of antibody against recombinant LbxylA

2.5 枸杞果實(shí)中LbxylA表達(dá)分析

以不同發(fā)育期的枸杞果實(shí)為試材，利用實(shí)時(shí)定量RT-PCR的方法檢測LbxylA基因的相對表達(dá)量，利用Western blot法檢測LbxylA所編碼蛋白的變化，結(jié)果如圖7所示，隨著果實(shí)發(fā)育進(jìn)程LbxylA相對表達(dá)量整體呈現(xiàn)出下降的趨勢，其中，在果實(shí)發(fā)育前期（開花后約0～15 d）果實(shí)中LbxylA表達(dá)量急劇下降，但在果實(shí)發(fā)育中后期（開花后約22～36 d）果實(shí)中的LbxylA表達(dá)量維持著恒定水平。LbxylA蛋白表達(dá)水平與LbxylA表達(dá)量的變化趨勢基本一致，但在果實(shí)發(fā)育前期（開花后約0～15 d）LbxylA蛋白表達(dá)水平略有升高趨勢，隨后逐漸降低，在果實(shí)發(fā)育中后期同樣維持著恒定水平，這就表明在果實(shí)發(fā)育前期由于基因翻譯及翻譯后加工可能導(dǎo)致蛋白表達(dá)滯后。

圖7 7 LbxylAbxylA基因在不同果實(shí)發(fā)育階段的表達(dá)模式Fig. 7 Expression pattern of LbxylA at different fruit development stages of L. barbarum

3 討 論

近年來，隨著植物基因工程的發(fā)展以及模式基因組進(jìn)展加快，對xylA的功能及結(jié)構(gòu)特征有了較為深入的研究。Madhavan等[22]從真菌中分離出全長序列為1 314 bp的xylA，編碼有437 個(gè)氨基酸，蛋白質(zhì)分子質(zhì)量為49 kDa；Kim等[23]從嗜熱菌中分離出xylA基因，該基因編碼438 個(gè)氨基酸，蛋白質(zhì)分子質(zhì)量為50.17 kDa。本研究從枸杞中分離出LbxylA，該基因序列全長為1 446 bp，其中，ORF為1 446 bp，編碼有481 個(gè)氨基酸，蛋白質(zhì)分子質(zhì)量為53.54 kDa，理論等電點(diǎn)5.37。本研究中采用生物信息學(xué)方法，分析發(fā)現(xiàn)LbxylA基因編碼的氨基酸序列存在7 個(gè)金屬離子結(jié)合位點(diǎn)，其位點(diǎn)與金屬離子結(jié)合有利于維持蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性[24]，此外，許偉等[25]發(fā)現(xiàn)木糖異構(gòu)酶單亞基活動(dòng)中心，存在兩個(gè)二價(jià)金屬離子結(jié)合位點(diǎn)，參與底物結(jié)合和催化過程，并維持活動(dòng)中心殘基功能。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)LbxylA基因序列與煙草和馬鈴薯的xylA序列相似性較高，達(dá)到95%，這表明LbxylA與同科植物xylA基因同源性較高，基因結(jié)構(gòu)功能也較為相近，從而可以推測該基因存在相對獨(dú)立的進(jìn)化過程。

研究發(fā)現(xiàn)，在細(xì)胞體內(nèi)木糖異構(gòu)酶將木糖異構(gòu)化為木酮糖，被應(yīng)用在木質(zhì)纖維素微生物發(fā)酵生產(chǎn)乙醇[3]；另外，在體外木糖異構(gòu)酶可將葡萄糖催化為果糖的異構(gòu)化反應(yīng)，這被大規(guī)模應(yīng)用于高果糖漿的工業(yè)生產(chǎn)[26]。將細(xì)菌的xylA基因?qū)氲今R鈴薯塊莖后，馬鈴薯塊莖中己糖組成發(fā)生改變，從而對馬鈴薯的新陳代謝產(chǎn)生一定的影響[27]。在本研究中，在果實(shí)的發(fā)育前期，果實(shí)中LbxylA的蛋白水平滯后于該基因相對表達(dá)量，但在果實(shí)發(fā)育中后期兩者變化相一致，這表明枸杞果實(shí)發(fā)育的不同階段LbxylA由于基因翻譯及翻譯后加工，使該基因存在時(shí)空間的差異，此外，LbxylA變化是否還與果實(shí)中糖含量高低有關(guān)，有待于進(jìn)一步研究。