楊銀菊，王樹(shù)聲，劉光亮，曾文龍，陳志厚，戴培剛，李琦瑤，陳愛(ài)國(guó)*

(1. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所/農(nóng)業(yè)部煙草生物學(xué)與加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266101；2. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院，北京 100081；3.福建省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所龍巖分所，福建 龍巖 364000；4. 福建省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所南平分所，福建 南平 353000)

【研究意義】烤煙是以葉片為收獲器官的一種經(jīng)濟(jì)作物，煙株進(jìn)入生殖生長(zhǎng)階段以后，如果不去除生殖器官，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)就會(huì)大量的流向頂部花序，造成煙葉產(chǎn)量降低、品質(zhì)下降[1]。因此打頂對(duì)提高烤煙的品質(zhì)和產(chǎn)量極其重要。提高煙葉香氣質(zhì)量一直是我國(guó)烤煙栽培研究的熱點(diǎn)。然而，烤煙香氣組分種類(lèi)繁多，不可能一一進(jìn)行研究，因此，有必要針對(duì)某一種或幾種特征香氣成分開(kāi)展合成積累研究。煙草中多酚類(lèi)物質(zhì)種類(lèi)眾多，主要包括綠原酸、蕓香苷、莨菪亭，其中綠原酸含量與改善煙葉等級(jí)密切相關(guān)[2]。研究表明綠原酸含量在打頂后迅速上升，但其調(diào)控機(jī)理尚未完全闡明[3-5]，不利于特征風(fēng)格的彰顯和定向提升煙葉質(zhì)量?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】打頂與烤煙產(chǎn)量和品質(zhì)形成密切相關(guān)。一方面，打頂可以促進(jìn)煙株根系生長(zhǎng)，有利于養(yǎng)分和水分的吸收及煙堿的合成[6]。另一方面，打頂能協(xié)調(diào)煙株庫(kù)源關(guān)系和物質(zhì)代謝、分配途徑，提高葉片中光合同化物分配比例，改善葉片中香氣物質(zhì)的含量和協(xié)調(diào)性，增加中上等煙葉產(chǎn)量[7-8]。此外，打頂對(duì)于煙株養(yǎng)分的吸收和分配、煙堿的積累規(guī)律及內(nèi)源激素含量等均會(huì)產(chǎn)生影響[9-10]。打頂后煙株內(nèi)源激素原有的平衡被打破，田效園等[11]研究發(fā)現(xiàn)煙葉內(nèi)源生長(zhǎng)素含量在打頂后顯著降低，時(shí)向東等[12]報(bào)道煙葉中IAA含量在打頂后先升高后降低?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】打頂后綠原酸和內(nèi)源生長(zhǎng)素含量都發(fā)生很大的變化，那么打頂后煙葉中綠原酸含量的變化是否與生長(zhǎng)素含量動(dòng)態(tài)平衡被打破有關(guān)？目前，沒(méi)有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究通過(guò)添加外源生長(zhǎng)素α-萘乙酸(α-Naphthalene acetic acid，NAA)和生長(zhǎng)素極性運(yùn)輸抑制劑萘草胺(N-1-naphthylphthalamic acid，NPA)處理，利用高效液相色譜法和酶聯(lián)免疫法來(lái)測(cè)定打頂后煙葉IAA含量、綠原酸含量以及綠原酸合成和降解關(guān)鍵酶的活性，旨在為探明打頂后煙葉中IAA含量對(duì)烤煙綠原酸生物合成的調(diào)控機(jī)理，從而定向提高煙葉品質(zhì)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試品種紅花大金元種子由國(guó)家煙草種質(zhì)資源庫(kù)提供，種子經(jīng)浸泡、滅菌、消毒后于 28 ℃黑暗條件下催芽，沙培45 d后進(jìn)行移栽。盆栽試驗(yàn)于2016年9月20日至12月29日在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所溫室內(nèi)進(jìn)行，苗期日平均溫度為(25±1)℃，現(xiàn)蕾到打頂期日平均氣溫(25±1)℃，盆高20 cm，直徑25 cm，每盆裝土8 kg，基質(zhì)(腐殖酸含量≥5.0 %，有機(jī)質(zhì)含量≥25.0 %)與土(棕壤，有效氮、磷、鉀含量分別為97.29、8.84、216.98 mg/kg)1∶1(v/v)混勻后裝盆，每盆種植1株。

1.2 試驗(yàn)處理

1.2.1 不同時(shí)期打頂對(duì)生長(zhǎng)素含量和綠原酸含量的影響 分別在苗期(八葉一心期)和現(xiàn)蕾后10 d(移栽后85 d)設(shè)置打頂處理、打頂+NAA處理和不打頂處理。每個(gè)處理種植25株；苗期打頂處理采用刀片將幼嫩的未展開(kāi)葉片及以上莖頂端組織切除，打頂+NAA處理在打頂后立即用脫脂棉在莖斷面切口涂20 mmol/L抹萘乙酸；現(xiàn)蕾后打頂處理于50 %第一中心花開(kāi)放時(shí)切除莖頂端(留葉18片)，打頂+NAA處理在打頂后立即用脫脂棉在莖斷面切口涂30 mmol/L抹萘乙酸。

處理后第3、6、9和12天，每處理分別選取3株生長(zhǎng)正常一致煙株的中部葉(苗期第4葉位，現(xiàn)蕾后10天第8葉位)，作為3個(gè)生物學(xué)重復(fù)；去除主脈后煙葉置于液氮中速凍，保存于-80 ℃超低溫冰箱中。生長(zhǎng)素含量檢測(cè)采用打頂后第3、6天的樣品，多酚檢測(cè)采用打頂后第3、6、9、12天的樣品。

1.2.2 外源生長(zhǎng)素及生長(zhǎng)素極性運(yùn)輸抑制劑處理對(duì)綠原酸的影響 在苗期(八葉一心期)設(shè)置打頂處理、打頂+NAA處理、未打頂+NPA處理和未打頂處理。每個(gè)處理種植15株；打頂處理采用刀片將幼嫩的未展開(kāi)葉片及以上莖頂端組織切除，打頂+NAA處理在打頂后立即用脫脂棉在莖斷面切口涂20 mmol/L抹萘乙酸。未打頂+NPA處理在煙株頂端噴施80 mmol/L的萘草胺。

處理后第3和6天，每處理分別選取3株生長(zhǎng)正常一致的中部葉，作為3個(gè)生物學(xué)重復(fù)；去除主脈后煙葉置于液氮中速凍，保存于-80 ℃超低溫冰箱中。用于生長(zhǎng)素、綠原酸含量以及綠原酸合成和降解關(guān)鍵酶活性測(cè)定。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目及方法

1.3.1 綠原酸含量測(cè)定 參照YC/T 202-2006行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)[13]，用高效液相色譜法(HPLC)測(cè)定綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸含量。

1.3.2 生長(zhǎng)素含量測(cè)定 參照Wang[14]的方法，利用高效液相色譜法(HPLC)測(cè)定IAA含量。

1.3.3 酶活性測(cè)定 采用酶聯(lián)免疫法法利用PAL、C4H、4CL、C3H、HCT、POD和PPO活性測(cè)定試劑盒(江蘇科晶生物技術(shù)有限公司)測(cè)定苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia-lyase，PAL)、肉桂酸4-羥化酶(cinnamic acid 4-hydroxylase，C4H)、4-香豆酸連接酶(4-coumarate-CoA ligase，4CL)、對(duì)-香豆酸3′-羥化酶(ρ-coumaroylester 3’-hydroxylase，C3H)、羥基肉桂酰輔酶A：莽草酸/奎尼酸羥基肉桂酰轉(zhuǎn)移酶(hydroxycinnamoyl CoA shikimate/quinate hydroxycinnamoyltransferase，HCT)、過(guò)氧化物酶(peroxidase，POD)和多酚氧化酶(polyphenol oxidase，PPO)活性。利用酶聯(lián)免疫法(江蘇綠葉生物技術(shù)有限公司)測(cè)定羥基肉桂酰輔酶A：奎尼酸羥基肉桂酰轉(zhuǎn)移酶(hydroxycinnamoyl-CoA:quinate hydroxycinnamoyl transferase，HQT)活性。

圖1 不同時(shí)期打頂后NAA處理對(duì)煙葉綠原酸含量的影響Fig.1 Effects of exogenous NAA applications on the content of chlorogenic acid in tobacco leaves at the different topping stage

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SAS 9.1軟件進(jìn)行LSD多重比較法方差分析(P<0.05)，Excel和Origin9.1軟件制作圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同時(shí)期打頂及涂抹NAA處理對(duì)煙葉綠原酸含量和內(nèi)源生長(zhǎng)素的影響

2.1.1 不同時(shí)期打頂及涂抹NAA處理對(duì)煙葉綠原酸含量的影響 由圖1可知，煙葉綠原酸含量在苗期打頂后顯著降低。打頂后3～12 d內(nèi)，打頂+NAA處理煙葉綠原酸含量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)。其中除第9天以外，打頂處理煙葉中綠原酸含量均顯著低于未打頂處理，而打頂+NAA處理煙葉中綠原酸含量顯著高于打頂處理，升高到了未打頂水平。

由圖1可知，現(xiàn)蕾后打頂煙葉綠原酸含量顯著升高。現(xiàn)蕾后打頂3～12 d內(nèi)，打頂+NAA處理煙葉綠原酸呈現(xiàn)先降低后增加趨勢(shì)。打頂+NAA處理煙葉綠原酸含量在處理后6～12 d均高于打頂處理。在打頂后3 d，與打頂處理相比，打頂+NAA處理煙葉綠原酸含量降低24.9 %。在打頂后第6和9天，打頂+NAA處理煙葉綠原酸含量顯著高于打頂處理。

2.1.2 不同時(shí)期打頂及涂抹NAA處理對(duì)煙葉內(nèi)源生長(zhǎng)素含量的影響 由圖2可知，苗期打頂后3～6 d時(shí)，打頂處理煙葉IAA含量均顯著低于未打頂處理，打頂+NAA處理煙葉IAA含量顯著高于打頂處理，涂抹NAA后第3天時(shí)煙葉內(nèi)源IAA升高幅度較大，處理后第6天時(shí)下降到未打頂煙葉的IAA含量水平。現(xiàn)蕾后打頂3～6 d時(shí)，打頂處理煙葉IAA含量先升高后降低，在第3天時(shí)顯著高于未打頂處理，在第6天時(shí)，顯著低于未打頂煙株。打頂+NAA處理煙葉IAA含量在處理期間持續(xù)最高。

2.2 打頂后煙葉生長(zhǎng)素含量與綠原酸含量間關(guān)系驗(yàn)證

2.2.1 打頂后外源物質(zhì)處理對(duì)內(nèi)源生長(zhǎng)素的影響 由圖3可知，打頂后打頂處理煙葉IAA含量在3～6 d內(nèi)均顯著低于未打頂處理，打頂煙株葉片IAA含量分別降低21.1 %和7.5 %,打頂后添加NAA處理可以提高IAA含量，而噴施NPA顯著抑制煙葉中IAA的含量,頂后第3和第6天時(shí)，與未打頂煙株葉片中IAA含量相比，未打頂+NPA煙葉中IAA含量分別下降59.3 %和52.3 %。

圖2 不同時(shí)期打頂對(duì)煙葉生長(zhǎng)素含量的影響Fig.2 Effects of exogenous NAA applications on the content of auxin in tobacco leaves at the different topping stage

圖3 外源NAA和NPA處理對(duì)煙葉內(nèi)源生長(zhǎng)素含量的影響Fig.3 Effects of exogenous NAA and NPA applications on the content of auxin in tobacco leaves

2.2.2 打頂后外源物質(zhì)處理對(duì)綠原酸含量的影響 由圖4可知，打頂后3～6 d內(nèi)，打頂處理煙葉綠原酸含量顯著低于未打頂處理，降低8 %左右；打頂+NAA處理綠原酸含量顯著高于打頂處理，分別提高28.9 %和29.2 %；打頂+NPA處理煙葉綠原酸含量最低，顯著低于其他3個(gè)處理。

2.2.3 打頂后外源物質(zhì)處理對(duì)綠原酸合成關(guān)鍵酶活性的影響 由圖5可知，處理后3～6 d時(shí)，與未打頂處理相比，除了打頂后第6天時(shí)HQT活性以外，打頂處理煙葉幾種綠原酸合成關(guān)鍵酶活性顯著升高。打頂+NAA處理煙葉C3H活性顯著高于打頂處理，其余幾種關(guān)鍵酶活性均顯著低于打頂處理。未打頂+NPA處理煙葉除PAL以外，其他幾種關(guān)鍵酶活性均顯著高于未打頂處理。

圖4 外源NAA和NPA處理對(duì)煙葉綠原酸含量的影響Fig.4 Effects of exogenous NAA and NPA applications on the content of chlorogenic acid in tobacco leaves

2.2.4 打頂后外源物質(zhì)處理對(duì)綠原酸降解關(guān)鍵酶活性的影響 由圖6可知，在打頂后3～6 d，打頂處理煙葉POD活性顯著高于未打頂處理，分別提高56.3 %、25.4 %。打頂+ NAA處理煙葉POD活性顯著低于打頂處理。未打頂+NPA處理煙葉POD活性顯著高于未打頂處理。處理后第3天時(shí)，打頂處理煙葉PPO活性顯著高于未打頂處理和打頂+NAA處理，顯著低于未打頂+NPA處理；第6天時(shí)打頂處理煙葉PPO活性顯著高于未打頂處理，其余處理間PPO活性差異不顯著。

圖5 外源NAA和NPA處理對(duì)煙葉綠原酸合成關(guān)鍵酶活性的影響Fig.5 Effects of exogenous NAA and NPA applications on the activity of key enzymes on the process of chlorogenic acid synthesis in tobacco leaves

圖6 外源NAA和NPA處理對(duì)煙葉綠原酸降解關(guān)鍵酶活性的影響Fig.6 Effects of exogenous NAA and NPA applications on the activity of key enzymes on the process of chlorogenic acid degradation in tobacco leaves

3 討 論

PAL是苯丙烷代謝途徑的第一個(gè)關(guān)鍵酶，也是連接初生代謝和次生代謝的關(guān)鍵酶，其活性受機(jī)械損傷、病原物等外界刺激的誘導(dǎo)[13-14]。因而PAL與植物生長(zhǎng)發(fā)育、應(yīng)激防御密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)打頂后PAL活性增強(qiáng)，與袁衛(wèi)瑜等[5]研究結(jié)果一致。打頂+NAA處理煙葉PAL活性顯著降低于打頂處理，推測(cè)涂抹NAA后機(jī)械損傷作用可能被削弱了。C4H、4CL、C3H、HCT和HQT均是綠原酸合成過(guò)程的關(guān)鍵酶[15-18]，與未打頂處理相比，其他幾個(gè)處理的這幾個(gè)關(guān)鍵酶活性均顯著升高，與綠原酸含量變化規(guī)律不完全一致，說(shuō)明綠原酸含量的變化可能與降解有關(guān)。PPO是一類(lèi)能夠?qū)⒎宇?lèi)化合物氧化為醌的酶[19]，機(jī)械損傷、食草動(dòng)物啃食、病源物侵染以及環(huán)境脅迫，均可誘導(dǎo)植物體內(nèi)PPO活性升高[20-21]。黃永等[22]研究發(fā)現(xiàn)打頂可以提高PPO活性。張婷等[10]的研究也有類(lèi)似的發(fā)現(xiàn)。本研究結(jié)果與之相似。

本研究通過(guò)添加NAA和NPA探討了打頂后生長(zhǎng)素對(duì)綠原酸的調(diào)控作用。結(jié)果表明打頂后涂抹NAA煙株葉片生長(zhǎng)素含量升高，綠原酸含量也升高，而涂抹NPA的煙株葉片生長(zhǎng)素含量降低，綠原酸含量也降低。說(shuō)明打頂后煙葉生長(zhǎng)素含量與綠原酸含量變化存在相關(guān)關(guān)系。時(shí)向東等[12]研究表明打頂后雪茄皮外包煙葉片中內(nèi)源IAA含量在打頂呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，本研究結(jié)果與之一致。Shi 等[23]研究也表明打頂后內(nèi)源IAA含量降低。本研究發(fā)現(xiàn)打頂處理和NPA處理煙葉中內(nèi)源IAA和綠原酸含量降低，而POD和PPO活性升高；打頂+NAA處理煙葉中內(nèi)源IAA和綠原酸含量升高，POD和PPO活性降低。說(shuō)明打頂后綠原酸降解速率大于合成速率，并受生長(zhǎng)素調(diào)控。研究表明，IAA能顯著降低PPO活性，促進(jìn)酚類(lèi)物質(zhì)合成積累[24]。這與同一時(shí)期IAA濃度較高則綠原酸含量較高的規(guī)律一致。綜上，打頂誘導(dǎo)綠原酸生物合成與打頂后內(nèi)源生長(zhǎng)素含量的的變化密切相關(guān)。

4 結(jié) 論

本研究采用高效液相色譜法和酶聯(lián)免疫法，對(duì)不同處理的煙草葉片中3種綠原酸的同分異構(gòu)體含量、IAA含量以及綠原酸合成和降解的關(guān)鍵酶活性進(jìn)行分析，主要結(jié)論如下。

打頂處理和NPA處理煙葉中內(nèi)源IAA含量降低，POD和PPO活性升高，綠原酸含量降低；打頂+NAA處理煙葉中內(nèi)源IAA含量升高，POD和PPO活性降低，綠原酸活性升高。與未打頂處理相比， PAL、C4H、4CL、C3H和HQT活性在不同處理?xiàng)l件下均升高，說(shuō)明打頂或NPA處理后綠原酸降解速率強(qiáng)于合成合成速率，打頂+NAA處理通過(guò)添加外源生長(zhǎng)素減弱打頂?shù)男?yīng)，綠原酸合成速率強(qiáng)于降解速率，不同處理?xiàng)l件下綠原酸含量的變化與POD、PPO活性變化密切相關(guān)。綜上，打頂后內(nèi)源生長(zhǎng)素含量的變化與打頂調(diào)控綠原酸生物合成密切相關(guān)。