毛立彥，唐毓瑋，謝振興，龍凌云，黃秋偉，陸祖正，於艷萍，蘇 群，丁麗瓊*

(1.廣西壯族自治區(qū)亞熱帶作物研究所，廣西 南寧 530001；2.廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 花卉研究所，廣西 南寧 530007)

【研究意義】睡蓮NymphaeaL.是睡蓮科睡蓮屬植物的總稱，屬于多年生草本植物[1]，花態(tài)多樣，花色艷麗，具有觀賞價(jià)值，主要用于城市水景綠化。睡蓮屬植物主要以生態(tài)學(xué)為基礎(chǔ)進(jìn)行分類(lèi)，可分為Nymphaea、Anecphya、Brachyceras、Hydrocallis、Lotos等5個(gè)亞屬[2-5]。其中，Brachyceras亞屬睡蓮的種、變種和栽培品種甚多[6]，是重要的種質(zhì)資源，對(duì)其花粉的研究對(duì)雜交育種的成敗具有指導(dǎo)意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】Brachyceras亞屬睡蓮‘保羅蘭’Nymphaea‘Paul Stetson’適宜廣西的氣候環(huán)境，群體花期長(zhǎng)達(dá)10個(gè)月以上，目前在廣西武宣縣小規(guī)模種植。花粉的活力是指花粉具有萌發(fā)和生長(zhǎng)發(fā)育的能力[7-8]，鑒定花粉生活力的方法主要有花粉離體培養(yǎng)法、染色法(如I2-KI染色、TTC染色)，花粉離體培養(yǎng)法是最準(zhǔn)確的鑒定花粉活力的方法[9-11]。關(guān)于睡蓮花粉離體培養(yǎng)的研究報(bào)道較少，趙其龍等[12]對(duì)Lotos亞屬的柔毛齒葉睡蓮花粉萌發(fā)的研究發(fā)現(xiàn)，最適宜的離體培養(yǎng)基是60 mg/L蔗糖+15 mg/L H3BO3。5 %蔗糖+15 mg/L H3BO3+20 mg/L CaCl2+1 %瓊脂為Nynphaea亞屬睡蓮花粉離體萌發(fā)的最佳培養(yǎng)基[13]。楊夢(mèng)飛等[14]采用離體培養(yǎng)法測(cè)定了不同亞屬睡蓮的花粉活力，其中埃及藍(lán)睡蓮(Brachyceras亞屬)在各個(gè)組分的培養(yǎng)液中均無(wú)法萌發(fā)。睡蓮花粉活力的研究可為睡蓮雜交親和性，新品種培育，基因庫(kù)的保存等研究提供參考依據(jù)[15-16]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前，有關(guān)測(cè)定‘保羅蘭’Nymphaea‘Paul Stetson’花粉在不同培養(yǎng)基中的萌發(fā)率和花粉管長(zhǎng)度，觀測(cè)花粉管的生長(zhǎng)過(guò)程的研究較少報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】旨在篩選出適宜Nymphaea‘Paul Stetson’睡蓮花粉萌發(fā)的培養(yǎng)基，為睡蓮的花粉活力檢測(cè)和的雜交育種的親本選擇提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為廣西壯族自治區(qū)亞熱帶作物研究所的睡蓮種質(zhì)資源圃的‘保羅蘭’睡蓮Nymphaea‘Paul Stetson’。

1.2 試驗(yàn)方法

共種植‘保羅蘭’睡蓮25株，株距2 m，在花蕾時(shí)期做套袋處理，避免昆蟲(chóng)攜帶花粉干擾試驗(yàn)。‘保羅蘭’睡蓮具有早上綻放，夜間閉合的特性，花開(kāi)后第2天再開(kāi)時(shí)，于早上8：00-9：00采摘花粉成熟的花朵帶回實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，從每朵花中選擇3枚成熟的花藥，將其中的花粉均勻抖落在干燥培養(yǎng)皿中并混勻，等待檢測(cè)。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目及方法

1.3.1 離體培養(yǎng)基最佳組分 采用雙因素試驗(yàn)篩選最佳培養(yǎng)基[17]。培養(yǎng)基用水為雙蒸餾水，蔗糖設(shè)置3個(gè)濃度梯度：0、100和200 g/L；H3BO3設(shè)置3個(gè)濃度梯度0、20和40 mg/L，共9個(gè)處理?；ǚ垭x體培養(yǎng)4 h后進(jìn)行鏡檢，根據(jù)9個(gè)處理的培養(yǎng)基培養(yǎng)效果，確定蔗糖和H3BO3的較佳配比，在此基礎(chǔ)上分別加入0、20、60和100 mg/L的CaCl2，進(jìn)一步對(duì)比花粉萌發(fā)率，探討CaCl2對(duì)花粉活力的影響，并篩選出最佳的培養(yǎng)基。

1.3.2 花粉的收集與離體萌發(fā) 在含有700 μl液體培養(yǎng)基的1 mL離心管中加入適量新鮮花粉，置于30 ℃培養(yǎng)室中，光照條件下自然培養(yǎng)6 h，每隔1 h觀測(cè)1次。將離心管搖勻，用移液槍吸取50 μl花粉液滴在載玻片上，進(jìn)行鏡檢。

1.3.3 花粉萌發(fā)率統(tǒng)計(jì)以及花粉管長(zhǎng)度測(cè)定 每個(gè)玻片隨機(jī)選取7個(gè)不重復(fù)的視野，每個(gè)視野花粉數(shù)量不少于40粒，以花粉管長(zhǎng)度大于花粉粒直徑視為萌發(fā)。使用Image-Pro Plus 6.0進(jìn)行花粉粒的計(jì)數(shù)以及測(cè)量花粉管的長(zhǎng)度。

萌發(fā)率(%)=(視野內(nèi)萌發(fā)花粉數(shù)/視野內(nèi)花粉總數(shù))×100

1.3.4 花粉離體培養(yǎng)的最佳時(shí)間 鏡檢最佳培養(yǎng)基培養(yǎng)1、2、3、4、5和6 h的花粉，分析花粉萌發(fā)率和花粉管生長(zhǎng)的趨勢(shì)，確立最佳的培養(yǎng)時(shí)間。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2013 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)與制圖，采用SPSS 18.0進(jìn)行雙因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度的蔗糖和H3BO3對(duì)花粉離體萌發(fā)的影響

9組花粉離體培養(yǎng)基的試驗(yàn)結(jié)果如表1所示，花粉離體萌發(fā)率非常低,均不足10 %，在僅有蔗糖或僅有H3BO3處理的單因素作用下，花粉管生長(zhǎng)有限，平均長(zhǎng)度不足60 μm。100 g/L蔗糖+20 mg/LH3BO3的培養(yǎng)基中，睡蓮花粉的萌發(fā)率較高，達(dá)到8.34 %；100 g/L蔗糖+40 mg/L H3BO3的培養(yǎng)基中，睡蓮花粉管的平均長(zhǎng)度較長(zhǎng)，達(dá)到179.9 μm。

表1 蔗糖和H3BO3對(duì)花粉萌發(fā)率和花粉管生長(zhǎng)的影響

表2 H3BO3和蔗糖的主體間效應(yīng)檢驗(yàn)結(jié)果

表3 LSD比較結(jié)果(主效應(yīng)Sucrose)

注:*表示均值差值在0.05級(jí)別上顯著，**表示均值差值在0.01級(jí)別上顯著。

Note:,* mean difference is significant at 0.05 level, ** mean difference is significant at 0.01 level.

表4 LSD比較結(jié)果(主效應(yīng)H3BO3)

注:*表示均值差值在0.05級(jí)別上顯著，**表示均呈差值在0.01級(jí)別上顯著。

Note: * mean difference is significant at 0.05 level, ** mean difference is significant at 0.01 level.

采用SPSS 18.0進(jìn)行不同濃度的蔗糖和H3BO3處理對(duì)花粉萌發(fā)率影響的雙因素方差分析，如表2所示，不同濃度的蔗糖或H3BO3處理對(duì)花粉的離體萌發(fā)存在極顯著的影響(P<0.01，下同)，并且2個(gè)因素的交互作用極顯著。

表5 H3BO3和CaCl2對(duì)花粉萌發(fā)率和花粉管生長(zhǎng)的影響

表6 H3BO3和CaCl2主體間效應(yīng)檢驗(yàn)結(jié)果

再進(jìn)一步采用LSD檢驗(yàn)法進(jìn)行多重比較，主效應(yīng)分析結(jié)果表明，在試驗(yàn)范圍內(nèi)，100 g/L的蔗糖處理適宜花粉萌發(fā)，與0及200 g/L的蔗糖處理之間均存在極顯著差異，200 g/L的蔗糖處理存在抑制作用(表3)；0 mg/L H3BO3的處理與20、40 mg/L H3BO3的處理之間均存在極顯著差異，20與40 mg/L H3BO3的處理之間無(wú)顯著差異。H3BO3的加入能顯著促進(jìn)花粉的萌發(fā)，20和40 mg/L的H3BO3的處理均適宜睡蓮花粉的萌發(fā)(表4)。

2.2 不同H3BO3和CaCl2的濃度對(duì)花粉萌發(fā)的影響

根據(jù)蔗糖、H3BO3的主效應(yīng)分析結(jié)果(表3、表4)，進(jìn)一步進(jìn)行H3BO3和CaCl2處理的雙因素試驗(yàn)，硼酸濃度設(shè)置2個(gè)水平：20、40 mg/L，CaCl2濃度設(shè)置4個(gè)水平：0(CK)、20、60及100 mg/L。試驗(yàn)結(jié)果如表5所示。采用SPSS 18.0進(jìn)行不同濃度的H3BO3和CaCl2處理對(duì)花粉萌發(fā)率影響的雙因素方差分析(表6)，不同濃度的H3BO3或CaCl2處理對(duì)花粉的離體萌發(fā)存在極顯著的影響，并且兩個(gè)因素存在極顯著的交互作用。

再進(jìn)一步采用LSD檢驗(yàn)法對(duì)不同濃度的CaCl2處理進(jìn)行簡(jiǎn)單的主效應(yīng)分析(表7)，在不同H3BO3濃度的水平上，對(duì)CaCl2進(jìn)行簡(jiǎn)單主效應(yīng)分析，結(jié)果表明：CaCl2能促進(jìn)花粉的萌發(fā)，在試驗(yàn)范圍內(nèi)，20 mg/L的CaCl2處理較適宜花粉的離體萌發(fā)，在不同濃度的H3BO3水平上，與0、60和100 mg/L的CaCl2的處理均存在極顯著的差異，在20 mg/L H3BO3的水平上，隨著CaCl2濃度的增高，促進(jìn)花粉萌發(fā)的效果逐步減弱。

2.3 離體萌發(fā)過(guò)程中花粉萌發(fā)率及花粉管長(zhǎng)度的變化情況

如圖1所示，花粉萌發(fā)率在1～4 h內(nèi)快速上升，從11.30 %±1.24 %上升至20.66 %±0.56 %，4～6 h時(shí)，萌發(fā)率相對(duì)平穩(wěn)，維持在20 %左右。花粉管的平均長(zhǎng)度在培養(yǎng)1～2 h時(shí)迅速增長(zhǎng)，從97.84 μm上升至145.22 μm，2～4 h時(shí)，花粉管平均長(zhǎng)度不變，4 h以后花粉管平均長(zhǎng)度略有下降。綜上所述，最佳的鏡檢時(shí)間可以設(shè)置為4 h。

表7 LSD比較結(jié)果(主效應(yīng)CaCl2)

注：CaCl2單位為mg/L，*表示均值差值在0.05級(jí)別上較顯著，**表示均呈差值在0.01級(jí)別上顯著。

Note: CaCl2unit mg/L, * means that difference is significant at 0.05 level, ** means that difference is significant at 0.01 level.

圖1 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)花粉萌發(fā)和花粉管生長(zhǎng)的影響Fig.1 Effect of culture times on pollen germination and pollen tube growth

在鏡檢中觀察到，睡蓮的花粉粒呈圓形(圖2-a)，直徑大約25～50 μm，一粒睡蓮花粉通常只萌發(fā)出一束花粉管(圖2-b)。萌發(fā)的初始階段，花粉粒的一側(cè)會(huì)凸起，突起物透明(圖2-c)。隨后突起部位不斷伸長(zhǎng)，形成花粉管。隨著花粉管的伸長(zhǎng)，花粉粒中的內(nèi)含物逐步進(jìn)入花粉管，花粉管漸漸填充滿內(nèi)含物(圖2-d)。在下一個(gè)階段的生長(zhǎng)過(guò)程中，內(nèi)含物均勻分布在花粉粒和花粉管之中，此外還會(huì)出現(xiàn)以下幾種情況；花粉粒變透明，花粉管中部和末端充滿內(nèi)含物；內(nèi)含物分別集中分布在花粉管各個(gè)部分，透明與不透明的部分界限鮮明(圖2-f)。此外，花粉萌發(fā)過(guò)程中，花粉管還會(huì)出現(xiàn)細(xì)小、扭曲的現(xiàn)象(圖2-e)。

3 討 論

3.1 培養(yǎng)基組分和花粉萌發(fā)及花粉管生長(zhǎng)的關(guān)系

適宜濃度的蔗糖對(duì)睡蓮花粉萌發(fā)有明顯的促進(jìn)作用，蔗糖是花粉萌發(fā)和花粉管生長(zhǎng)主要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，同時(shí)也是花粉代謝和跨膜運(yùn)輸?shù)奶荚碵18]。10 %的蔗糖能有效促睡蓮花粉萌發(fā)，過(guò)高濃度會(huì)產(chǎn)生抑制。楊夢(mèng)飛等[14]的研究也得到同樣的結(jié)果，10 %的蔗糖濃度適用于睡蓮花粉的離體培養(yǎng)。李佛蓮等[8]對(duì)山玉蘭花粉的研究表明，蔗糖濃度高于10 %會(huì)抑制山玉蘭花粉的萌發(fā)，5 %蔗糖是最適宜耐寒睡蓮花粉萌發(fā)的濃度。鄧衍明等[20]的研究表明，在BK培養(yǎng)基[19]中添加8 %蔗糖最適宜花粉管的萌發(fā)，而薄殼山核桃花粉萌發(fā)的最佳蔗糖濃度為20 %～30 %[18]。因此，不同植物的花粉離體萌發(fā)適宜的蔗糖濃度不同，這可能與不同植物花粉對(duì)蔗糖濃度形成的滲透壓的適應(yīng)能力不同有關(guān)。在今后的睡蓮花粉研究中，可以將試驗(yàn)對(duì)象擴(kuò)展至其它亞屬的睡蓮花粉，以進(jìn)一步探討不同亞屬的睡蓮花粉對(duì)蔗糖濃度的適應(yīng)能力的差異性。

a.睡蓮花粉在蒸餾水中培養(yǎng)4 h的狀態(tài)；b.睡蓮花粉在培養(yǎng)基中培養(yǎng)4 h的狀態(tài)；c.睡蓮花粉萌發(fā)的初始階段；d.睡蓮花粉管開(kāi)始伸長(zhǎng)，內(nèi)含物質(zhì)進(jìn)入花粉管；e.花粉管扭曲異常；f.花粉管伸長(zhǎng)后，內(nèi)含物在花粉管的分布情況a. The condition of pollen in distilled water for 4 hours; b. The condition of pollen in medium for 4 hours; c. The initial stage of pollen germination; d. pollen tube begins to elongate and inclusion enters pollen tube; e. Abnormal distortion of pollen tube; f. Distribution of inclusions in pollen tube after elongation of pollen tube 圖2 花粉萌發(fā)及花粉管生長(zhǎng)的動(dòng)態(tài)變化Fig.2 The dynamic changes of pollen germination and pollen tube growth

H3BO3能刺激并增加花粉對(duì)糖類(lèi)的吸收、運(yùn)轉(zhuǎn)和代謝[21]，參與花粉管頂端細(xì)胞壁合成，對(duì)花風(fēng)管中果膠的合成有著重要作用[22]，使酸性果膠轉(zhuǎn)變呈酯化果膠，而酯化果膠存在于花粉管頂端，有助于提高花粉管頂端的延展性[8]。硼離子對(duì)質(zhì)外體結(jié)合鈣離子和游離鈣離子有影響，可以增加細(xì)胞內(nèi)的游離鈣離子，使其達(dá)到啟動(dòng)花粉萌發(fā)的最佳濃度[23]。硼離子的加入能有效促進(jìn)Nymphaea‘Paul Stetson’睡蓮花粉的萌發(fā)和花粉管的生長(zhǎng)，20 mg/L的硼離子更適宜睡蓮花粉的萌發(fā)，在10 %蔗糖+20 mg/L CaCl2的基礎(chǔ)上，花粉萌發(fā)率達(dá)到20.66 %。

Ca2+是花粉萌發(fā)、花粉管生長(zhǎng)不可缺少的，外源施加的Ca2+能促進(jìn)花粉的萌發(fā)[23]，Bednarska[24]通過(guò)在培養(yǎng)基中加入Ca2+通道阻塞劑發(fā)現(xiàn)花粉萌發(fā)受到抑制，證明了Ca2+對(duì)花粉萌發(fā)的影響。楊夢(mèng)飛等[14]的試驗(yàn)中，培養(yǎng)基未加入Ca2+，除埃及白睡蓮?fù)?，其余睡蓮花粉萌發(fā)率均不到10 %，這與本試驗(yàn)的結(jié)果較一致。在濃度適宜的蔗糖、H3BO3的培養(yǎng)基中，補(bǔ)充少量的外源Ca2+能顯著提高Nymphaea‘Paul Stetson’睡蓮花粉的萌發(fā)率，過(guò)高的Ca2+會(huì)造成Ca2+中毒，反而抑制花粉的萌發(fā)[25]。龔明和曹宗巽[26]研究結(jié)果認(rèn)為，Ca2+能啟動(dòng)花粉萌發(fā)和調(diào)節(jié)花粉管生長(zhǎng)。本研究結(jié)果表明，Nymphaea‘Paul Stetson’睡蓮花粉在缺少Ca2+的培養(yǎng)基中，萌發(fā)率非常低，隨著Ca2+的加入，萌發(fā)率大幅度提高。

3.2 花粉管的生長(zhǎng)情況

4 h以前，睡蓮花粉萌發(fā)率會(huì)隨著培養(yǎng)時(shí)間顯著增加，4 h以后趨于穩(wěn)定，花粉管長(zhǎng)度在培養(yǎng)2 h以前迅速增加，2 h后達(dá)到一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的水平，此結(jié)果與楊夢(mèng)飛等[14]的研究結(jié)果基本一致。

試驗(yàn)中所觀察到的睡蓮花粉?；蚧ǚ酃苤械膬?nèi)含物質(zhì)可能是生殖核及營(yíng)養(yǎng)核或微絲骨架[27]。游韓莉等[28]研究發(fā)現(xiàn)花粉在離體萌發(fā)過(guò)程中，營(yíng)養(yǎng)核和生殖核會(huì)陸續(xù)進(jìn)入到花粉管內(nèi)，微絲骨架排列與花粉細(xì)胞核的移動(dòng)存在一定的關(guān)系，隨著花粉的萌發(fā)，微絲骨架逐漸聚集，推動(dòng)營(yíng)養(yǎng)核和生殖核向花粉管內(nèi)移動(dòng)。花粉管中的細(xì)胞核行為及花粉管內(nèi)的微絲骨架的分布是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程[29]，對(duì)此次試驗(yàn)中觀察到的花粉中的內(nèi)含物質(zhì)需要進(jìn)一步進(jìn)行熒光標(biāo)記，才能進(jìn)行更準(zhǔn)確和深入的研究分析。

4 結(jié) 論

最適合‘保羅蘭’睡蓮的花粉離體萌發(fā)的培養(yǎng)基為10 %蔗糖+20 mg/L或40 mg/L H3BO3+20 mg/L CaCl2，花粉離體萌發(fā)率為15.76 %～20.66 %，花粉管生長(zhǎng)長(zhǎng)度為139.28～141.11 μm，最佳鏡檢時(shí)間為4 h。