黃 素，李 潔，馬丹煒*，花敏瑞，江文倩，肖 楊，陳麗娜，全津瑩

(1.四川師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，四川 成都 610101；2.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)信息與農(nóng)村經(jīng)濟(jì)研究所，四川 成都 610066)

【研究意義】玉米(ZeamaysL.)是我國種植面積最大的重要作物，遍及二十多個(gè)省區(qū)，用途廣泛[1]。多種非生物脅迫會(huì)影響玉米的生長(zhǎng)發(fā)育，導(dǎo)致玉米減產(chǎn)，如光照較弱時(shí)玉米籽粒敗育粒增加、體積減小、干重降低[2]；干旱脅迫導(dǎo)致玉米葉片光系統(tǒng)Ⅱ和抗氧化酶系統(tǒng)受損[3]；土壤含水量過高時(shí)玉米幼苗生物量顯著下降等[4]，而生物脅迫研究較少?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】土荊芥(ChenopodiumambrosioidesL.)為藜科藜屬一年生或多年生的芳香性草本入侵植物，原產(chǎn)美洲熱帶，極易擴(kuò)散于農(nóng)田中，該種含有毒揮發(fā)油，對(duì)其他植物產(chǎn)生化感作用[5]。研究表明，土荊芥揮發(fā)油可使玉米根尖細(xì)胞內(nèi)ROS爆發(fā)，相關(guān)基因表達(dá)改變，抗氧化系統(tǒng)受到影響[6]，阻礙玉米根毛發(fā)育，降低玉米種子活力，從而影響玉米的生長(zhǎng)發(fā)育，成為優(yōu)勢(shì)物種[7]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】氣孔保衛(wèi)細(xì)胞是植物響應(yīng)外界的第一門戶，對(duì)保衛(wèi)細(xì)胞不利的脅迫將影響植物的光合作用，ROS、NO和Ca2+等信號(hào)分子常參與調(diào)節(jié)細(xì)胞對(duì)外界脅迫的響應(yīng)[8]，而土荊芥揮發(fā)油是否影響玉米保衛(wèi)細(xì)胞的功能及其作用機(jī)制不得而知。【擬解決的關(guān)鍵問題】因此，本研究以玉米為對(duì)象，分析土荊芥揮發(fā)油對(duì)其保衛(wèi)細(xì)胞的毒性作用，首次利用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶生物素-dUTP缺口末端標(biāo)記法(TUNEL)檢測(cè)化感脅迫后玉米保衛(wèi)細(xì)胞凋亡情況，探討保衛(wèi)細(xì)胞核形態(tài)、活性及胞內(nèi)信號(hào)分子對(duì)土荊芥化感脅迫的響應(yīng)，有利于揭示土荊芥誘導(dǎo)的保衛(wèi)細(xì)胞凋亡現(xiàn)象及其機(jī)理，為深入了解入侵植物的脅迫機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

土荊芥地上部分采于四川成都包江橋，水蒸氣蒸餾法提取揮發(fā)油[9]，無水Na2SO4干燥，4 ℃保存；玉米種子(雅玉26#)購于四川西南科聯(lián)種業(yè)公司；TUNEL試劑盒產(chǎn)自Beyotime公司。

1.2 方法

1.2.1 材料培養(yǎng)及處理 選種后，0.5 %KMnO4消毒10 min，25 ℃暗培浸種24 h后催芽，取萌發(fā)一致的種子種于營養(yǎng)土中(花盆直徑14 cm，高12 cm)，25 ℃光暗周期14/10 h培養(yǎng)。4周取第2層平展葉片備用。

二甲基亞砜(DMSO)配制濃度為0.10 μl/μl的揮發(fā)油母液。撕取下表皮切成1 cm×0.5 cm表皮條，放入加有5 mL MES緩沖液[8]的EP管，分別加入2、4、6、8、10 μl揮發(fā)油母液，DMSO補(bǔ)足10 μl，25 ℃光照培養(yǎng)10、20、30 min，設(shè)置空白對(duì)照和溶劑對(duì)照(10 μl DMSO)。

以泛Caspase抑制劑(Z-VAD-FMK:0.05,0.1,0.15 μmol/L)，抗壞血酸(AsA:0.05,0.1,0.5 mmol·L-1)，過氧化氫酶(CAT:100, 200, 300 U·mL-1)，Ca2+螯合劑(EGTA: 0.05, 0.1, 0.5 mmol·L-1)，Ca2+通道抑制劑(LaCl3: 0.05, 0.1, 0.5 mmol·L-1)，硝酸還原酶抑制劑(NaN3:0.05,0.1,0.2 mmol·L-1)和NO合成酶抑制劑(L-NAME:0.025,0.05,0.075 mmol·L-1)為拮抗劑，分別將拮抗劑與8 μl揮發(fā)油母液加入緩沖液，混勻后放入表皮條，25 ℃光照培養(yǎng)30 min，設(shè)置空白對(duì)照和揮發(fā)油對(duì)照(揮發(fā)油母液8 μl)。

1.2.2 細(xì)胞活性和細(xì)胞核形態(tài)檢測(cè) 細(xì)胞活性檢測(cè)參照馬丹煒等[10]方法，AO/EB避光染色3 min，LEICA DM 3000顯微鏡觀察。細(xì)胞核形態(tài)檢測(cè)采用Feμlgen染色法[10]，Schiff試劑避光染色1 h。LEICA DFC450C顯微鏡觀察。每個(gè)處理觀察1000個(gè)保衛(wèi)細(xì)胞，重復(fù)3次。

1.2.3 TUNEL檢測(cè) 將表皮條加入含8 μl揮發(fā)油母液的緩沖液中，25 ℃光照培養(yǎng)30 min，PBS洗滌3次，卡諾氏液4 ℃固定2 h，PBS洗滌3次，4 %(m/v)果膠酶和2 %(m/v)纖維素酶37 ℃酶解10 min，PBS洗滌3次，0.2 % Triton x-100處理30 min，PBS洗滌3次，TUNEL反應(yīng)混合物避光染色90 min，PBS洗滌后制片。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

Microsoft Excel 2007進(jìn)行數(shù)據(jù)錄入和作圖，SPSS 17.00進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 土荊芥揮發(fā)油對(duì)玉米保衛(wèi)細(xì)胞核形態(tài)的影響

形態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組保衛(wèi)細(xì)胞核形態(tài)規(guī)則(圖1a1,a2)，揮發(fā)油處理組保衛(wèi)細(xì)胞出現(xiàn)核固縮(圖1b1,b2)，核斷裂(圖1c1,c2)等現(xiàn)象。同一處理時(shí)間下，處理組細(xì)胞核異常率較對(duì)照組顯著增加(P<0.05)，其中10 μl揮發(fā)油母液處理30 min時(shí)核異常率達(dá)到最大(75.57 %)。同一劑量下，細(xì)胞核異常率隨處理時(shí)間增加而顯著上升(P<0.05，6 μl揮發(fā)油母液處理20、30 min組間和8 μl揮發(fā)油母液處理20、30 min組間除外)。表明土荊芥揮發(fā)油對(duì)玉米保衛(wèi)細(xì)胞具有強(qiáng)烈的毒性，且與細(xì)胞核畸變率存在劑量效應(yīng)與時(shí)間效應(yīng)。

a：對(duì)照；b：核固縮；c：核斷裂(1. AO/EB染色，2. Schiff試劑染色)a：CK；b：Nuclear pyknosis；c：Nuclear fragmentation(1.AO/EB staining，2.Schiff reagent staining)圖1 土荊芥揮發(fā)油處理下玉米保衛(wèi)細(xì)胞核形態(tài)的變化Fig.1 Nuclear morphology changes in the guard cells of Zea mays L. exposed to volatile oil from Chenopodium ambrosioides L.

圖2 土荊芥揮發(fā)油對(duì)玉米保衛(wèi)細(xì)胞核形態(tài)的影響Fig.2 Effect of volatile oil from Chenopodium ambrosioides L.on guard cell nucleus morphology in Zea mays L.

2.2 土荊芥揮發(fā)油對(duì)玉米保衛(wèi)細(xì)胞活性的影響及其信號(hào)調(diào)節(jié)

AO/EB染色后觀察發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組保衛(wèi)細(xì)胞的細(xì)胞核發(fā)亮綠色熒光，顯示較高活性(圖1a1)，處理組細(xì)胞核發(fā)橘紅色熒光，即細(xì)胞活性降低(圖1b1,c1)。圖3顯示，相同處理時(shí)間下，除少數(shù)低劑量組(2 μl)保衛(wèi)細(xì)胞死亡率與對(duì)照組無顯著差異外，其余組均隨處理劑量增加而增大(P<0.05)，10 μl組處理30 min時(shí)，細(xì)胞死亡率高達(dá)85.94 %。同一劑量下，除2 μl組處理20、30 min之間無顯著差異外，其余組細(xì)胞死亡率均隨處理時(shí)間增加而上升(P<0.05)?？梢娡燎G芥揮發(fā)油可誘導(dǎo)保衛(wèi)細(xì)胞死亡，具有顯著的細(xì)胞毒性，與細(xì)胞死亡率存在劑量效應(yīng)與時(shí)間效應(yīng)。

大寫字母表示同一時(shí)間，不同劑量處理組間差異；小寫字母表示同一劑量，不同時(shí)間處理組間差異；P<0.05，下同Uppercase letters indicate the same time, different doses of treatment group differences; Lowercase letters that the same dose, different time treatment group differences; P<0.05, The same as below圖3 土荊芥揮發(fā)油對(duì)玉米保衛(wèi)細(xì)胞活性的影響Fig.3 Effect of volatile oil from Chenopodium ambrosioides L.on guard cell viabilities in Zea mays L.

a：光學(xué)顯微鏡下的玉米保衛(wèi)細(xì)胞；b：對(duì)照；c：TUNEL陽性a：The guard cells of Zea mays L. under optical microscope；b：CK；c：TUNEL-positive圖4 玉米保衛(wèi)細(xì)胞的TUNEL原位檢測(cè)Fig.4 The TUNEL assay in the guard cells of Zea mays L.

TUNEL檢測(cè)發(fā)現(xiàn)保衛(wèi)細(xì)胞核DNA的3′-OH斷端可被特異標(biāo)記為綠色，呈TUNEL陽性(圖4c)，而對(duì)照組則不被TUNEL特異性標(biāo)記呈無熒光的陰性結(jié)果(圖4b)，說明揮發(fā)油處理后，保衛(wèi)細(xì)胞出現(xiàn)大量DNA斷裂為片段的細(xì)胞凋亡特征。加入泛Caspase抑制劑Z-VAD-FMK后，保衛(wèi)細(xì)胞死亡率顯著降低(P<0.05，圖5)，表明土荊芥揮發(fā)油誘導(dǎo)的玉米保衛(wèi)細(xì)胞死亡屬于Caspase依賴性的細(xì)胞凋亡。

不同濃度的AsA、CAT、EGTA、LaCl3、NaN3和L-NAME分別與8 μl揮發(fā)油一起處理表皮條后，保衛(wèi)細(xì)胞死亡率均顯著降低。其中,0.5 mmol·L-1AsA，300 U·mL-1CAT，0.5, mmol·L-1EGTA，0.5mmol·L-1LaCl3，0.20 mmol·L-1NaN3和0.075 mmol·L-1L-NAME處理時(shí)保衛(wèi)細(xì)胞死亡率最低，分別為21.10 %、53.57 %、34.61 %、33.76 %、46.73 %和36.21 %，顯示高濃度拮抗劑處理對(duì)保衛(wèi)細(xì)胞死亡的緩解作用最大。上述結(jié)果說明，ROS、NO、Ca2+等信號(hào)分子參與了土荊芥揮發(fā)油誘導(dǎo)玉米保衛(wèi)細(xì)胞凋亡的信號(hào)調(diào)節(jié)。

LC：低濃度緩解劑；MC：中等濃度緩解劑；HC：高濃度緩解劑LC：Low concentration inhibitor；MC：Medium concentration inhibitor；HC：High concentration inhibitor圖5 拮抗劑對(duì)土荊芥揮發(fā)油誘導(dǎo)保衛(wèi)細(xì)胞死亡的緩解作用Fig.5 Alleviating effects of antagonists on guard cell death of Zea mays L. induced by the volatile oil from Chenopodium ambrosioides L.

3 討 論

3.1 土荊芥揮發(fā)油對(duì)玉米保衛(wèi)細(xì)胞的毒性作用

入侵植物釋放的揮發(fā)性化感物質(zhì)具有強(qiáng)烈的細(xì)胞毒性，如加拿大蓬(ErigeronCanadensisL.)揮發(fā)油誘導(dǎo)蠶豆(ViciafabaL.)保衛(wèi)細(xì)胞活性降低，細(xì)胞核畸變[11]；土荊芥揮發(fā)油使大豆[Glycinemax(Linn.) Merr.]根邊緣細(xì)胞數(shù)減少，存活率降低[12]；桉(EucalyptusrobustaSmith)揮發(fā)油引起萵苣(LactucasativaL.)根尖分生組織細(xì)胞核固縮，染色體發(fā)生變異，誘導(dǎo)細(xì)胞死亡[13]。本研究表明，土荊芥揮發(fā)油具有較高的細(xì)胞毒性，使玉米保衛(wèi)細(xì)胞核形態(tài)出現(xiàn)核固縮、斷裂等細(xì)胞凋亡特征，導(dǎo)致細(xì)胞死亡，且細(xì)胞核畸變率和細(xì)胞死亡率與濃度存在劑量效應(yīng)與時(shí)間效應(yīng)。

3.2 ROS、NO和Ca2+參與土荊芥揮發(fā)油誘導(dǎo)的保衛(wèi)細(xì)胞Caspase依賴性凋亡

細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，核小體間的DNA開始隨機(jī)斷裂，激活Caspase途徑，誘導(dǎo)內(nèi)切核酸酶被活化，將DNA降解成寡聚核小體片段，促使細(xì)胞凋亡[11]。DNA片段化是細(xì)胞凋亡的重要特征，TUNEL原位末端標(biāo)記法是公認(rèn)檢測(cè)細(xì)胞凋亡的有效指標(biāo)[14]，Li等[15]研究表明，土荊芥揮發(fā)油能誘導(dǎo)玉米根尖細(xì)胞核DNA斷裂，發(fā)生細(xì)胞凋亡。本研究也證實(shí)，土荊芥揮發(fā)油誘導(dǎo)保衛(wèi)細(xì)胞活性降低，TUNEL檢測(cè)為陽性，顯示出保衛(wèi)細(xì)胞核DNA斷裂，裸露出游離的3′-OH末端，具有明顯的細(xì)胞凋亡特征，加入泛Caspase抑制劑Z-VAD-FMK可抑制該過程，說明保衛(wèi)細(xì)胞發(fā)生了Caspase依賴性的細(xì)胞凋亡，這是玉米對(duì)土荊芥化感脅迫的自主響應(yīng)，以防止有害物質(zhì)進(jìn)入其他組織，維持機(jī)體內(nèi)部平衡。

化感脅迫往往伴隨著氧化脅迫，ROS是植物細(xì)胞在抵抗環(huán)境脅迫過程中的一個(gè)重要信號(hào)分子[16]，細(xì)胞具有抗氧化防御機(jī)制，正常情況下，胞內(nèi)ROS含量不高，化感脅迫下，葉綠體和線粒體的功能受到影響，導(dǎo)致大量ROS在細(xì)胞中積累，氧化與抗氧化作用一旦失衡，核DNA將受到氧化損傷，導(dǎo)致堿基缺失，DNA斷裂等，凋亡可能是細(xì)胞響應(yīng)這種失衡的結(jié)果[17]；NO是一種具有自由基性質(zhì)的脂溶性氣體信號(hào)分子，可透過細(xì)胞膜快速擴(kuò)散，已被證實(shí)作用臨近靶細(xì)胞參與眾多生理病理過程[18]，伴隨ROS爆發(fā)，細(xì)胞內(nèi)NO的合成達(dá)到高峰，細(xì)胞活性將受到影響[19]。細(xì)胞常通過ROS和NO介導(dǎo)第二信使Ca2+信號(hào)通路響應(yīng)脅迫應(yīng)答，ROS激活質(zhì)膜Ca2+通道引起胞外Ca2+內(nèi)流，增加胞內(nèi)Ca2+水平，通過活化核酸內(nèi)切酶依賴性Ca2+，在核小體連接切割DNA，從而激活Caspase家族成員，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[8,11,20]。本研究中，分別加入AsA，CAT，EGTA，LaCl3，NaN3或L-NAME后，保衛(wèi)細(xì)胞死亡率顯著降低(P<0.05)，推測(cè)土荊芥揮發(fā)油誘導(dǎo)玉米保衛(wèi)細(xì)胞內(nèi)ROS和NO水平升高，激活細(xì)胞膜上的Ca2+通道，導(dǎo)致胞內(nèi)Ca2+濃度升高，激活Caspase依賴性途徑，活化核酸內(nèi)切酶切割核DNA，導(dǎo)致核DNA片段斷裂，最終誘導(dǎo)保衛(wèi)細(xì)胞凋亡。

4 結(jié) 論

土荊芥揮發(fā)油具有細(xì)胞毒性，導(dǎo)致玉米保衛(wèi)細(xì)胞的核形態(tài)改變，細(xì)胞活性減低，其作用機(jī)制可能通過誘導(dǎo)保衛(wèi)細(xì)胞內(nèi)ROS和NO爆發(fā)，激活質(zhì)膜Ca2+通道，引發(fā)胞內(nèi)Ca2+增加，從而介導(dǎo)保衛(wèi)細(xì)胞發(fā)生Caspase依賴性的細(xì)胞凋亡。