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        黃芪散對(duì)肥胖模型大鼠脛骨骨結(jié)構(gòu)的研究

        2019-06-11 11:31:38王芳陳珺曾煦欣陳艷芬李衛(wèi)民
        中國骨質(zhì)疏松雜志 2019年5期
        關(guān)鍵詞:松質(zhì)骨骨量小梁

        王芳 陳珺 曾煦欣 陳艷芬 李衛(wèi)民

        1.廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院,廣東 廣州 510006 2.廣東藥科大學(xué)生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院,廣東 廣州 510006 3.佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院口腔醫(yī)學(xué)院(醫(yī)藥工程學(xué)院),廣東 佛山 528000 4.廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院,廣東 廣州 510006

        對(duì)非肥胖個(gè)體和肥胖個(gè)體骨折發(fā)生率的研究表明,由體質(zhì)量指數(shù)(body mass index,BMI)定義的肥胖對(duì)機(jī)體的影響是矛盾復(fù)雜的,有時(shí)肥胖會(huì)表現(xiàn)出增加某些部位骨折發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn),有時(shí)對(duì)機(jī)體又表現(xiàn)出保護(hù)作用[1]。黃芪散是收錄在《圣濟(jì)總錄》中治療消渴病的傳統(tǒng)制劑,含3種中藥材,分別為黃芪[Astragalus membranaceus(Fisch) Bunge]、葛根[Pueraria lobata(Willd.)Ohwi]、桑白皮(Morus alba L)。前期研究已證實(shí)其有降低體脂、體質(zhì)量的作用,并對(duì)糖尿病性骨質(zhì)疏松有一定預(yù)防作用[2]。但對(duì)肥胖模型動(dòng)物脛骨骨結(jié)構(gòu)生長的影響尚待進(jìn)一步研究。骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)是一個(gè)對(duì)骨微觀結(jié)構(gòu)、骨重建和骨代謝情況進(jìn)行定量評(píng)價(jià)的研究方法,可幫助了解藥物對(duì)骨的藥理作用及產(chǎn)生影響的機(jī)制。本次實(shí)驗(yàn)采用高脂飲食誘導(dǎo)肥胖模型,用骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)方法考察黃芪散對(duì)肥胖狀態(tài)下脛骨生長的影響,為進(jìn)一步探討黃芪散對(duì)體內(nèi)脂骨代謝的調(diào)節(jié)作用鋪墊基礎(chǔ)。

        1 材料與方法

        1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

        SPF級(jí)健康SD大鼠,180~200 g,7周齡,雄性,由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SYXK 2012-0125。共50只。大鼠飼養(yǎng)于SPF級(jí)動(dòng)物室,喂飼全價(jià)顆粒飼料。飼養(yǎng)條件:每12 h 明暗循環(huán),溫度21 ℃~23 ℃,濕度為50%~80%。

        1.2 藥品與試劑

        黃芪、葛根、桑白皮藥材均購自廣州中醫(yī)藥大學(xué)大藥房有限公司(批號(hào)160115);黃芪散浸膏由廣州中醫(yī)藥大學(xué)科技園制備,每1 g相當(dāng)于生藥1.71 g,密度1.22(50 ℃)。甲基丙烯酸甲酯(成都市科龍化工試劑廠,批號(hào)2015122201);鄰苯二甲酸二丁酯(成都市科龍化工試劑廠,批號(hào)20130215);過氧化苯甲酰(天津市大茂化學(xué)試劑廠,批號(hào)20160321);無水氯化鈣(成都市科龍化工試劑廠,批號(hào)2014082201);氫氧化鈉(廣東光華科技股份有限公司,20130123);Toluidine Blue(Sigma Chemical Co., USA,Pcode:101745482);Hematoxylin(Sigma Chemical Co., USA,Pcode:1000936724);Poncean Xylidine(Sigma Chemical Co., USA,Pcode:1001223780);Acid Fuchsin(Sigma Chemical Co., USA,Pcode:1001259386);Phosphotungstic acid hydrate(Sigma Chemical Co., USA,Pcode:1001181095);Orange G (Sigma Chemical Co., USA,Pcode:1001253540);Light Green SF Yellowish(Sigma Chemical Co., USA,Pcode:1001127925);2-Methyloxethyl acetate(纖溶劑) (Sigma Chemical Co., USA,Pcode:1001067000);高脂飼料購自于廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,包括20%蔗糖、1.2%膽固醇、20%豬油、10%酪蛋白、0.6%磷酸氫鈣、0.4%石粉和47.8%基礎(chǔ)飼料(NO.D12492,SXCK 2013-0002)。

        1.3 儀器

        AE240電子天平(梅特勒-托利多儀器公司上海分公司);XSZ-0800生物顯微鏡(廣西梧州市光學(xué)儀器廠);游標(biāo)卡尺(湛江市量具刃具廠);電熱恒溫電烤箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠);炭化鎢鋼刀(德國LEICA);LEICA2155硬組織切片機(jī)(德國LEICA);低速鋸(Buehler LTD.USA);JB-2型恒溫磁力攪拌器(上海雷磁儀器廠新涇分廠);Y-FL型熒光顯微鏡(日本Nikon);YM-Ⅲ型石膏打磨機(jī)(西北醫(yī)療儀器集團(tuán)有限公司);DHG-9097型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海醫(yī)用恒溫設(shè)備廠);光鏡和熒光顯微鏡(日本Nikon);數(shù)字化板(SummaSketchRIiplus);LEICA MP30熒光顯微鏡及顯微照相機(jī)(德國LEICA);LEICA QWN 半自動(dòng)圖象分析儀(德國LEICA)。

        1.4 方法

        1.4.1肥胖模型大鼠的制備,動(dòng)物分組及給藥:取7周齡SD大鼠50只,適應(yīng)1周后,隨機(jī)均分為5組:正常組、高脂模型組、陽性對(duì)照組(立普妥)、黃芪散低劑量組、黃芪散高劑量組。正常組喂基礎(chǔ)飼料,其余組喂高脂飼料,高脂飼料持續(xù)喂養(yǎng)7周以形成肥胖模型。藥物組從第8 周開始灌胃給藥,持續(xù)給藥15周。黃芪散低劑量組劑量為1.2 g/(10 mL·kg),高劑量組劑量為2.4 g/(10 mL·kg),均混懸于10 mL0.5%阿拉伯膠樹膠中;按劑量灌胃給藥。立普妥組劑量為2 mg/kg Lipitor?。體重每兩周監(jiān)測一次。

        1.4.2樣本取材方法:每只大鼠處死前第14、13天和第4、3天(處死當(dāng)天為第0天倒推)分別皮下注射鈣黃綠素5 mg/kg,進(jìn)行熒光標(biāo)記,骨表面形成綠色雙熒光標(biāo)志,可反映骨骼動(dòng)態(tài)變化情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)束前1天禁食。次日處死大鼠,分離左側(cè)脛骨上段松質(zhì)骨(proximal tibia metaphyses,PTM)及中段皮質(zhì)骨(tibial cortex,TX),備做不脫鈣骨切片,行骨形態(tài)計(jì)量學(xué)分析。

        1.4.3骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)的測定:按文獻(xiàn)[3]操作。

        1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

        2 結(jié)果

        2.1 黃芪散對(duì)模型大鼠脛骨上段松質(zhì)骨靜態(tài)參數(shù)的影響

        與正常組相比,肥胖模型組大鼠脛骨上段骨小梁面積百分?jǐn)?shù)(Tb.Ar%)(P<0.05)、骨小梁寬度(Tb.Th)顯著減少(P<0.05),骨小梁數(shù)目(Tb.N)減少,骨小梁分離度(Tb.Sp)增加。與模型組相比,黃芪散低劑量組、高劑量組脛骨上段的Tb.Ar%、Tb.Th、Tb.N 均增加,其中黃芪散高劑量組Tb.Ar%、Tb.Th均顯著增加(P<0.01,P<0.05)。見表1。

        由各組動(dòng)物脛骨松質(zhì)骨的切片染色圖可看出,模型組較正常組骨小梁稀疏,立普妥組和模型組骨小梁分布接近,黃芪散高低劑量組骨小梁略為密集,尤其高劑量組骨小梁間隙明顯減小。見圖1。

        表1 各組大鼠脛骨上段松質(zhì)骨靜態(tài)學(xué)參數(shù)的測定結(jié)果Table 1 Effect of HQS on static histomophometric parameters of PTM in each n=8)

        注:與正常組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05,##P<0.01。

        圖1 肥胖模型各組大鼠脛骨上段5 μm切片Massson-Goldner Trichrome 染色(放大倍數(shù)為10×1.25) A:正常組,B:模型組,C:立普妥組,D:黃芪散高劑量組,E:黃芪散低劑量組Fig.1 The 5 μm section of proximal tibial in obese rats with Masson-Goldner Trichrome staining (10×1.25). A: Normal group, B: Model group, C: Lipitor group, D: Low-dose HQS group, E: High-dose HQS group

        2.2 黃芪散對(duì)模型大鼠脛骨上段松質(zhì)骨動(dòng)態(tài)參數(shù)的影響

        與正常組相比,立普妥組無明顯差異;模型組大鼠脛骨上段松質(zhì)骨骨熒光標(biāo)記周長百分?jǐn)?shù)(L.Pm%)、礦化沉積率(MAR)、骨表面新骨形成率(BFR/BS)、骨轉(zhuǎn)換率(BFR/BV)均有所上升,新骨年形成率(BFR/TV)降低,但差異均不顯著。黃芪散高低劑量組各項(xiàng)指標(biāo)都低于正常組,且高劑量組骨轉(zhuǎn)換率較正常組明顯降低(P<0.01)。與模型組相比,陽性藥物組無顯著差異;黃芪散高低劑量組各個(gè)動(dòng)態(tài)學(xué)參數(shù)值均有所降低,特別是骨轉(zhuǎn)換率都顯著降低(P<0.01)。見表2。

        表2 各組大鼠上段松質(zhì)骨動(dòng)態(tài)學(xué)參數(shù)測定結(jié)果Table 2 Effect of HQS on PTM dynamic histomophometric parameters of obese

        注:與模型組比較,##P<0.01。

        綠色熒光為鈣黃綠素的雙熒光標(biāo)志,可以看出,正常組脛骨組織熒光分布清晰明亮,熒光彌散分布較多,連續(xù)性好;模型組熒光強(qiáng)度較強(qiáng),熒光分布連續(xù),熒光帶較寬;黃芪散兩個(gè)劑量組熒光強(qiáng)度都較模型組弱,熒光帶較窄。立普妥組與正常組熒光強(qiáng)度及寬度差異不大。見圖2。

        圖2 大鼠脛骨上段45 μm切片熒光標(biāo)記(放大倍數(shù)為10) A:正常組,B:模型組,C:立普妥組,D:黃芪散高劑量組,E:黃芪散低劑量組Fig.2 Fluorescent of 45 μm section of PTM in rats (×10). A: Normal group, B: Model group, C: Lipitor group, D: Low-dose HQS group, E: High-dose HQS group

        2.3 對(duì)模型大鼠脛骨中段皮質(zhì)骨靜態(tài)參數(shù)的影響

        與正常組相比,模型組大鼠脛骨皮質(zhì)骨皮質(zhì)面積百分?jǐn)?shù)(Ct.Ar%)明顯增加(P<0.05),骨髓面積百分?jǐn)?shù)(Ma.Ar%)明顯減小(P<0.05);立普妥組Ct.Ar%有所增加,但影響不顯著;黃芪散低劑量組差異均不顯著;黃芪散高劑量組Ct.Ar%、骨外膜參數(shù)(PL.Pm)增加,但不顯著,Ma.Ar%明顯減少(P<0.05)。見表3、圖3。

        表3 各組大鼠脛骨中段皮質(zhì)骨靜態(tài)學(xué)參數(shù)的測定結(jié)果Table 3 Effect of HQS on static histomophometric parameters of TX in each

        注:與正常組比較,*P<0.05。

        圖3 大鼠脛骨中段45 μm切片(放大倍數(shù)為10) A:正常組,B:模型組,C:立普妥組,D:黃芪散高劑量組,E:黃芪散低劑量組Fig.3 The 45 μm section of TX in rats (×10). A: Normal group, B: Model group, C: Lipitor group, D: Low-dose HQS group, E: High-dose HQS group

        2.4 黃芪散對(duì)模型大鼠脛骨中段皮質(zhì)骨動(dòng)態(tài)參數(shù)的影響

        與正常組相比,其余各組骨外膜面骨礦化沉積率(P-MAR)有增加的趨勢(shì),以黃芪散高劑量組P-MAR值最高;模型組骨外膜面骨形成率有所降低,其余各組均高于正常組,且以黃芪散高劑量組作用明顯(P<0.01)。見表4、圖4。

        表4 各組大鼠脛骨中段皮質(zhì)骨動(dòng)態(tài)學(xué)參數(shù)的測定結(jié)果Table 4 Effect of HQS on the middle cortical dynamic histomophometric parameters in each

        注:與正常組比較,**P<0.01;與模型組比較,#P<0.05,##P<0.01。

        圖4 大鼠脛骨中段45 μm切片熒光標(biāo)記(放大倍數(shù)為10) A:正常組,B:模型組,C:立普妥組,D:黃芪散高劑量組,E:黃芪散低劑量組Fig.4 Fluorescent of 45 μm section of TX in rats (× 10). A: Normal group, B: Model group, C: Lipitor group, D: Low-dose HQS group, E: High-dose HQS group

        3 討論

        Tb.Ar%是反映骨量變化的重要指標(biāo),Tb.Th、Tb.N 和Tb.Sp則是反映微觀鏡下骨小梁結(jié)構(gòu)的綜合指標(biāo)。由表1和圖1的結(jié)果可見,以上參數(shù)值說明肥胖可致模型大鼠脛骨上段松質(zhì)骨結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化,呈現(xiàn)骨質(zhì)疏松狀態(tài)。黃芪散可抑制肥胖對(duì)大鼠脛骨上段松質(zhì)骨產(chǎn)生骨丟失的影響。陽性藥立普妥組較正常組與模型組結(jié)果均無顯著性差異。由表2和圖2結(jié)果可見,肥胖造模并未導(dǎo)致大鼠成骨細(xì)胞活性明顯降低,脛骨上段骨形成較強(qiáng),骨的更新轉(zhuǎn)換率較快;黃芪散減弱了此作用,其影響可能因?yàn)橐种乒俏盏陌l(fā)生。由表3和圖3結(jié)果可見,肥胖可能促進(jìn)模型大鼠的脛骨中段皮質(zhì)骨生長,且黃芪散高劑量組對(duì)脛骨中段皮質(zhì)骨有促生長作用。由圖4和表4結(jié)果可見,骨外膜面3個(gè)參數(shù)結(jié)果都表明肥胖對(duì)模型大鼠脛骨中段皮質(zhì)骨的骨形成速度無顯著影響,黃芪散可促進(jìn)肥胖模型大鼠脛骨中段皮質(zhì)骨橫向生長,骨的橫徑生長增大增粗,這與促進(jìn)皮質(zhì)骨的骨外膜面骨形成可能有關(guān)。

        本實(shí)驗(yàn)選取的大鼠均為雄性,未采用雌性動(dòng)物,因考慮雌性鼠隨生長期成熟期飼養(yǎng)時(shí)間的延長,會(huì)出現(xiàn)絕經(jīng)期后骨質(zhì)疏松等癥狀,會(huì)干擾實(shí)驗(yàn)考察肥胖對(duì)骨造成的影響。骨量的變化及骨的微觀結(jié)構(gòu)改變是常??疾旃怯绊懙闹笜?biāo)。骨量的丟失體現(xiàn)在松質(zhì)骨和皮質(zhì)骨,本實(shí)驗(yàn)取材均為大鼠脛骨部位,而沒有選用股骨或椎骨,可分別考察肥胖對(duì)脛骨上段松質(zhì)骨和中段皮質(zhì)骨的影響。

        骨形態(tài)計(jì)量學(xué)的相關(guān)參數(shù)是由美國骨與礦物質(zhì)研究學(xué)會(huì)制定的標(biāo)準(zhǔn),包括靜態(tài)參數(shù)和動(dòng)態(tài)參數(shù)。靜態(tài)參數(shù)可反映形態(tài)學(xué)觀察到的骨組織結(jié)構(gòu)變化,是關(guān)系骨量和骨結(jié)構(gòu)變化的重要指標(biāo)。骨小梁面積百分?jǐn)?shù)、骨小梁寬度和骨小梁數(shù)目的數(shù)值越高則反映骨量越多,骨小梁分離度越大,代表骨小梁之間距離越大,骨越疏松。皮質(zhì)骨骨面積越大,皮質(zhì)骨髓面積越小,代表皮質(zhì)骨橫徑生長增強(qiáng)。通常情況下,這些指標(biāo)出現(xiàn)變化時(shí)才對(duì)動(dòng)態(tài)參數(shù)進(jìn)行進(jìn)一步的測定和分析[4]。從各項(xiàng)參數(shù)上可看出,黃芪散有利于肥胖狀態(tài)下骨骼強(qiáng)度的維持或增強(qiáng)。

        利用四環(huán)素或鈣黃綠素能與骨特異結(jié)合并沉積在骨礦化前沿的特性,骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)中常采用活體四環(huán)素或鈣黃綠素雙標(biāo)記法,在動(dòng)物處死前10 d與0 d兩次將熒光劑注射于動(dòng)物皮下部位,從而標(biāo)記在骨重建過程中,可動(dòng)態(tài)地觀察骨組織的變化,獲取動(dòng)態(tài)參數(shù)信息[5],如骨礦化沉積率、骨表面新骨形成率、骨外膜面骨形成率、骨外膜面骨礦化沉積率等骨動(dòng)力學(xué)指標(biāo),反映骨形成的情況。骨礦化沉積率越大表明骨小梁表面礦化層形成的速度越快,骨表面新骨形成率、骨轉(zhuǎn)換率和新骨年形成率都是反映單位時(shí)間內(nèi)單位骨面形成新的骨量的速度,以365 d為單位,骨組織面積、骨小梁周長、骨小梁面積和骨內(nèi)外膜面積為不同骨面的礦化骨量。從各項(xiàng)參數(shù)上可以看出,肥胖導(dǎo)致模型動(dòng)物骨轉(zhuǎn)換率增加。黃芪散對(duì)脛骨松質(zhì)骨和皮質(zhì)骨的影響表現(xiàn)不同,松質(zhì)骨為骨低轉(zhuǎn)換狀態(tài),抑制骨吸收的發(fā)生。而皮質(zhì)骨則表現(xiàn)為促進(jìn)骨形成發(fā)生。

        Wong等[6]用高脂伴高碳水化合物飲食誘導(dǎo)代謝綜合癥考察大鼠骨密度、骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)、骨重建指標(biāo)的影響,發(fā)現(xiàn)代謝綜合癥(向心性肥胖、高血糖為指征)使得成骨細(xì)胞表面、類骨質(zhì)表面、類骨質(zhì)體積顯著降低,骨吸收陷窩表面顯著增加,骨小梁體積減少。代謝綜合癥會(huì)引起骨重建的不平衡,導(dǎo)致骨小梁結(jié)構(gòu)的退化。本次實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)高脂飲食會(huì)導(dǎo)致模型大鼠骨小梁結(jié)構(gòu)的退化,骨小梁數(shù)目減少,但對(duì)成骨細(xì)胞表面沒有明顯抑制作用。Lavet等[7]考察高脂高糖飲食對(duì)生長期(16周以前)和成熟期動(dòng)物骨的影響,發(fā)現(xiàn)在生長期的肥胖大鼠,脛骨松質(zhì)骨骨量會(huì)有所增加,而到成熟期的肥胖大鼠,松質(zhì)骨骨量則減??;脛骨中段皮質(zhì)骨的孔隙率在生長期會(huì)有所增加,在成熟期會(huì)增加更多。本次實(shí)驗(yàn)從購進(jìn)大鼠到實(shí)驗(yàn)結(jié)束,大鼠從生長期成長到處死時(shí)的成熟期,最終高脂飲食致使大鼠肥胖,脛骨松質(zhì)骨骨量減小,和文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果一致;但脛骨中段皮質(zhì)骨面積會(huì)增大,即使到成熟期也未見骨量的降低??紫堵适侵腹墙M織中為軟組織所充填的“腔隙部分[8]。一般認(rèn)為,孔隙率的增加,骨強(qiáng)度會(huì)隨著下降。孔隙率區(qū)分的是骨的腔隙和固體基質(zhì),而礦化指標(biāo)是反映骨的礦物質(zhì)部分,對(duì)反映骨剛度有較大影響。本實(shí)驗(yàn)未測定孔隙率,測定了骨礦化沉積率,兩者都是反映骨材料特性的參數(shù)。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)高脂飲食造成的肥胖會(huì)引起脛骨松質(zhì)骨的骨礦化沉積率提高,而黃芪散藥物組都會(huì)降低其值,即減弱骨形成的發(fā)生。這與一般的預(yù)期值不同,但與黃芪散降低動(dòng)物體重、體脂系數(shù)等影響還是有較大關(guān)聯(lián)。前期實(shí)驗(yàn)[9]筆者研究了黃芪散對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向脂肪細(xì)胞和成骨細(xì)胞分化的實(shí)驗(yàn)考察,隨著藥物濃度的增加,成骨方向的分化趨勢(shì)會(huì)更明顯,成脂方向的分化趨勢(shì)會(huì)減弱,這與本實(shí)驗(yàn)黃芪散明顯的抑制脂肪生成作用一致,但對(duì)成骨細(xì)胞的骨形成作用沒有表現(xiàn)明顯的促進(jìn)作用,有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證及機(jī)理研究。

        4 結(jié)論

        本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出,肥胖可導(dǎo)致大鼠脛骨松質(zhì)骨骨轉(zhuǎn)換加強(qiáng),呈現(xiàn)成骨、破骨活躍,骨小梁變窄,骨小梁面積變小。而立普妥對(duì)肥胖引起的骨質(zhì)疏松態(tài)沒有改善作用。黃芪散可以通過抑制松質(zhì)骨骨吸收和降低成骨作用,達(dá)到拮抗骨質(zhì)疏松的作用。實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)了黃芪散也可以促進(jìn)皮質(zhì)骨骨形成,達(dá)到了改善骨質(zhì)量的治療目的。因此,黃芪可能通過抑制骨吸收作用和促進(jìn)骨外膜骨形成作用來抑制肥胖造成的骨質(zhì)疏松。

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