張峻瑋 李琰 薛海鵬 李朝輝 聶偉志 徐展望*

1.山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟(jì)南 250014 2.山東省文登整骨醫(yī)院，山東 文登 260014 3.山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，山東 濟(jì)南 250014

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)是一種以骨量減低、骨細(xì)微結(jié)構(gòu)退化，骨強(qiáng)度降低為特征的骨代謝疾病。2010-2016年，我國老年人的整體發(fā)病率是36%，而在絕經(jīng)后老年女性的發(fā)病率高達(dá)49%[1]，嚴(yán)重影響中老年人的健康。骨碎補(bǔ)是一味治療骨質(zhì)疏松的常用中藥，可以促進(jìn)成骨[2-3]；也可以抑制破骨細(xì)胞的分化及成熟[4]，但具體作用機(jī)制尚不完全明確。在本實(shí)驗(yàn)中，筆者研究骨碎補(bǔ)對(duì)去卵巢大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrowstromal cells，BMSCs)Wnt/β-Catenin及OPG/RANKL/RANK信號(hào)通路的影響，及其對(duì)破骨細(xì)胞分化、成熟的作用，并探討其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

分離BMSCs用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，為6月齡健康雌性SD大鼠(SPF級(jí))，體重(315.12±8.96) g，誘導(dǎo)培養(yǎng)破骨細(xì)胞用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，為出生14～20 d的SD大鼠。均購自朋悅(濟(jì)南)公司，合格證號(hào)：SCXK(魯)20140007。

1.2 試劑耗材

低糖DMEM培養(yǎng)基(DMEM-LG)(美國Hyclone公司)、胎牛血清(FBS)(美國Hyclone 公司)、0.25%胰蛋白酶+0.02% EDTA(美國Hyclone 公司)、TRIpure Reagent(批號(hào)231527AX，北京艾德萊生物科技有限公司)、Wnt10b、β-Catenin、OPG、RANKL及GAPDH抗體(Abcam公司)、辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(北京中杉金橋)、伊紅染色液、蘇木素染色液(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)、OPG、RANKL ELISA試劑盒(武漢基因美公司)、大鼠破骨細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基、大鼠破骨細(xì)胞完全培養(yǎng)基(武漢普諾賽公司)。

1.3 主要儀器設(shè)備

研究用萬能級(jí)顯微鏡(OLYMPUS，日本奧林巴斯公司)、CO2培養(yǎng)箱(上海力康發(fā)展有限公司)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀(LightCy-cler480II，瑞士)、酶聯(lián)免疫儀(Biotek Elx800，美國伯騰儀器有限公司)，微量紫外可見光分光光度計(jì)(凱奧/K5600，北京凱奧科技發(fā)展有限公司)、溫度梯度PCR儀(TP600，日本TAKARA)、垂直蛋白電泳儀(VE-18618，上海天能)、流式細(xì)胞儀(FACSVE RSE，美國BD)、多色熒光成像系統(tǒng)(Fusion Fx7，法國VILBER)、Transwell 小室(北京康寧公司，中國)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1動(dòng)物分組、造模及鑒定：背側(cè)雙切口切除雙側(cè)卵巢建立骨質(zhì)疏松模型[5]，假手術(shù)組僅摘除卵巢周圍少量脂肪組織。術(shù)后適應(yīng)性飼養(yǎng)8周，健康大鼠隨機(jī)分為3組，各組16只，分為實(shí)驗(yàn)組(OVXDF)、模型組(OVX)、假手術(shù)組(SHAM)。實(shí)驗(yàn)組參考本課題組前期實(shí)驗(yàn)[3]，根據(jù)動(dòng)物與人體的每千克體重劑量折算后，按照4.8 g/只劑量給予骨碎補(bǔ)水煎液灌胃(相當(dāng)于人體千克體重每日用藥的10倍)，模型組及假手術(shù)組用0.9%生理鹽水3.0 mL/只灌胃，每日兩次，連續(xù)12周。灌胃結(jié)束時(shí)將大鼠麻醉，使用MEDILINK-MEDIX90骨密度儀自帶軟件測量大鼠L4～5、雙側(cè)股骨骨密度。

1.4.2BMSCs的分離培養(yǎng)、形態(tài)觀察及鑒定：(1)BMSCs分離及培養(yǎng)。采用全骨髓貼壁篩選法進(jìn)行BMSCs的分離及培養(yǎng)，倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞增殖及形態(tài)變化并拍照，待原代細(xì)胞增殖到90%融合時(shí)，按1∶3比例進(jìn)行傳代，繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞增殖到90%融合時(shí)，再次傳代培養(yǎng)。(2)BMSCs鑒定。取各組融合狀況優(yōu)良的P3代BMSCs，消化、離心，棄上層液體，無菌PBS漂洗2遍，用2 mL PBS重懸細(xì)胞，平均分配到3個(gè)1.5 mL的EP管中，一管不加任何抗體作空白對(duì)照，另兩管分別加入抗體CD44(Alexa Fluor 647)2 μL、CD45(FITC)2 μL并做好標(biāo)記，4 ℃避光孵育35 min，1 000 r/min，4 ℃，離心5 min，無菌PBS清洗2遍后，制成500 μL單細(xì)胞懸液，移入專用管中，上機(jī)分析CD44、CD45表達(dá)情況。

1.5 BMSCs與破骨細(xì)胞共培養(yǎng)體系的建立

采用分離骨髓單核細(xì)胞的方法獲得破骨細(xì)胞前體細(xì)胞，將出生14～20 d的實(shí)驗(yàn)大鼠斷頸處死，取股骨和脛骨，剪開骨髓腔，用MEMα培養(yǎng)基多次沖洗，收集沖洗液，反復(fù)吹打，收集濾液，離心后棄上清液，保留細(xì)胞沉淀。將4 mL大鼠淋巴細(xì)胞分離液加入到離心管，其上加入已用4 mL MEMα重懸細(xì)胞沉淀；離心后吸取中間白膜層細(xì)胞到15 mL離心管內(nèi)，加入10 mL PBS 稀釋，再次離心，棄上清，保留細(xì)胞沉淀，用大鼠破骨細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀，按2×103/cm2種于6孔板的Transwell下室以破骨細(xì)胞誘導(dǎo)劑培養(yǎng)。將上述80%細(xì)胞融合的間充質(zhì)干細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，以1×104/cm2加入6孔板上的Transwell上室進(jìn)行培養(yǎng)。下室于共培養(yǎng)第3、5、7天以破骨細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基重?fù)Q液，第9天更換大鼠破骨細(xì)胞完全培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，此后每3 d換藥一次。上室以BMSCs培養(yǎng)液同步換液。根據(jù)BMSCs來源將共培養(yǎng)細(xì)胞分為：實(shí)驗(yàn)組+破骨細(xì)胞(OVXDF+OC)、模型組+破骨細(xì)胞(OVX+OC)、假手術(shù)組+破骨細(xì)胞(SHAM+OC)。

1.6 破骨細(xì)胞形態(tài)觀察、鑒定及計(jì)數(shù)

共培養(yǎng)后第3、7、12、16天于倒置相差顯微鏡下觀察下室細(xì)胞形態(tài)。共培養(yǎng)后第12天對(duì)下室細(xì)胞進(jìn)行HE及TRAP染色(根據(jù)TRAP染色染色試劑盒說明)。

1.7 酶聯(lián)免疫吸附劑測定(ELISA)檢測共培養(yǎng)體系中的OPG、RANKL情況

共培養(yǎng)后第12天，收集Transwell下室細(xì)胞上清液，分別按照OPG、RANKL的ELISA試劑盒說明書操作，于450 nm波長檢測各孔的光密度值并代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算蛋白質(zhì)表達(dá)水平。

1.8 實(shí)時(shí)熒光定量PCR觀察BMSCs Wnt10b、β-catenin、RANKL、OPG mRAN及RANKL/OPG

共培養(yǎng)后第12天后，收集Transwell上室BMSCs，提取總RNA并檢測純度達(dá)標(biāo)，取羅氏反轉(zhuǎn)錄試劑盒，按步驟冰上依次配置各組RNA反轉(zhuǎn)錄體系并于PCR儀中反應(yīng)合成cDNA, 配置20 μL總體積的PCR反應(yīng)體系(SYBR GreenⅠ10 μL，上游引物和下游引物各0.5 μL，cDNA 2 μL，DEPC水7 μL)在LightCycler?480設(shè)備中進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)條件：①預(yù)變性：95 ℃ 10 min 1個(gè)循環(huán)；擴(kuò)增循環(huán)：②擴(kuò)增 95 ℃ 10 s；③退火55 ℃ 10 s；④延伸72 ℃ 20 s，②至④為45個(gè)循環(huán)；溶解曲線：⑤95 ℃ 5s；⑥65 ℃ 60 s；⑦97 ℃ continous，⑤至⑦為1個(gè)循環(huán)；保溫：40 ℃ 10 s 1個(gè)循環(huán)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，導(dǎo)出記錄各樣本的ct值，在Excel中以β-actin作為內(nèi)參基因?qū)Ω鹘M待測樣品進(jìn)行RNA總量校正，采用2-ΔΔct法計(jì)算各組基因的相對(duì)表達(dá)量，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。目標(biāo)基因引物序列見表1。

1.9 蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)觀察Wnt10b、β-Catenin、RANKL、OPG的情況

共培養(yǎng)后第12天，收集Transwell上室BMSCs，消化、離心、重懸、再離心，去上清，入含PMSF的裂解液，冰上持續(xù)裂解30 min，離心取上清，BCA法測定蛋白濃度，添加蛋白上樣緩沖液(5×)，水浴鍋100 ℃煮沸10 min，冰上降溫，稍離心，-20 ℃保存，制備凝膠，依次進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，封閉，用稀釋后的Wnt10b、β-Catenin、OPG、RANKL、GAPOH抗體，搖床震蕩1 h后，4 ℃條件下過夜，次日洗滌后二抗孵育1 h，洗滌，加入顯影液孵育2 min，在Bio-Rad凝膠成像分析系統(tǒng)中曝光保存圖像后，通過Image J軟件對(duì)蛋白條帶進(jìn)行分析。

1.10 統(tǒng)計(jì)分析方法

2 結(jié)果

2.1 骨密度檢查結(jié)果

灌胃12周后，OVX、OVXDF組大鼠L4～5及雙側(cè)股骨骨密度較SHAM組明顯下降，以O(shè)VX組最低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明造模成功(見圖1)。

2.2 BMSCs形態(tài)觀察及鑒定

2.2.1BMSCs形態(tài)觀察：BMSCs培養(yǎng)至第3代時(shí)，細(xì)胞生長迅速，同時(shí)貼壁細(xì)胞成倍數(shù)增加，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到80%～90%融合時(shí)，其形態(tài)更加均一，呈纖維樣或?qū)挻蟊馄讲灰?guī)則樣，排列密集緊湊，呈放射狀或旋渦狀(見圖 2)。

圖1 大鼠L4～5及雙側(cè)股骨骨密度Fig.1 Bone mineral density L4-5 and the bilateral femurs in rats

圖2 各組大鼠BMSCs第3代細(xì)胞形態(tài) A：SHAM組，B：OVXDF組，C：OVX組Fig.2 The cell morphology of the third passage of BMSCs in rats of each group. A: SHAM; B: OVXDF; C: OVX

2.2.2流式細(xì)胞儀檢測：經(jīng)流式分析檢測，結(jié)果顯示三組BMSCs CD44的表達(dá)率為陽性，CD45的表達(dá)率為陰性。結(jié)合培養(yǎng)時(shí)細(xì)胞形態(tài)學(xué)的觀察，說明本實(shí)驗(yàn)采用全骨髓分離培養(yǎng)方法得到的BMSCs純度較高，質(zhì)量可靠。見圖 3。

圖3 流式細(xì)胞儀鑒定結(jié)果Fig.3 Results of flow cytometry注：CD44表達(dá)陽性，CD45表達(dá)陰性。

2.3 破骨細(xì)胞的形態(tài)觀察及鑒定

2.3.1破骨細(xì)胞活體觀察：倒置相差顯微鏡顯示下室內(nèi)單核細(xì)胞隨著培養(yǎng)時(shí)間的延續(xù)逐漸融合呈周圍有偽足，胞漿有空泡的多核細(xì)胞，數(shù)量逐漸增多，體積及細(xì)胞核數(shù)增多，在混合培養(yǎng)后第7～9天達(dá)到高峰。三組比較OVX+OC多核細(xì)胞出現(xiàn)最早，個(gè)數(shù)最多，凋亡時(shí)間最晚， OVXDF+OC組次之，SHAM+OC組最低。見圖4。

圖4 破骨細(xì)胞的形態(tài)觀察 A：SHAM+OC組，B：OVXDF+OC組，C：OVX+OC組Fig.4 Morphological observation of osteoclasts. A: SHAM+OC; B: OVXDF+OC; C: OVX+OC

2.3.2破骨細(xì)胞的鑒定及計(jì)數(shù)：HE染色可見破骨細(xì)胞呈淺粉紅色，體積較大，胞漿顆粒均勻、細(xì)小，核仁染色呈淺藍(lán)色，可見多個(gè)細(xì)胞核，細(xì)胞膜周圍可見偽足(圖5A)。TRAP染色觀察見破骨細(xì)胞體積較大，呈酒紅色，胞質(zhì)均勻，可見多核，核呈藍(lán)色。周圍可見偽足(圖5B)。TARP染色(+)、細(xì)胞核內(nèi)可見多核，表明誘導(dǎo)所得細(xì)胞為破骨細(xì)胞。

在200倍鏡下隨機(jī)分析10個(gè)視野的TRAP(+)且胞內(nèi)≥3個(gè)細(xì)胞核的多核細(xì)胞數(shù)，顯示與去卵巢后灌胃大鼠BMSCs共培養(yǎng)的破骨細(xì)胞(OVXDF+OC)數(shù)量較單純模型組+破骨細(xì)胞(OVX+OC)明顯減少。三組比較，SHAM+OC組

圖5 破骨細(xì)胞鑒定及計(jì)數(shù)Fig.5 Identification and counting of osteoclasts

2.4 Transwell下室培養(yǎng)液中OPG、RANKL的含量

模型組+破骨細(xì)胞(OVX+OC)中抑制骨吸收的OPG含量最低，促進(jìn)破骨細(xì)胞分化及成熟的RANKL含量最高。經(jīng)骨碎補(bǔ)灌胃后(OVXDF+OC)，OPG含量明顯升高，RANKL含量明顯降低。三組比較，OPG含量：SHAM+OC組>OVXDF+OC組>OVX+OC組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；RANKL含量：SHAM+OC組

圖6 各組大鼠OPG、RANKL含量Fig.6 The content of OPG, RANKL in rats of each group

2.5 BMSCs中Wnt10b、β-catenin OPG、RANKL mRNA測量

模型組+破骨細(xì)胞(OVX+OC)中Wnt10b、β-catenin、OPG mRNA相對(duì)量最低，RANKL mRNA相對(duì)量及RANKL/OPG最高，灌胃后(OVXDF+OC)Wnt10b、β-catenin、OPG mRNA升高，RANKL mRNA、RANKL/OPG降低。三組比較，Wnt10b、β-catenin、OPG mRNA：SHAM+OC組>OVXDF+OC組>OVX+OC組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。RANKL mRNA、RANKL/OPG：SHAM+OC組

圖7 各組大鼠Wnt10b、β-catenin、OPG、RANKL mRNA表達(dá)Fig.7 mRNA expression of Wnt10b, beta-catenin, OPG, and RANKL in rats of each group

2.6 BMSCs中Wnt10b、β-catenin、OPG、RANKL蛋白表達(dá)情況

模型組+破骨細(xì)胞(OVX+OC)中Wnt10b、β-catenin、OPG蛋白表達(dá)最低，RANKL蛋白表達(dá)及RANKL/OPG最高，灌胃后(OVXDF+OC)Wnt10b、β-catenin、OPG蛋白表達(dá)升高，RANKL蛋白表達(dá)及RANKL/OPG降低。三組比較，Wnt10b、β-catenin、OPG蛋白表達(dá)：SHAM+OC組>OVXDF+OC組>OVX+OC組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。RANKL蛋白表達(dá)及RANKL/OPG：SHAM+OC組

3 討論

3.1 BMSCS與骨質(zhì)疏松癥

圖8 各組大鼠Wnt10b、β-catenin、OPG、RANKL 蛋白表達(dá)Fig.8 Protein expression of Wnt10b, beta-catenin, OPG, and RANKL in rats of each group

隨著老齡社會(huì)的到來，骨質(zhì)疏松癥已成為世界性健康問題，其原因在于骨形成與骨吸收之間的失耦聯(lián)。既往對(duì)骨質(zhì)疏松癥的研究多集中在成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞及其相互關(guān)系[6]，隨著研究的深入，與成骨細(xì)胞及破骨細(xì)胞共存于骨骼微環(huán)境中的BMSCs對(duì)骨代謝的作用逐漸得到重視[7-9]。BMSCs是一種具有多種分化潛能的成纖維樣細(xì)胞，在不同微環(huán)境下具有向成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞及軟骨細(xì)胞分化的能力，有骨修復(fù)潛能[10]，在此過程中，Wnt/β-catenin信號(hào)通路起重要作用。研究表明，激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路可提高成骨關(guān)鍵因子RUNX2的表達(dá)[11-12]，促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化[13]，抑制其成脂及成軟骨分化。同時(shí)，BMSCs還可通過多種途徑調(diào)控破骨細(xì)胞的分化、成熟及活性[14-16]，其中，OPG/RANKL/RANK信號(hào)通路是重要途徑之一。OPG和核因子κB受體活化因子配體(receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL)主要由成骨細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分泌。RANKL可以與破骨細(xì)胞膜上的核因子κB受體活化因子(receptor activator of nuclear factor-KB，RANK)相結(jié)合，激活RANKL/RANK信號(hào)通路，調(diào)控破骨細(xì)胞的分化、成熟及活性。OPG亦可以與RANK相結(jié)合，與RANKL相競爭性，阻斷RANKL/RANK信號(hào)通路的傳導(dǎo)，起到抑制破骨細(xì)胞的作用。研究表明，在無或低濃度破骨細(xì)胞誘導(dǎo)因子的情況下，BMSCs與破骨細(xì)胞前體細(xì)胞共同培養(yǎng)可促進(jìn)破骨細(xì)胞的形成[17]；而在高濃度破骨細(xì)胞誘導(dǎo)因子作用下，BMSCs對(duì)破骨細(xì)胞的分化、成熟起抑制作用[18]。表明BMSCs對(duì)破骨細(xì)胞具有雙重作用，而骨骼微環(huán)境會(huì)影響其對(duì)破骨細(xì)胞的調(diào)控。

3.2 骨碎補(bǔ)防治骨質(zhì)疏松

骨碎補(bǔ)為水龍科植物槲蕨 Drynaria fortunei(Kunze)J.Sm的干燥根莖，在祖國醫(yī)學(xué)中，首見于《藥性論》，其性味苦、溫，歸肝、腎經(jīng)，具有活血續(xù)傷、補(bǔ)腎強(qiáng)骨的功效，主治跌打損傷或創(chuàng)傷，筋骨損傷，瘀滯腫痛；以及腎虛腰痛腳弱，耳鳴耳聾，牙痛，久瀉等。常用劑量為9～20 g，是目前治療骨質(zhì)疏松癥常用中藥之一[19]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)其主要生物活性成分是黃酮類化合物，而柚皮苷又是其黃酮類化合物的主要成分[20]。研究表明，骨碎補(bǔ)及其提取物可通過改善微循環(huán)[21]，調(diào)節(jié)雌激素[22]、調(diào)節(jié)細(xì)胞的增值分化[23-24]及調(diào)節(jié)信號(hào)通路等多種機(jī)制，防治骨質(zhì)疏松。其中，Wnt/β-catenin和OPG/RANKL/RANK信號(hào)通路無疑是其調(diào)控的重要途徑。骨碎補(bǔ)及其提取物可以激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路，促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化，抑制其成脂分化[25-26]，通過OPG/RANKL/RANK調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞引起的骨吸收[27-28]。

3.3 骨碎補(bǔ)通過調(diào)節(jié)BMSCs分泌OPG、RANKL調(diào)控破骨細(xì)胞的分化成熟

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)OVX+OC組中破骨細(xì)胞出現(xiàn)最早，個(gè)數(shù)最多，凋亡時(shí)間最晚，OVXDF+OC組次之，SHAM+OC組最低。表明在存在破骨細(xì)胞誘導(dǎo)劑的情況下，與正常大鼠BMSCs相比，絕經(jīng)后大鼠BMSCs對(duì)破骨細(xì)胞分化成熟的抑制作用減弱，而經(jīng)骨碎補(bǔ)灌胃后的絕經(jīng)后大鼠BMSCs對(duì)破骨細(xì)胞的分化成熟的抑制作用得到加強(qiáng)，顯示骨碎補(bǔ)可以通過BMSCs來抑制破骨細(xì)胞的分化及成熟。共培養(yǎng)系統(tǒng)中上清液以及BMSCs內(nèi)，RANKL RANKL/OPG：SHAM+OC組OVXDF+OC組>OVX+OC組，表明絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松大鼠BMSCs內(nèi)及其分泌的OPG降低，而RANKL升高，RANKL/OPG比例升高，從而激活OPG/RANKL/RANK信號(hào)通路促進(jìn)破骨細(xì)胞的分化、成熟。經(jīng)骨碎補(bǔ)灌胃后，OPG升高，RANKL降低，RANKL/OPG比例降低，抑制OPG/RANKL/RANK信號(hào)通路，抑制破骨細(xì)胞的分化、成熟。同時(shí)，灌胃后大鼠BMSCs中Wnt10b及β-catenin mRAN及蛋白含量升高，提示在此過程中骨碎補(bǔ)同時(shí)激活了Wnt/β-catenin信號(hào)通路。雖然具體作用機(jī)制尚不明確[29]，但眾多研究表明Wnt/β-catenin通路的激活可升高OPG，降低RNAL[30-31]，因此，推測骨碎補(bǔ)調(diào)節(jié)BMSCs OPG及RANKL可能與Wnt/β-catenin通路的激活有關(guān)。由于OPG、RANKL的分泌受多種機(jī)制調(diào)控，實(shí)驗(yàn)過程中OPG、RANKL的變化是否僅僅由Wnt/β-catenin信號(hào)通路的激活引起，是否有其他機(jī)制協(xié)同作用，尚不明確，還需一步研究。