楊若培 徐黎 王玲 張晨鑫 張?zhí)煊?端木羊羊 閆國強 程曉光*

1.北京積水潭醫(yī)院放射科，北京 100035 2.北京積水潭醫(yī)院動物室，北京 100035

圍絕經(jīng)期及絕經(jīng)后婦女由于卵巢功能衰退，雌激素、孕激素水平逐漸下降，骨骼丟失性疾病發(fā)病率高，嚴重影響生存質(zhì)量[1]。絕經(jīng)后相應(yīng)體脂分布也會發(fā)生變化，近年來的研究發(fā)現(xiàn)，脂肪組織在婦女絕經(jīng)后具有再分布的現(xiàn)象，主要表現(xiàn)為絕經(jīng)后體脂趨于上半身型分布[2]。目前有研究進一步表明，骨骼與脂肪之間存在交互調(diào)控作用。脂肪組織能夠分泌多種脂肪因子，如瘦素、脂聯(lián)素，對骨組織代謝有重要調(diào)節(jié)作用[3-4]。而骨組織則能分泌骨鈣素等因子調(diào)節(jié)脂肪及糖類代謝[5]。對比男性，骨骼丟失性疾病對中老年女性的生存質(zhì)量影響更為嚴重，有文獻指出，我國患骨量減少或骨質(zhì)疏松癥患者男女性別比例為1∶2[6]。圍絕經(jīng)期女性骨骼、脂肪代謝過程與男性比較存在不同的作用機制。以往國內(nèi)外研究側(cè)重于探索絕經(jīng)后出現(xiàn)的典型脂肪和骨代謝改變，但尚有一些問題未能解決，如絕經(jīng)早期脂肪與骨變化是否同絕經(jīng)后期一致，圍絕經(jīng)期脂肪分布有何變化及同骨密度變化趨勢是否一致，兩種組織之間能否交互影響，針對這些問題，本研究采用去勢犬動物模型，模擬絕經(jīng)早期腹部脂肪的變化過程，探討脂肪與骨及相關(guān)血清學(xué)指標之間的關(guān)系及影響因素。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選取成年雌性比格犬6只，年齡1～3歲，體重7.5～11.5 kg，均未生育，由北京瑪斯生物技術(shù)有限公司提供并由北京積水潭醫(yī)院實驗動物中心飼養(yǎng)，經(jīng)體檢與編號后飼養(yǎng)在陽光充足且有足夠獨立空間的犬舍中1個月，實驗犬在麻醉下行雙側(cè)卵巢摘除術(shù)，麻醉藥使用江蘇中牧倍康藥業(yè)有限公司生產(chǎn)的復(fù)方氯胺酮注射液，0.06 mL/kg進行注射。所有犬術(shù)后恢復(fù)良好，手術(shù)由北京積水潭醫(yī)院動物室有資質(zhì)醫(yī)師操作。本研究經(jīng)北京積水潭醫(yī)院倫理委員會通過。

1.2 影像掃描與測量方法

1.2.1定量CT(quantatitive computed tomography，QCT)掃描與測量：所有比格犬均采用Toshiba Aquilion 80排螺旋CT掃描儀和Mindways 5樣本固體模(Mindways Software Inc，Austin，TX，USA)進行腹部QCT掃描，掃描時間為術(shù)前、術(shù)后4個月、6個月、10個月。掃描前動物均行麻醉術(shù)，麻醉藥用法同去勢術(shù)。采取俯臥位，下肢先進，出床掃，體膜放置于比格犬腹下，掃描范圍包括膈上1 cm至S1椎體下方。掃描參數(shù)：床高120 cm，120 kV，150 mAs，層厚1.0 mm，掃描視野(scan field of view，SFOV)300 mm，采用標準重建算法。原始圖像傳至QCT工作站使用QCT Pro Version 5.0(Mindways Software Inc，Austin，TX，USA)軟件進行分析。腹部脂肪測量采用QCT Pro軟件中的體脂分析功能，選擇L4/5椎間隙層面，軟件通過校準后自動設(shè)定閾值，以腹壁肌肉為界區(qū)分腹內(nèi)脂肪與皮下脂肪組織(圖1)，自動計算腹部總脂肪面積(total fat area，TFA)與腹內(nèi)脂肪面積(visceral fat area，VFA)，前者減去后者得到皮下脂肪面積(subcutaneous fat area，SFA)。腰椎骨密度(bone mineral density，BMD)測量選取L3、L4、L5椎體中心水平稍靠上層面，選取橫截面積為20～30 mm2、層厚為9 mm的感興趣區(qū)域(region of interest，ROI)，測量時避開椎體骨皮質(zhì)及椎基靜脈區(qū)域(圖2)。所有測量操作均由1名有經(jīng)驗的放射科醫(yī)生完成，以往研究已經(jīng)證明該測量方法有著良好的準確性及重復(fù)性[7-8]。

1.2.2MR mDxion-quant掃描及測量：所有比格犬于術(shù)前、術(shù)后6個月、10個月與QCT掃描同一天行MR mDixon-quant掃描，采用Ingenia 3.0 T MR掃描儀(Philips Healthcare，Best)，32通道Ds Torso體部線圈，選擇6回波mDixon-quant梯度回波序列，掃描參數(shù)：翻轉(zhuǎn)角3°，TR=8.1 ms，TE1=1.33 ms，△TE=1.3 ms，視野 200 mm×144 mm×90 mm，體素大小2 mm×1.89 mm×3 mm，層數(shù)30，敏感性編碼2，信號采集數(shù)1。所有數(shù)據(jù)傳輸至工作站使用ISP軟件(Version 7，Philips Healthcare，Best)進行測量。在脂肪分數(shù)彩圖上，選取L3、L4、L5椎體中心水平稍靠上層面，測量骨松質(zhì)區(qū)域椎體脂肪分數(shù)，ROI橫截面積為20～30 mm2，測量時同樣避開骨皮質(zhì)及椎基靜脈區(qū)域。

圖1 QCT PRO軟件所示L4/5椎間隙層面脂肪分布情況(藍色區(qū)域代表脂肪組織，黃色區(qū)域代表肌性軟組織，綠色套索外藍色區(qū)域代表腹部皮下脂肪，綠色套索內(nèi)藍色區(qū)域代表腹腔內(nèi)脂肪)Fig.1 The fat distribution at L4/5 intervertebral space shown by QCT PRO (The blue area represents adipose tissue, the yellow area represents muscular soft tissue, the blue area outside the green lasso represents abdominal subcutaneous fat, and the blue area inside the green lasso represents abdominal fat).

圖2 腰椎骨密度感興趣區(qū)域范圍Fig.2 The ROI location and range in the lumbar vertebrae by BMD measurement

1.2.3血清學(xué)及體重測量：所有犬于影像測量當天進行體重測量及上肢皮下頭靜脈采血。采血量3～5 mL，肝素抗凝，3 500 r/min離心分離出血漿，于-20 ℃凍存。測量血生化指標：總膽固醇(cholesterol，CHOL)、甘油三酯(triglyceride，TRIG)、高密度脂蛋白(high-density lipoprotein，HDL)、低密度脂蛋白(low-density lipoprotein，LDL)、血糖(blood glucose，GLU)。激素及脂肪因子：內(nèi)脂素(visfatin，VFN)、脂聯(lián)素(adiponectin，ADPN)、瘦素(leptin，LP)、胰島素(insulin，INS)、雌二醇(estradiol，E2)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 22.0軟件(IBM)進行統(tǒng)計學(xué)分析。數(shù)據(jù)樣本量小，不滿足正態(tài)分布,數(shù)據(jù)以中位數(shù)(下四分位數(shù)，上四分位數(shù))表示，術(shù)后增長率用平均值表示。對于術(shù)后各期同術(shù)前各指標的比較采用配對樣本秩和檢驗(Wilcoxon signed-rank Test)以及方差分析趨勢檢驗。將脂肪面積、BMD分別作為因變量，將其余影像指標及血清學(xué)指標作為自變量進行回歸分析(Multiple linear regression)，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

各時間點影像學(xué)及血清學(xué)測量指標結(jié)果見表1、2。術(shù)后VFA較術(shù)前升高，術(shù)前為28.90(21.57，40.15)cm2，術(shù)后6個月、10個月持續(xù)增加，平均增長率分別為40.23%、84.39%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.028、0.046)，SFA及TFA術(shù)后較術(shù)前也有所增大。雖然VFA、SFA以及TFA均呈升高趨勢，然而VFA增加百分比在術(shù)后6個月、10個月均為三者中最大。骨髓脂肪百分比各期差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

術(shù)后6個月、10個月測得的BMD較術(shù)前有所升高，術(shù)前BMD值為323.79(296.92，343.05)mg/cm3，術(shù)后6個月、10個月分別增長13.58%、12.26%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.028)。對不同時間點BMD進行趨勢性檢驗發(fā)現(xiàn)，切除卵巢后比格犬BMD值先升高后降低，術(shù)后10個月較術(shù)后6個月有所下降，平均下降約4.17 mg/cm3。

將SFA作為因變量，其余BMD及血清學(xué)指標作為自變量進行多元線性回歸分析，結(jié)果顯示體重、BMD，LP、VFA、HDL為有統(tǒng)計學(xué)意義的變量(P<0.02)，見表3。將BMD作為因變量，其余FAT及血清學(xué)指標作為自變量進行多元線性回歸分析，結(jié)果顯示，SFA、體重、SFA、LDL、VFN為有統(tǒng)計學(xué)意義的變量(P<0.05)，見表4。所得的回歸方程如下：

SFA=-124.023+8.361(體重)+0.26(BMD)+1.65(LP)+0.25(VFA)-2.75(HDL) BMD=448.42+2.50(SFA)-23.46(體重)+86.56(LDL)-2.95(VFN)

3 討論

雌激素(E2)是骨代謝的關(guān)鍵調(diào)控因子，成功建立絕經(jīng)后模型是本次實驗的先決條件，筆者在對術(shù)前比格犬雌二醇的測量中發(fā)現(xiàn)，1號及4號犬血清E2濃度遠高于其余4只犬平均水平，血清E2濃度分別為1號25.12 pg/mL、4號56.2 pg/mL，余樣本E2含量均值為7.36 pg/mL。根據(jù)文獻報道，狗在發(fā)情間期的末期，E2開始升高，在發(fā)情前1 d至發(fā)情后3 d內(nèi)出現(xiàn)E2高峰(52.5±29.26)pg/mL[9]。因此，推測兩個奇異值的出現(xiàn)可能由于1號和4號比格犬測量時處于發(fā)情前期，趨勢檢驗可見術(shù)后E2含量在波動中下降明顯，在術(shù)后6個月后差異明顯，證明對比格犬切除雙側(cè)卵巢能夠成功建立圍絕經(jīng)及絕經(jīng)早期動物模型。

術(shù)后腹部脂肪均出現(xiàn)了不同程度的增加，其中VFA在術(shù)后6個月及10個月增加量較TFA和SFA都高，反映出絕經(jīng)后體脂再分布現(xiàn)象，脂肪組織由外周轉(zhuǎn)向中心，這一過程與雌激素受體在白色脂肪組織的分布有關(guān)[10]。SFA隨體重、BMD、LP、VFA的增加而增加，隨HDL的增加而減小。表明此動物模型可用于研究雌激素缺乏所引起的脂肪代謝變化、分析相關(guān)骨脂因子與體內(nèi)脂肪再分布的關(guān)系。

表1 各時間段影像學(xué)及體重測量結(jié)果Table 1 The results of image and weight at different time

注：術(shù)前為基線數(shù)據(jù)，術(shù)后各期為增長率，均同術(shù)前基線數(shù)據(jù)相比，計算公式=(術(shù)后值-術(shù)前值)/術(shù)前值×100%；同術(shù)前比較，*P<0.05。

表2 各時間段血清學(xué)檢測結(jié)果Table 2 The serum biochemistry results at different time

注：術(shù)前為基線數(shù)據(jù)，術(shù)后各期為增長率，均同術(shù)前基線數(shù)據(jù)相比，公式為(術(shù)后值-術(shù)前值)/術(shù)前值×100%。

表3皮下脂肪面積同骨密度及血清學(xué)指標的多元線性回歸分析

Table3The multiple linear regression between SFA, BMD and serum biochemical indexes

變量R2P值體重0.7260.000骨密度瘦素0.8710.9190.0000.003腹內(nèi)脂肪面積0.9400.016高密度脂蛋白0.9570.018

表4骨密度同脂肪及血清學(xué)指標的多元線性回歸分析

Table4The multiple linear regression between BMD, fat and serum biochemical indexes

變量R2P值皮下脂肪面積0.2800.008體重0.5460.002低密度脂蛋白0.7570.001內(nèi)脂素0.8100.033

有關(guān)腹部脂肪含量同骨密度關(guān)系文章中有很多不同觀點，如Wang等[11]認為無論男女，瘦體重和脂肪組織對BMD均有保護作用；Liu等[12]認為在校正了身體指數(shù)和體重之后，內(nèi)臟脂肪含量與BMD沒有相關(guān)性；同樣的結(jié)果也被Salimzadeh等[13]證實。本次實驗發(fā)現(xiàn)BMD先升后降，而腹部脂肪尤其是VFA一直保持增長，BMD隨著SFA的增加而增加，而隨體重的增加而降低，且同VFA無明確關(guān)系。驗證了SFA而非VFA在絕經(jīng)超早期對BMD的保護作用，但體重越大BMD越小。以往對絕經(jīng)后婦女體脂及BMD研究選擇的人群的納入標準常為絕經(jīng)一年以上，本次實驗觀察時間較短，可能觀測不到腹部脂肪同BMD經(jīng)典動態(tài)變化的過程。

絕經(jīng)后E2的降低會導(dǎo)致BMD的降低[14]。本次實驗結(jié)果顯示，雙側(cè)卵巢切除術(shù)后10個月，比格犬BMD并未顯著下降，這與以往研究的結(jié)果不同。對不同時間點BMD做趨勢分析后發(fā)現(xiàn)，其在術(shù)后10個月較6個月有下降趨勢，可能原因為激素變化先于骨代謝，在較短的時間內(nèi)BMD并不會明顯減低。Martin等[15]對去勢比格犬進行骨髓脂肪含量相關(guān)性研究時發(fā)現(xiàn)，在切除卵巢后11個月，脊柱和第11肋骨小梁髓腔內(nèi)骨小梁體積百分比才開始減少，而本次實驗至切除卵巢后10個月就終止，未觀察到骨髓脂肪百分比有顯著改變。本研究未能觀察到比格犬BMD的下降，可能與比格犬BMD影響因素較成人更多、犬的骨代謝代償能力更強有關(guān)。光照、運動及食物等因素均能影響犬骨代謝過程，而這類因素難以很好控制。但是本研究從趨勢變化上驗證了Martin等[15]關(guān)于卵巢切除術(shù)后比格犬骨密度變化的結(jié)果。以往研究發(fā)現(xiàn)BMD同E2、VFN呈正相關(guān)，同CHOL、LDL呈負相關(guān)[16-17]，而同HDL的相關(guān)性研究爭論較大[18]?；貧w分析可知，本實驗去勢犬骨BMD隨著VFN的增加而減低，隨LDL的增加而增加，出現(xiàn)了同前人研究相矛盾的結(jié)果，原因亦可能為絕經(jīng)后超早期BMD還未明顯下降而骨脂因子水平已明顯改變，也側(cè)面反映出BMD同脂蛋白關(guān)系密切，骨脂代謝相互影響?，F(xiàn)有結(jié)果證明對比格犬切除雙側(cè)卵巢觀察10個月無法建立絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松模型，如需建立應(yīng)觀察更長時間。盡管未能觀測到BMD在去勢后明顯下降，但術(shù)后VFN/SFN/TFA、BMD及E2均從術(shù)后6個月起開始有變化，可反映出E2在絕經(jīng)后脂肪與骨代謝中的關(guān)鍵作用。

雖然在實驗前筆者已經(jīng)做了充分準備，但由于實驗條件限制，本研究尚存在以下不足：①未設(shè)置對照組，會在后續(xù)實驗中增加對照組，獲取數(shù)據(jù)，繼續(xù)比對實驗組同對照組之間的關(guān)系，使結(jié)果更有說服力；②因?qū)嶒炄y得，價格昂貴，實驗組個數(shù)尚少，可能影響統(tǒng)計學(xué)效力；③在圖像掃描方面，磁共振掃描時間較長，且犬需要麻醉，部分犬呼吸運動偽影明顯，圖像質(zhì)量不如人群研究；④觀察時間過短。