吳敬瑩

（安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院藥學(xué)部 安徽 合肥 230601）

急性腎損傷（acute kidney injury，AKI），原名急性腎衰竭，是臨床常見危重病之一，其以腎功能在短時(shí)間內(nèi)突然迅速下降為主要特點(diǎn)，并同時(shí)伴有一系列嚴(yán)重并發(fā)癥，臨床發(fā)病率逐年遞增[1]，為目前住院患者死亡的獨(dú)立危險(xiǎn)因素之一。近年來大量的流行病學(xué)和臨床研究表明腎臟損傷因子-1（Kidney Injury Molecule-1，KIM-1）在腎臟損傷不同程度時(shí)會(huì)發(fā)生顯著變化，在腎臟疾病演變?nèi)^程中有著重要的意義，KIM-1系腎臟近曲小管上皮細(xì)胞一種跨膜糖蛋白，于正常腎組織表達(dá)量極低[2]。國外學(xué)者Kumar研究提示，在腎缺血、腎毒性等誘因所致的急性腎損傷患者中檢測到KIM-1表達(dá)水平顯著升高，探究原因其細(xì)胞外域經(jīng)基質(zhì)金屬蛋白酶作用分解為可溶性片段并釋放到細(xì)胞外，隨后排入尿液中[3]。AKI在臨床早期通常為可逆性損害，如能早期診斷，同時(shí)積極針對原發(fā)病治療，消除誘因可有效避免其進(jìn)展為實(shí)質(zhì)性腎衰竭，但鑒于此類疾病初期臨床癥狀及體征缺乏特征性，在臨床實(shí)際診療過程中極易出現(xiàn)誤診或漏診，導(dǎo)致部分患者錯(cuò)失臨床治療的最佳時(shí)機(jī)[4]，故尋找有效的控制因子對于腎臟疾病尤其控制早期腎臟損傷具有重要的意義。

順鉑（Cis-diamine dichloropl atinum，CDDP）是臨床最常用治療實(shí)體性腫瘤療效確切的藥物之一，其臨床療效多與臨床用藥劑量成相關(guān)，但其藥物毒性尤其腎毒性也與劑量正相關(guān)。CDDP的生物活性取決于人體內(nèi)環(huán)境中氯離子濃度，在氯離子濃度較高的血液及細(xì)胞外，CDDP相對穩(wěn)定，一旦其進(jìn)入氯離子濃度很低的細(xì)胞液中后，CDDP中的兩個(gè)氯離子會(huì)被水所取代，形成水合物。而形成的這種水合物極易與DNA發(fā)生加成反應(yīng)，形成交聯(lián)，破壞DNA的復(fù)制轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致細(xì)胞增殖周期停滯，致使細(xì)胞凋亡。探究CDDP誘發(fā)腎毒性原因，發(fā)現(xiàn)其主要原因是由氧化應(yīng)激引起的氧化性損傷，損傷機(jī)制主要有二：一為大量氧自由基的生成，二則是自由基清除劑減少、受抑。本文就CDDP誘導(dǎo)的鼠急性腎損傷中KIM-1的作用進(jìn)行研究和探討，旨在為腎臟損傷早期尋找有效的控制因子。

1.資料與方法

1.1 一般資料

自安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心購買健康清潔級雄性C57小鼠20只，體質(zhì)量17～20g，動(dòng)物使用許可證號（SYXK（皖）2017-006）。按隨機(jī)數(shù)字表法將小鼠分為實(shí)驗(yàn)組和對照組，每組10只；正常喂養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 方法

1.2.1 模型制備 實(shí)驗(yàn)組小鼠按10mg/kg腹腔注射CDDP，以造成小鼠急性腎損傷模型。對照組給予等量0.9%氯化鈉溶液（生理鹽水）。

1.2.2 樣本采集 用戊巴比妥鈉麻醉小鼠（10%，麻醉后處死），取各組小鼠腎臟組織。-80°冰箱保存，對小鼠腎臟組織進(jìn)行剝離，中間段進(jìn)行病理學(xué)檢測，兩邊進(jìn)行提取組織蛋白進(jìn)而對相應(yīng)蛋白含量進(jìn)行檢測。

1.2.3 免疫組織化學(xué)檢測 取每組10只小鼠腎臟組織固定24h后，按常規(guī)制作蠟塊、切片，進(jìn)行KIM-1免疫組織化學(xué)檢測。

1.2.4 Westernblot檢測 稱量組織1000mg腎臟組織，加入10μl蛋白裂解液（1ml RIPA:10μl PMSF），于冰上裂解30min，不間斷晃動(dòng)培養(yǎng)瓶或六孔板；再將裂解液、細(xì)胞碎片轉(zhuǎn)至預(yù)冷的1.5mlEP管中，渦旋數(shù)次至裂解充分；經(jīng)過4℃，12000rpm，30min離心后；移入上清液至新的1.5mlEP管中（記錄上清液體積）；蛋白定量；加入5×蛋白上樣緩沖液，4個(gè)體積的蛋白溶液加一個(gè)體積的5×蛋白上樣緩沖液，混勻，分裝于0.5ml EP管中；100℃，10min，使蛋白充分變性；提取符合濃度純度要求的蛋白，置-20℃保存。

Westernblot顯影結(jié)果采用Image-Pro Plus圖像處理系統(tǒng)進(jìn)行分析光密度，量化蛋白表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)處理采用SPSS17.0軟件。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用重復(fù)測量方差分析；計(jì)數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1 模型結(jié)果

2.1.1 免疫組織化學(xué)結(jié)果 腎臟病理結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組小鼠腎臟KIM-1陽性表達(dá)顯著增高，對照組小鼠腎臟損傷因子棕黃色陽性表達(dá)相對于模型組顯著減少（圖1）。

圖1 兩組腎臟組織免疫組織化學(xué)檢查結(jié)果圖

2.2 Westernblot結(jié)果

兩組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）（圖2）。

圖2 Westernblot結(jié)果

3.討論

本實(shí)驗(yàn)研究旨在建立順鉑（Cis-diamine dichloro platinum，CDDP）誘導(dǎo)的急性腎損傷小鼠模型，檢測KIM-1在此模型中小鼠腎臟表達(dá)的不同。目前CDDP導(dǎo)致急性腎毒性的機(jī)制未完全明了，部分學(xué)者研究提示CDDP攝入機(jī)體內(nèi)后能在腎組織濃聚，排泄途徑主要為經(jīng)腎排泄，而這種腎組織濃集的特征性組織分布、以及主要由腎排泄特性，可能是其腎毒性的原因所在[5]。實(shí)驗(yàn)通過CDDP的腎毒性誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞的壞死、細(xì)胞凋亡、炎癥介質(zhì)損傷等機(jī)制產(chǎn)生急性腎損傷。目前研究表明KIM-1作為一種新Ⅰ型跨膜糖蛋白，其結(jié)構(gòu)包括胞質(zhì)區(qū)、跨膜區(qū)、信號肽、黏蛋白結(jié)構(gòu)域、特征性Ig結(jié)構(gòu)域等，通常KIM-1在正常肝、腎及脾組織呈微量或低量表達(dá)，但在急性腎損傷后再生的近曲小管上皮細(xì)胞中表達(dá)量顯著提高，提示與急性腎損傷嚴(yán)重程度相關(guān)性強(qiáng)，表明其在腎小管上皮細(xì)胞早期損傷及修復(fù)、腎間質(zhì)纖維化修復(fù)中均具有重要作用，同時(shí)具有信號傳導(dǎo)、黏附及參與免疫反應(yīng)等功能。研究提示KIM-1細(xì)胞外域經(jīng)基質(zhì)金屬蛋白酶作用分解為可溶性片段，并釋放到細(xì)胞外，隨后排入尿液中，故可于尿液中檢測出KIM-1可溶性片段。學(xué)者趙進(jìn)等研究提示，在臨床腎缺血導(dǎo)致急性腎小管壞死患者尿液中，KIM-1表達(dá)水平顯著升高，KIM-1尿液中測定值為其他急性腎損傷因素導(dǎo)致的急性腎小管壞死患者數(shù)值約4倍，其次誘因是臨床造影使用的對比劑所致的急性腎小管壞死[6]。

筆者動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果同樣顯示，在實(shí)驗(yàn)組中病理學(xué)水平和蛋白水平均呈現(xiàn)出KIM-1的高表達(dá)，無論腎毒性還是腎缺血所致腎損傷，尿KIM-1作為評估腎損傷的標(biāo)志物優(yōu)于BUNSCR及尿NAGL這些傳統(tǒng)的指標(biāo)。因此提示KIM-1是種可靠的早期檢測腎損傷的生物學(xué)標(biāo)志物。