李夏夏，鐘 艷，謝承衛(wèi)

(貴州大學(xué) 化學(xué)與化工學(xué)院，貴州 貴陽 550025)

煤矸石是煤炭生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的一種固體廢棄物，大量堆放在露天空地，占用大量土地資源并對(duì)環(huán)境造成嚴(yán)重的污染[1-4]. 我國是世界上最大的煤炭生產(chǎn)和消費(fèi)國，預(yù)計(jì)2020年，所占比例不低于60%，決定了煤炭資源在我國國民經(jīng)濟(jì)及社會(huì)發(fā)展中的重要戰(zhàn)略地位[5]. 目前，煤矸石的主要用于生產(chǎn)矸石磚等，然而在實(shí)際應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)，由于煤矸石成份的復(fù)雜性，生產(chǎn)效益較低[6-7]. 因此，開發(fā)煤矸石的資源應(yīng)用迫在眉睫，2010年，程勇等人[8-9]進(jìn)行了煤矸石中炭的浮選及煤矸石活化的研究，將煤矸石中的炭資源化利用，進(jìn)而增加煤矸石的綜合利用率. 如何開發(fā)出利用率高、污染小的煤矸石綜合利用技術(shù)，已成為當(dāng)今研究熱點(diǎn)之一.

尋找高效的解磷微生物是該領(lǐng)域研究人員關(guān)注的焦點(diǎn)問題之一[10]，相關(guān)研究表明，芽孢桿菌和埃希氏菌對(duì)磷酸三鈣具有溶解能力，且分解能力存在較大差異[11-12]. Paul和Sundara[13]測(cè)定幾株芽孢桿菌溶解磷酸三鈣的效率高達(dá)19%，其中解磷能力最強(qiáng)的是巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)，解磷微生物在礦物解離方面具有一定的應(yīng)用價(jià)值. 本課題組率先將已報(bào)道的微生物細(xì)菌用于煤矸石的解離研究，獲得良好的效果，其中解鉀細(xì)菌、硅酸鹽細(xì)菌能有效解離煤矸石中所含礦物質(zhì)，將其轉(zhuǎn)化為植物可吸收利用的營養(yǎng)元素，制備成煤矸石肥料[14]. 2015年，袁向芬等[15]發(fā)現(xiàn)解磷微生物巨大芽孢桿菌對(duì)高硫煤矸石具有解離作用，能將其中的營養(yǎng)物質(zhì)釋放，使高硫煤矸石的資源化利用成為可能. 煤矸石富含豐富營養(yǎng)物質(zhì)[16]，利用解磷微生物[17-18]解離煤矸石制備肥料，解離后煤矸石肥效顯著提升.

煤矸石是一種潛在的可利用資源，全國目前有數(shù)十億噸之多，未得到有效利用，開發(fā)新型的能有效解離煤矸石的微生物細(xì)菌，是煤矸石資源化、綠色化應(yīng)用的重要基礎(chǔ).

本研究通過廣泛的煤炭產(chǎn)區(qū)生態(tài)環(huán)境調(diào)研，從風(fēng)化煤矸石中篩選、培育出具有高效解磷效果的微生物——類香味細(xì)菌，對(duì)類香味細(xì)菌菌株進(jìn)行了生理生化，并與巨大芽孢桿菌進(jìn)行了煤矸石解離的對(duì)比研究，類香味菌株對(duì)煤矸石的解離效果優(yōu)于傳統(tǒng)的菌株巨大芽孢桿菌. 類香味細(xì)菌的發(fā)現(xiàn)，進(jìn)一步擴(kuò)大了解磷微生物的范圍，目前類香味細(xì)菌在解磷方面的研究，還未見報(bào)道. 通過微生物解離煤矸石制備微生物復(fù)合肥料，是一種幾乎無污染、成本低、工藝簡(jiǎn)單、利用率高的、新型的煤矸石應(yīng)用方式. 本研究通過從風(fēng)化煤矸石中篩選培養(yǎng)出高效解磷細(xì)菌，針對(duì)性強(qiáng)，解離煤矸石效果好，是一條尋找新型解離煤矸石微生物細(xì)菌的有效途徑.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)原料和菌株

1.1.1 試 樣

實(shí)驗(yàn)原料取自貴州省六盤水地區(qū)某礦區(qū)煤矸石. 該煤矸石主要礦物成分為SiO252.40%, Al2O323.07%, Fe2O312.02%, CaO 3.4%, P2O50.27%, K2O 1.52%等.

1.1.2 菌種及其培養(yǎng)

本實(shí)驗(yàn)所用菌株包括類香味菌(Myroides odoratimimus strain)以及巨大芽孢桿菌(bacillus megaterium). 類香味菌從風(fēng)化煤矸石中提取、培育所得，研究發(fā)現(xiàn)該菌株具有高效的解磷能力，以及制備煤矸石肥料的潛力. 巨大芽孢桿菌(ACCC10011)來自于中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏中心，是一種公認(rèn)的、常用的解磷微生物.

全營養(yǎng)固體培養(yǎng)基： 蛋白胨5 g，氯化鈉5 g，牛肉膏1 g，酵母膏2 g，瓊脂15～20 g，蒸餾水1 000 mL，體系pH調(diào)整為7.4.

類香味菌在全營養(yǎng)培養(yǎng)基上的單菌落形態(tài)如圖1 所示： 菌落呈不透明，形狀邊緣規(guī)則，表面濕潤，中間呈現(xiàn)乳白，略帶淺黃色，有光澤，菌落約2 mm. 經(jīng)革蘭氏染色鏡檢，菌體形態(tài)如圖2 所示，菌體呈革蘭氏陰性(G-)桿菌，有兩兩相連排列，無芽孢、鞭毛和莢膜.

圖1 類香味菌落形態(tài)Fig.1 The colonial morphology of Myroides odoratimimus strain

圖2 類香味菌體形態(tài)Fig.2 Mycelial morphology of Myroides odoratimimus strain

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌液的制備

將培養(yǎng)好的類香味菌沖洗到三角瓶中，將菌液稀釋為菌株濃度在(1.46×1013cfu/mL～1.87×1013cfu/mL)，塞緊瓶塞，放入恒溫震蕩搖床上震蕩30 min，混勻待用.

1.2.2 單因素試驗(yàn)方法

準(zhǔn)確稱取一定量、不同粒度的煤矸石于培養(yǎng)皿中，加入不同濃度的菌液，攪拌均勻，用稀鹽酸溶液和稀氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)不同pH值，放入恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)若干天，取出烘干后，測(cè)定樣品中有效磷的含量，測(cè)定方法[19]參照《土壤分析技術(shù)》.

1.2.3 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，對(duì)兩株細(xì)菌分別設(shè)計(jì)了L9(3)4正交實(shí)驗(yàn)，尋找類香味菌株、巨大芽孢桿菌的最佳解離煤矸石條件.

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株解離煤矸石單因素結(jié)果

2.1.1 體系pH值

煤矸石的粒度采用100目，接菌量濃度為1.46×1013cfu/mL～1.87×1013cfu/mL ，培養(yǎng)時(shí)間2 d，保持適當(dāng)?shù)母蓾穸?，用稀鹽酸溶液和稀氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)體系pH，測(cè)定pH對(duì)解磷效果的影響.

當(dāng)將體系pH值調(diào)節(jié)為5，6，7，7.5，8，9，10，測(cè)定兩種菌株解離后煤矸石中有效磷的含量. 由圖3 可知，當(dāng)體系pH值分別約7，9時(shí)，類香味菌和巨大芽孢桿菌解離煤矸石有效磷含量達(dá)到最大. 從變化趨勢(shì)可以看出，巨大芽孢桿菌對(duì)pH值變化比較敏感，波動(dòng)較大，而類香味菌，隨著pH值變化，對(duì)解磷效果的影響較小，可以降低工藝上調(diào)節(jié)pH值的難度. 我國大多數(shù)土壤偏酸性或中性，使得類香味菌有較好的適應(yīng)能力，利用類香味菌處理煤矸石制備肥料更有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值，能夠更好地改善土壤中缺磷的現(xiàn)象.

圖3 體系pH值對(duì)有效磷含量的影響Fig.3 Effective phosphorus change with the pH value of system

2.1.2 煤矸石顆粒大小

體系pH調(diào)整為8，接入1.46×1013cfu/mL～1.87×1013cfu/mL濃度的細(xì)菌，培養(yǎng)時(shí)間2 d，保持適當(dāng)?shù)母蓾穸?，測(cè)定煤矸石粒度對(duì)解磷效果的影響.

圖4 煤矸石顆粒尺寸對(duì)有效磷含量的影響Fig.4 Effective phosphorus change with particle size of coal gangue

煤矸石顆粒大小不同時(shí)，測(cè)定兩種菌株解離后煤矸石中有效磷的含量. 由圖4 可知，煤矸石粒徑逐漸變小時(shí)，類香味菌株與巨大芽孢桿菌解離煤矸石的有效磷含量呈先增大后減小的趨勢(shì)，當(dāng)顆粒尺寸分別為120目，40目時(shí)，有效磷含量達(dá)到最大. 但兩株菌株由于自身特性，對(duì)煤矸石不同顆粒尺寸的解磷效果并不相同，類香味菌株能夠在顆粒粒徑適中的情況下，使得菌液更加充分解離煤矸石中的磷，增加煤矸石中磷的利用率，而巨大芽孢桿菌屬于特別需氧型，顆粒尺寸減小使得煤矸石之間接觸緊密，導(dǎo)致其中的氧氣含量降低，抑制了該菌株的代謝作用. 但實(shí)際應(yīng)用中，顆粒太大或太小都會(huì)對(duì)擴(kuò)大生產(chǎn)過程產(chǎn)生一定的阻礙，這使得類香味菌株解離煤矸石具有更好的實(shí)際應(yīng)用前景.

2.1.3 接菌量

煤矸石的粒度采用100目，培養(yǎng)時(shí)間2 d，體系pH調(diào)整為8，接入不同濃度的細(xì)菌，保持適當(dāng)?shù)母蓾穸?，測(cè)定接菌量對(duì)解磷效果的影響. 向稱取一定量煤矸石的培養(yǎng)皿中分別加入一定濃度，體積分別為5，10，15，20，25，30，40，50 mL的菌液，混勻，將其放入恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 d 左右后，取出測(cè)定其有效磷含量，如圖5 所示.

圖5 接菌量對(duì)有效磷含量的影響Fig.5 Effective phosphorus change with the inoculation amount

由圖5 可知，對(duì)于類香味菌株而言，隨著接菌量的增大，有效磷含量逐漸增大，當(dāng)接菌量為50 mL時(shí)，有效磷含量達(dá)到最大. 而巨大芽孢桿菌，隨著接菌量的變化，呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)，當(dāng)濃度為40 mL 時(shí)，有效磷含量最大. 當(dāng)接菌量均為 40 mL 時(shí)，類香味菌解離煤矸石的能力強(qiáng)于巨大芽孢桿菌，能夠更高效地分解煤矸石中的難溶性的磷.

2.1.4 培養(yǎng)天數(shù)

煤矸石的粒度采用100目，體系pH調(diào)整為8，接入1.46×1013cfu/mL～1.87×1013cfu/mL 濃度的細(xì)菌，保持適當(dāng)?shù)母蓾穸?，測(cè)定培養(yǎng)時(shí)間對(duì)解磷效果的影響. 當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間為1，2，3，4，5，6，7，8，9，10 d時(shí)，測(cè)定兩株菌株分別解離煤矸石的有效磷含量. 由圖6 可知，培養(yǎng)天數(shù)為3 d時(shí)，類香味菌株解離煤矸石后有效磷含量達(dá)到最大； 培養(yǎng)時(shí)間為1 d時(shí)，巨大芽孢桿菌解離煤矸石后有效磷含量最高. 類香味菌株解離煤矸石的能力受時(shí)間因素影響較小，表明類香味細(xì)菌有很強(qiáng)的生命力，能將煤矸石中的大量無效磷轉(zhuǎn)化為有效磷. 而巨大芽孢桿菌，隨著培養(yǎng)天數(shù)的不同，解離能力不同程度降低，可能由于對(duì)氧有較強(qiáng)的依賴能力所影響，當(dāng)氧含量多時(shí)，菌株活性越強(qiáng)，解離效果越好，而氧含量逐漸減少，會(huì)造成部分的巨大芽孢桿菌失去活性，從而使得有效磷含量較低，表明巨大芽孢桿菌處理煤矸石具有一定的不穩(wěn)定性，不能更高效地解離煤矸石中的無效磷成分. 考慮工藝生產(chǎn)過程、時(shí)間帶來的成本，類香味菌株優(yōu)先選擇3 d，而巨大芽孢桿菌優(yōu)先選擇1 d.

圖6 培養(yǎng)天數(shù)對(duì)有效磷含量的影響Fig.6 Effective phosphorus change with the cultured time

2.2 類香味菌解離煤矸石正交實(shí)驗(yàn)

2.2.1 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

通過單因素實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)兩種細(xì)菌解離煤矸石的四個(gè)主要因素為： 粒徑大小，體系pH值，接菌量和體系的培養(yǎng)時(shí)間. 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，對(duì)兩株細(xì)菌分別設(shè)計(jì)了L9(3)4正交實(shí)驗(yàn)，尋找類香味菌、巨大芽孢桿菌最佳的解離煤矸石條件和正交試驗(yàn)條件，結(jié)果見表 1 和表 2.

表 1 類香味菌株的正交試驗(yàn)以及結(jié)果

表 2 巨大芽孢桿菌的正交試驗(yàn)以及結(jié)果

表 1，表 2 分別為類香味細(xì)菌與巨大芽孢桿菌解離煤矸石的正交試驗(yàn)結(jié)果，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)接菌量為50 mL, 培養(yǎng)天數(shù)為2 d, 煤矸石粒徑大小為140目以及體系pH為7的最佳實(shí)驗(yàn)條件下，類香味細(xì)菌解離煤矸石的解磷效果最好，其有效磷含量為50.41 mg/kg； 當(dāng)接菌量為50 mL, 培養(yǎng)天數(shù)為3 d, 煤矸石粒徑大小為20目以及體系pH為7.5的最佳實(shí)驗(yàn)條件下，巨大芽孢桿菌解離煤矸石的解磷效果最好，其有效磷含量為 42.21 mg/kg.

2.2.2 解磷能力比較

將類香味細(xì)菌、巨大芽孢桿菌在最佳解離煤矸石條件下，進(jìn)行同一來源煤矸石解離對(duì)比試驗(yàn)，比較兩種菌株的解離效果，結(jié)果如表 3 所示.

表 3 兩種細(xì)菌最佳解磷條件及解離煤矸石結(jié)果

表 3 為最佳條件下，菌株解離煤矸石的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)解離后有效磷含量均高于原樣磷含量. 但兩株細(xì)菌最佳解離條件存在差異，巨大芽孢桿菌解離煤矸石的顆粒比類香味細(xì)菌大，最佳培養(yǎng)時(shí)間與類香味菌相差不大，實(shí)際的工業(yè)生產(chǎn)中，巨大芽孢桿菌在解離效率上有優(yōu)勢(shì). 從解離煤矸石結(jié)果來看，類香味細(xì)菌處理后的有效磷提升5倍左右，而巨大芽孢桿菌處理后有效磷提升4倍左右，類香味細(xì)菌的解磷效果優(yōu)于巨大芽孢桿菌.

3 結(jié) 論

1) 新型解磷微生物細(xì)菌的發(fā)現(xiàn)，使得解磷細(xì)菌不再局限于土壤，同時(shí)具有處理煤系廢棄物煤矸石的潛力. 研究表明，篩選培育得到具有高效解磷能力的類香味細(xì)菌，能有效解離煤矸石，增加其中有效磷含量. 類香味細(xì)菌解離功能的發(fā)現(xiàn)，拓展了解磷微生物的研究范圍.

2) 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，類香味菌解離煤矸石最佳條件為： 接菌量為50 mL，培養(yǎng)天數(shù)為2 d，煤矸石粒徑大小為140目以及體系pH為7. 與傳統(tǒng)解磷細(xì)菌巨大芽孢桿菌對(duì)比研究表明，類香味細(xì)菌的解磷效果優(yōu)于巨大芽孢桿菌.

3) 采用新型細(xì)菌處理廢棄的煤矸石，是一種對(duì)環(huán)境非常友好的、溫和的、無污染的綠色化方法. 針對(duì)不同地域的煤矸石(或其它大宗工業(yè)廢料)，開發(fā)專用的微生物細(xì)菌，使其資源化成為可能，能有效地解決煤矸石對(duì)環(huán)境的危害.