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        大鼠口服艷山姜揮發(fā)油后的入血成分分析*

        2019-06-10 08:04:26吳林菁王興蘭李婉蓉劉學(xué)楊佳佳肖婷張嫩玲周雪姜豐沈祥春陶玲
        關(guān)鍵詞:出峰揮發(fā)油灌胃

        吳林菁, 王興蘭, 李婉蓉, 劉學(xué), 楊佳佳, 肖婷, 張嫩玲, 周雪, 姜豐, 沈祥春**, 陶玲**

        (1.貴州醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院 天然藥物資源優(yōu)效利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 貴州 貴陽 550025; 2.貴州醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院 藥用植物功效與利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 貴州 貴陽 550025; 3.貴州醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院 貴州省普通高等學(xué)校天然藥物藥理與成藥性評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 貴州 貴陽 550025; 4.貴州醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院 貴州省特色天然藥物資源高效利用工程中心, 貴州 貴陽 550025)

        艷山姜Alpiniazerumbet(Pers.)Burtt. et Smith作為為貴州少數(shù)民族常用藥,具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抗心血管疾病等作用,收載于《貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》(2003版)[1]?;谄G山姜果實(shí)揮發(fā)油所具備的顯著心血管藥理學(xué)活性,課題組開展了艷山姜生藥學(xué)[2]、提取工藝及化學(xué)成分[3-5]、藥理學(xué)[6-15]、新劑型[16-17]等方面的研究。艷山姜果實(shí)揮發(fā)油中主要活性組分α-蒎烯、1,8-桉葉油醇、β-蒎烯、莰烯對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞具有顯著的調(diào)控保護(hù)作用[7],但其活性成分在體內(nèi)的吸收過程還尚不明確。在研究中藥復(fù)雜成分的過程中,普遍認(rèn)為中藥發(fā)揮藥效的活性成分可能是其被吸收入血的成分[18-20]。因此檢測(cè)口服中藥后有哪些成分被吸收入血或經(jīng)過人體代謝后會(huì)有哪些成分發(fā)生變化,是深入研究中藥藥效物質(zhì)的重要基礎(chǔ)[21-23]。本實(shí)驗(yàn)采用氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS),結(jié)合血清藥物化學(xué)實(shí)驗(yàn)方法,對(duì)大鼠灌胃艷山姜揮發(fā)油(EOFAZ)后的血漿樣品進(jìn)行分析檢查,考察EOFAZ在大鼠體內(nèi)的入血成分,為EOFAZ的下一步藥代動(dòng)力學(xué)研究提供參考,也為EOFAZ的治療心血管疾病藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康成年雄性 SD 大鼠6只,體質(zhì)量(250±20) g,清潔級(jí),由貴州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,合格證號(hào)為SCXK(黔)2018-0001,實(shí)驗(yàn)前12 h禁食不禁水。

        1.1.2藥品與試劑 艷山姜采自貴州省黔西南州貞豐縣連環(huán)鄉(xiāng)巧巖村,經(jīng)貴州醫(yī)科大學(xué)龍慶德副教授鑒定為姜科山姜屬植物艷山姜Alpiniazerumbet( Pets. ) Burtt. et Smith 的干燥成熟果實(shí)。乙酸乙酯(分析純,上海申博化工有限公司,1601101),肝素鈉(北京索萊寶科技有限公司,1024E027)。

        1.1.3儀器 Agilent 6890 /5975C GC- MS聯(lián)用儀(美國(guó)安捷倫公司),E104 /02型電子天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司),Microfuge 20R型冷凍離心機(jī)(美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司),XW-80A漩渦混合儀(上海馳唐電子有限公司),KQ3200型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司),UPW-UP-10超純水處理器(成都天莘寧科技有限公司),GC-MS Solution色譜工作站標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)(美國(guó) NIST 質(zhì)譜檢索數(shù)據(jù)庫(kù))。

        1.2 方法

        1.2.1艷山姜揮發(fā)油的提取 參照文獻(xiàn)[4]中艷山姜揮發(fā)油的提取方法,精密稱取艷山姜干燥成熟果實(shí)100 g,按照1∶10的比例加入蒸餾水1 000 mL,水蒸氣蒸餾提取5 h后收集揮發(fā)油,加入適量無水硫酸鈉脫水,所得艷山姜揮發(fā)油具有較為濃烈的香味,并呈淡黃色透明液體,得率為0.98%。

        1.2.2艷山姜揮發(fā)油供試品的制備 精密吸取艷山姜揮發(fā)油50 μL,置于5 mL的棕色潔凈容量瓶中,加適量乙酸乙酯溶解并定容至刻度線,搖勻,超聲15 min,12 000 r/min離心 10 min,取上清液即得,備用。

        1.2.3血漿樣品采集 取SD雄性大鼠6只,給藥前自頸靜脈插管取血0.5 mL,置含有10 g/L肝素的2 mL EP管中,4 ℃ 3 000 r/min離心10 min,取全部上清液作空白血漿,放置于-80 ℃的冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆茫淮笫蠊辔钙G山姜揮發(fā)油2.0 mL,1 h后自頸靜脈取血0.5 mL,處理方法同空白血漿。

        1.2.4血漿樣品處理 取大鼠血漿200 μL,置于2 mL EP管中,加入乙酸乙酯800 μL,渦旋5 min,于4 ℃ 12 000 r/min離心10 min,取上清液加入雙蒸水200 μL,渦旋5 min,12 000 r/min 4 ℃離心10 min,取上清液3 μL于GC-MS進(jìn)樣檢測(cè)。

        1.2.5氣相色譜條件 色譜柱為ZB-5彈性石英毛細(xì)管柱,運(yùn)行時(shí)間為62 min;初始溫度為45 ℃并保持2 min,以20 ℃/min的速率升溫至75 ℃并保持2 min,2 ℃/min升溫至100 ℃并保持2 min,4 ℃/min升溫至200 ℃并保持1 min,以10 ℃/min升溫至310 ℃并保持5 min。載氣為高純He(99.999%),分流比20∶1,載氣流量1.0 mL/min,柱前壓7.65 psi,溶劑延遲時(shí)間4.0 min,汽化室溫度250 ℃。

        1.2.6質(zhì)譜條件 電子能量70 eV,接口溫度280 ℃,倍增器電壓1 659 V,發(fā)射電流34.6 μA,離子源溫度230 ℃,四極桿溫度150 ℃,離子源為EI源,質(zhì)量范圍29~450 amu。

        1.2.7結(jié)構(gòu)鑒定 對(duì)總離子流圖中的各峰,經(jīng)過質(zhì)譜計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)系統(tǒng)檢索,及核對(duì)標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖Nist2005、Wiley275,鑒定其檢測(cè)出的化合物,并利用峰面積歸一化法,測(cè)定各化學(xué)成分的相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

        2 結(jié)果

        大鼠灌胃EOFAZ前后,氣相-質(zhì)譜聯(lián)用儀分析色譜圖見圖1,從血樣中檢測(cè)出化合物的結(jié)果如表1所示。艷山姜揮發(fā)油經(jīng)GC-MS檢測(cè)并鑒定出51個(gè)成分。大鼠灌胃EOFAZ 1 h后的血漿經(jīng)GC-MS分析,檢測(cè)出入血成分37個(gè),其中主要活性成分β-蒎烯、α-蒎烯、莰烯、1,8-桉葉油醇在EOFAZ及入血成分中所占百分含量均較高,且β-蒎烯在EOFAZ及給藥后血漿中都是相對(duì)百分含量最高的成分。

        圖1 EOFAZ及大鼠EOFAZ灌胃前后血樣GC-MS結(jié)果 Fig.1 GC-MS chromatogram of EOFAZ and blood samples of rats before and after gavage of EOFAZ in rats

        3 討論

        由于EOFAZ極性小,在前期實(shí)驗(yàn)中分別考察了氯仿、石油醚、正丁醇、乙酸乙酯作為溶劑,將其用分別配制成同一濃度的樣品進(jìn)行GC檢測(cè),根據(jù)GC檢測(cè)結(jié)果和溶解現(xiàn)象綜合比較,發(fā)現(xiàn)乙酸乙酯溶解的樣品出峰數(shù)目較多、峰面積較大、分離度良好,且EOFAZ溶液呈澄清透明狀態(tài)。因此,最終確定乙酸乙酯作為EOFAZ的溶劑。同時(shí)考察了不同比例的乙酸乙酯溶解EOFAZ,其結(jié)果表明乙酸乙酯和EOFAZ的體積比為100∶1是最佳的溶解比例。

        為了更多地檢測(cè)出EOFAZ在大鼠體內(nèi)的入血成分,在預(yù)實(shí)驗(yàn)時(shí)共考察灌胃EOFAZ后15 min、30 min、45 min、1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、7 h、9 h、12 h、24 h共12個(gè)取血點(diǎn),采用Aglient7890B型氣相色譜儀分析對(duì)比空白血漿和含藥血漿的GC色譜圖,發(fā)現(xiàn)大鼠口服EOFAZ后1 h取血點(diǎn)出峰最多,且峰面積較大,因此最終確定取血時(shí)間點(diǎn)為1 h。

        表1 EOFAZ及大鼠EOFAZ給藥前后血樣化合物成分的GC-MS分析Tab.1 GC-MS analysis of EOFAZ and blood samples of rats before and after administration of EOFAZ

        注:“-”表示無該成分

        生物樣品的預(yù)處理是樣品分析中極其重要的一個(gè)環(huán)節(jié),在測(cè)定血樣時(shí),首先應(yīng)除去樣品中的蛋白質(zhì),使結(jié)合型的藥物釋放出來以便測(cè)定藥物總濃度。沉淀蛋白的方法有鹽析法、有機(jī)溶劑沉淀法、等電點(diǎn)沉淀法等。由于艷山姜揮發(fā)油在常溫下極易揮發(fā),應(yīng)當(dāng)處理完樣品立即進(jìn)樣檢測(cè),防止有效成分揮發(fā),有機(jī)溶劑可使蛋白質(zhì)分子內(nèi)及分子之間的氫鍵發(fā)生變化而使蛋白質(zhì)迅速凝聚,使與蛋白質(zhì)結(jié)合的成分釋放出來,因此本實(shí)驗(yàn)選用有機(jī)溶劑去除蛋白,同時(shí)考慮利用有機(jī)溶劑高效萃取血漿中揮發(fā)性入血成分,分別考察了正丁醇、甲苯、石油醚、乙酸乙酯、正己烷等有機(jī)試劑沉淀蛋白及萃取揮發(fā)性入血成分作用,分別取各試劑沉淀蛋白后的上清液,水洗后再取其上清液,采用Aglient7890B型氣相色譜儀進(jìn)樣分析,比較各試劑沉淀蛋白后血樣的出峰數(shù)目、分離度、峰面積等條件后,發(fā)現(xiàn)石油醚雜峰太多且分離度差,正丁醇、乙酸乙酯、甲苯、正己烷的出峰數(shù)目和出峰時(shí)間較為相近,但乙酸乙酯的分離度較高和峰面積較大,最終確定沉淀蛋白及萃取揮發(fā)性入血成分的有機(jī)溶劑為乙酸乙酯。同時(shí)對(duì)乙酸乙酯的用量進(jìn)行考察,結(jié)果顯示乙酸乙酯與血漿樣品的比例為4∶1時(shí),蛋白沉淀較為完全且出峰數(shù)目較多、峰分離度較好,經(jīng)水洗后能有效除去血漿中的水溶性物質(zhì),使含藥血漿溶液澄清透明,GC-MS檢測(cè)更加精準(zhǔn)無干擾。因此,本實(shí)驗(yàn)確定采用乙酸乙酯為蛋白沉淀劑,且乙酸乙酯與血漿樣品的比例為4∶1時(shí)沉淀蛋白的效果最佳。

        本實(shí)驗(yàn)通過GC結(jié)合MS法確定EOFAZ在大鼠中的入血成分有37種,主要有β-蒎烯、1,8-桉葉油醇、β-水芹烯、α-蒎烯、莰烯、對(duì)傘花烴、樟腦、石竹烯氧化物、α-異松油烯、d-檸檬烯、冰片、α-蓽澄茄烯、α-松油醇、4-松油醇、β-月桂烯、反式松香芹乙酯等(百分含量分別為20.146%、15.072%、9.09%、7.491%、7.318%、4.122%、2.987%、2.85%、2.666%、2.544%、2.223%、1.614%、1.613%、1.513%、1.068%、1.003%),這37種成分能是EOFAZ藥效的物質(zhì)基礎(chǔ),更多入血成分的鑒定有待進(jìn)一步研究[13]。本研究闡釋了艷山姜活性部位揮發(fā)油進(jìn)入大鼠血液中的成分,為進(jìn)一步研究艷山姜藥材的體內(nèi)過程和藥效物質(zhì)奠定了基礎(chǔ)。[22-23]

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