張業(yè)， 嚴(yán)瑞,2， 李華， 劉暢， 周興艷， 朱春玲,2**

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)， 貴州 貴陽(yáng) 550004； 2.貴州醫(yī)科大學(xué)附院 腎內(nèi)科， 貴州 貴陽(yáng) 550004)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)作為糖尿病最常見(jiàn)的并發(fā)癥，可引起進(jìn)行性腎臟纖維化，最終發(fā)展為終末期腎病[1-2]。上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是促使多種器官纖維化發(fā)生的重要進(jìn)程，使正常組織及腫瘤組織中產(chǎn)生具有干細(xì)胞特性的細(xì)胞[3]。已有研究表明，成年人腎含有腎臟干(祖)細(xì)胞(kidney stem cell)，這些細(xì)胞既可表達(dá)小管細(xì)胞標(biāo)記物，又可表達(dá)足細(xì)胞標(biāo)記物[4]。近來(lái)對(duì)噻唑烷酮類(lèi)化合物(thiazolidinediones，TZDs)吡格列酮(pioglitazone)及其受體 PPAR-γ 的研究表明，TZDs 可通過(guò)減輕胰島素抵抗、改善糖脂代謝及一些獨(dú)立于降糖外的作用直接減輕腎臟疾病[5]。因此，本研究以糖尿病大鼠(DM)為研究對(duì)象，觀察腎組織中干細(xì)胞標(biāo)志物及腎臟纖維化指標(biāo)的表達(dá)變化，同時(shí)觀察吡格列酮是否會(huì)影響上述指標(biāo)的表達(dá)水平，為吡格列酮治療DN提供新的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要材料與試劑

SPF 級(jí)SD大鼠(雄性)，體質(zhì)量(185±15)g(購(gòu)自華阜生物有限公司，許可證號(hào)SCXK(京)2009-0004)，鏈脲佐菌素(STZ，美國(guó)Sigma公司)，BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(北京碧云天生物公司)，預(yù)染Marker(Thermo Scientific公司)、rabbit-anti-β-actin ( 巴傲得生物科技有限公司)、rabbit-anti-CD24(Proteintech公司) 、rabbit-anti-CD133(abcam公司)、rabbit-anti-Fibronectin、rabbit-anti-E-cadherin、rabbit-anti-α-SMA(Proteintech公司)，總RNA提取試劑盒(天根生化科技公司)，引物合成(上海生工公司)，real-time PCR試劑盒(Takara公司)

1.2 方法

1.2.1動(dòng)物模型建立及實(shí)驗(yàn)分組 SD大鼠共24只，隨機(jī)均分為正常組(NC組)、糖尿病組(DM組)及吡格列酮治療組(DP組)。DM及DP組大鼠禁食(不禁水)12 h后，將1%STZ按照55 mg/kg腹腔注射，72 h后通過(guò)其尾靜脈檢測(cè)血糖，當(dāng)血糖≥16.7 mmol/L提示達(dá)到成模標(biāo)準(zhǔn)。NC組給予同等體積的檸檬酸鈉緩沖液腹腔注射。DP組模型大鼠飼養(yǎng)3周后，給予吡格列酮10 mg/(kg·d) 灌胃治療8周，每周休息1 d；NC、DM組予同等量的生理鹽水灌胃。3組大鼠飼養(yǎng)至16周時(shí)，大鼠禁食(不禁水)12 h，麻醉后取股動(dòng)脈血，4 ℃離心后分離出血清，測(cè)定血清葡萄糖含量；之后處死大鼠，解剖、摘除雙側(cè)腎臟用于后續(xù)檢測(cè)。

1.2.2腎組織CD24、CD133、E-cadherin、α-SMA及Fibronectin蛋白測(cè)定 取大鼠腎組織皮質(zhì)部分，加入蛋白裂解液研磨后提取出總蛋白，蛋白濃度通過(guò)BCA法測(cè)定。將各組蛋白質(zhì)樣品加至SDS-PAGE凝膠中，經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、5%脫脂牛奶封閉后，用CD24、CD133、E-cadherin、α-SMA、FN及 β-actin 對(duì)應(yīng)的一抗(分別按照1∶800、1∶600、1∶1 000、1∶600、1∶1 000 及1∶6 000稀釋)孵育轉(zhuǎn)有蛋白的PVDF膜，將其放置于搖床上，并在4 ℃冰箱中輕度搖晃過(guò)夜；TBST洗膜3次后，加入Goat Anti-Rabbit二抗稀釋液(1∶6 000)后在室溫中孵育1 h；再次用TBST洗膜3次，ECL 顯色，最后曝光成像。實(shí)驗(yàn)結(jié)果用 Imaje J 軟件檢測(cè)出不同分組、不同蛋白所得條帶的灰度值，以β-actin的灰度值作為內(nèi)參，得出目的蛋白的相對(duì)含量。

1.2.3腎組織中CD24和CD133 mRNA測(cè)定 應(yīng)用Trizol法提取大鼠腎組織的總RNA并測(cè)定其濃度，步驟參照北京天根公司提供說(shuō)明書(shū)；選取20 μL作為反轉(zhuǎn)錄的反應(yīng)體系合成模板cDNA，應(yīng)用上海生工公司提供的PCR引物，采用SYBR premix Ex TaqII進(jìn)行熒光定量PCR。目的基因引物序列見(jiàn)表1。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

表1 目的基因引物序列Tab.1 Primer sequence in real time RT-PCR

2 結(jié)果

2.1 腎組織中的CD24和CD133mRNA表達(dá)

與NC組比較，DM組大鼠腎組織CD24、CD133 mRNA表達(dá)增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，DP組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與DM組比較，DP組兩種mRNA表達(dá)顯著減少(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

(1)與NC組比較，P<0.05； (2)與DM組比較, P<0.05圖1 各組大鼠腎組織CD24和CD133 mRNA表達(dá)Fig.1 Expression of CD24 mRNA and CD133 mRNA in kidney tissue in each group

2.2 CD24和CD133蛋白表達(dá)

與NC組比較，DM組大鼠腎組織CD24、CD133蛋白表達(dá)增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，DP組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與DM組比較，DP組大鼠腎組織兩種蛋白表達(dá)均減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖2。

(1)與NC組比較，P<0.05；(2)與DM組比較, P<0.05圖2 各組大鼠腎組織CD24和CD133蛋白表達(dá)Fig.2 The protein expression of CD24 and CD133 in renal tissues in each group

2.3 腎組織中E-cadherin、α-SMA及Fibronectin蛋白表達(dá)

與NC組比較，DM組大鼠腎組織Fibronectin、α-SMA蛋白表達(dá)增多，E-cadherin表達(dá)減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，DP組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與DM組比較，DP組大鼠腎組織Fibronectin、α-SMA蛋白表達(dá)減少，E-cadherin表達(dá)增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖3。

3 討論

糖尿病腎病的病理發(fā)展包括腎小球硬化和腎小管間質(zhì)的纖維化。在促纖維化因子及炎性因子作用下可發(fā)生腎小管EMT[6]，并引起細(xì)胞外基質(zhì)(extracellularmatrix，ECM)的過(guò)度沉積。纖維蛋白是細(xì)胞外基質(zhì)的框架，主要包括膠原蛋白(collagen)、纖連蛋白(fibronectin)和彈性蛋白(elastin)，它們可作為預(yù)測(cè)ECM沉積的因子[7]。有研究證實(shí)[4，8]，成年人腎臟組織中存在干/祖細(xì)胞區(qū)室，如Bowman’ s 囊中的CD24+CD133+細(xì)胞。在不同的急性腎損傷(AKI)小鼠模型中都證實(shí)了此類(lèi)細(xì)胞在腎臟修復(fù)中的作用：輸注后可以降低小鼠的死亡率，改善腎功能[9]。在阿奇霉素所致慢性腎損傷小鼠模型中證實(shí)，上述細(xì)胞可產(chǎn)生新的腎小管上皮細(xì)胞及足細(xì)胞，并且在急性或慢性腎臟損傷的患者腎臟組織中發(fā)現(xiàn)CD24+CD133+細(xì)胞增殖活躍[10]。但目前對(duì)腎臟干細(xì)胞的研究大多集中在對(duì)胚胎腎、急性腎損傷模型及外源性干細(xì)胞治療方式，在成體及慢性腎損傷中是否存在干細(xì)胞仍有爭(zhēng)議[11]。Kusaba[12]通過(guò)對(duì)細(xì)胞損傷和修復(fù)的克隆分析認(rèn)為，干細(xì)胞標(biāo)記物的產(chǎn)生是由于終末分化的上皮細(xì)胞在損傷后發(fā)生了去分化，使其在間充質(zhì)狀態(tài)期間發(fā)生了再表達(dá)，而不是干細(xì)胞群的功能體現(xiàn)。CD24、CD133可表達(dá)于多種細(xì)胞，并作為多數(shù)器官和腫瘤組織中干/祖細(xì)胞的表面抗原標(biāo)志物[13]。

(1)與NC組比較，P<0.05； (2)與DM組比較, P<0.05圖3 各組大鼠腎組織中E-cadherin、α-SMA及Fibronectin的表達(dá)Fig.3 The protein expression of E-cadherin、α-SMA and Fibronectin in kidney tissues in each group

EMT 分為1 型參與胚胎形成及器官發(fā)育，2 型參與組織再生與創(chuàng)傷、炎癥后的修復(fù)和3 型參與腫瘤相關(guān)疾病3種類(lèi)型[14]。有研究證實(shí)，在肺組織[15]、乳腺組織[16]及皮膚組織[16]中，EMT的發(fā)生可誘導(dǎo)細(xì)胞獲得干性特征，使已分化的細(xì)胞表現(xiàn)出類(lèi)似干/祖細(xì)胞增殖克隆和自我更新的特性，但它們的增殖種類(lèi)與分化方向不定[17]。在EMT發(fā)生過(guò)程中，具有上皮表型特征的E-鈣黏蛋白(E- cadherin)可表達(dá)下調(diào)，具有成纖維表型特征的α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α- SMA)可上調(diào)[18]。 大量研究證實(shí)，在STZ誘導(dǎo)的糖尿病鼠中，噻唑烷二酮類(lèi)藥物可通過(guò)調(diào)節(jié)糖代謝、脂代謝對(duì)腎臟產(chǎn)生間接保護(hù)作用[19]；還可通過(guò)直接保護(hù)腎臟血管內(nèi)皮細(xì)胞及減輕足細(xì)胞損傷，抑制腎臟系膜的增生，防止腎小球硬化，抑制腎小管的間質(zhì)纖維化[20]。而在DM大鼠中，吡格列酮是否可通過(guò)抑制EMT的進(jìn)程，減輕腎臟纖維化，并影響腎臟干細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)目前尚不清楚。

因此，為了探討吡格列酮對(duì)腎臟中干細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)的影響，本研究采用腹腔注射STZ的方法復(fù)制大鼠DN模型，用Westernblot、Real-time PCR的方法檢測(cè)CD24、CD133、E-cadherin、α-SMA、Fibronectin蛋白及CD24、CD133mRNA的表達(dá)變化。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，DM大鼠腎組織中腎臟纖維化標(biāo)志物Fibronectin蛋白表達(dá)增加，腎小管上皮細(xì)胞表型標(biāo)志物E-cadherin蛋白減少而纖維細(xì)胞標(biāo)志物α-SMA蛋白大量表達(dá)，與之伴隨的是CD24、CD133蛋白及mRNA表達(dá)上調(diào)；而在DP大鼠腎組織中發(fā)現(xiàn)Fibronectin、α-SMA蛋白、CD24、CD133蛋白及mRNA表達(dá)均下降，E-cadherin蛋白表達(dá)增多。因此，本實(shí)驗(yàn)認(rèn)為CD24、CD133參與了腎臟纖維化的進(jìn)程。由此猜測(cè)，在糖尿病大鼠腎組織中，EMT的發(fā)生可誘導(dǎo)已分化的上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化至間充質(zhì)細(xì)胞，這類(lèi)細(xì)胞獲得了擴(kuò)增和遷移等干細(xì)胞特征，并且可表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)志物，它們可能分化成了肌成纖維細(xì)胞，分泌細(xì)胞外基質(zhì)，導(dǎo)致腎臟纖維化的發(fā)生。同時(shí)，成體腎臟干細(xì)胞只有在腎臟發(fā)揮修復(fù)作用時(shí)才可由靜止?fàn)顟B(tài)轉(zhuǎn)向增殖狀態(tài)[21]。Lasagni等[22]發(fā)現(xiàn)，在局灶性腎小球硬化癥的小鼠模型中，阻斷 Notch 通路可減輕腎小球損傷，但會(huì)引起干細(xì)胞的增殖減少。隨著糖尿病腎病的進(jìn)展，可能使CD24+CD133+細(xì)胞等腎臟干細(xì)胞的激活，這類(lèi)細(xì)胞在體內(nèi)發(fā)生了增殖與分化，一定程度上參與修復(fù)腎臟固有細(xì)胞的損傷，最終大鼠腎臟纖維化的程度可能取決于腎臟固有細(xì)胞的死亡與腎臟干/祖細(xì)胞的再生之間的平衡。而吡格列酮可能通過(guò)抑制EMT進(jìn)程，使具有干性特征的間充質(zhì)細(xì)胞及其分化的肌成纖維細(xì)胞減少，從而減輕了腎臟纖維化程度，同時(shí)也使腎臟干細(xì)胞的增殖減少。

綜上，在DN條件下，大鼠腎組織中干細(xì)胞標(biāo)志物CD24、CD133的表達(dá)變化可能與EMT有關(guān)，同時(shí)證實(shí)了吡格列酮可抑制EMT、減輕腎臟纖維化并影響腎臟干細(xì)胞標(biāo)物的表達(dá)水平。今后，將通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)及基因干預(yù)的方法，從而較為全面、直接地研究腎臟干細(xì)胞的作用及吡格列酮在其中發(fā)揮的作用。