唐也笑， 萬(wàn)荷天一， 羅小光*

(貴州醫(yī)科大學(xué)， 貴州 貴陽(yáng) 550004)

氣滯血瘀證是由于氣機(jī)郁滯導(dǎo)致血行瘀阻所表現(xiàn)的證候[1]?！夺t(yī)述》曰：“因憂思過(guò)度而致?tīng)I(yíng)血郁滯不行,或因怒傷血逆而留積于胸膈之間者，此皆瘀血之因也?！鼻橹井惓Ｊ菤鉁鲎C發(fā)病的重要原因。有學(xué)者認(rèn)為[2]，氣滯血瘀證的發(fā)病機(jī)理和氧化應(yīng)激存在關(guān)聯(lián)，氧化應(yīng)激的主要攻擊器官是肝臟[3]，而肝臟等器官中有大量的Nrf2核轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)[4]。Nrf2核轉(zhuǎn)錄因子是一種抗氧化正向調(diào)控因子，它不但能夠延長(zhǎng)細(xì)胞壽命，維持細(xì)胞氧化還原穩(wěn)態(tài)[5]，還能調(diào)節(jié)多基因表達(dá)并參與多種信號(hào)傳導(dǎo)途徑[6]。因此本課題通過(guò)建立氣滯血瘀證SD雌性大鼠模型，觀察通絡(luò)刮痧和桃紅四物湯對(duì)模型大鼠肝組織核因子E2相關(guān)因子2(Nrf2) mRNA及蛋白表達(dá)的影響，探討其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：40只6～8周齡、體質(zhì)量為250～270 g的SPF級(jí)成年雌性SD大鼠，由長(zhǎng)沙市天勤生物動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，合格證號(hào)為SCXK(湘)2014-0010。主要實(shí)驗(yàn)藥物及試劑：鹽酸腎上腺素注射液(天津金耀氨基酸有限公司，批號(hào)20170907)，水合氯醛(天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)20180910)，刮痧精油。主要儀器設(shè)備及工具：TG16G臺(tái)式高速離心機(jī)(湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司)，刮痧板等。

1.2 方法

1.2.1分組 將40只大鼠隨機(jī)分成空白組、模型組、中藥組以及刮痧組，每組10只。

1.2.2造模 動(dòng)物適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，根據(jù)文獻(xiàn)[7-9]制備氣滯血瘀證模型，除空白組外，其余3組大鼠左下腹注射鹽酸腎上腺素注射液0.09 mg/kg，1次/d；給藥4 h后隨機(jī)接受以下一種物理刺激：冰水浴，將大鼠置于0～4 ℃恒溫水箱，4 min/次,2次/d；烘箱熱烘，將大鼠置于50 ℃恒溫箱，10 min/次，2次/d；夾尾，將兩只大鼠鼠尾用同一根皮筋捆綁，大鼠發(fā)怒廝打時(shí)松開(kāi)皮筋，20 min/次，2次/d；束縛，將大鼠用皮筋捆綁束縛，限制其活動(dòng)1 h，2次/d；傾斜，將鼠籠45°傾斜放置，持續(xù)2 h，1次/d。每日給予以上1～2種不同刺激，持續(xù)14 d?？瞻捉M正常喂養(yǎng)，不做其他任何處理。

1.2.3造模后處理 治療造模成功后24 h，除空白組外，其它3組大鼠均采取不同的干預(yù)措施，模型組抓捕，1次/d；中藥組按照24 g/kg桃紅四物湯煎劑進(jìn)行灌胃，1次/d；刮痧組用剃毛器剔除大鼠腹背部毛發(fā),取用少量刮痧精油，涂勻在大鼠的暴露皮膚處，參考《大鼠穴位圖譜》[10]，用刮痧板刮拭大鼠膀胱經(jīng)、督脈(頸部至尾骨)、任脈(頸部至恥骨)，以出紅色或紫紅色痧粒為止，以不刮破皮膚為度，頻率為1次/周，治療時(shí)間為2周?？瞻捉M正常喂養(yǎng)，不做其他任何處理。

1.2.4動(dòng)物處死及標(biāo)本采集 在末次治療次日早晨，予各組大鼠左下腹注射水合氯醛麻醉后，心臟采血后處死。5 mL血樣本采集入含肝素的采血管中、3 mL血樣本采集入枸櫞酸鈉采血管中，送至中心實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)全血黏度(低切、中切、高切)、血漿黏度及血細(xì)胞比容等血液流變學(xué)指標(biāo)和部分活化凝血酶原時(shí)間(APTT)、凝血酶時(shí)間(TT)、凝血酶原時(shí)間(PT)及纖維蛋白原(FIB)等凝血功能指標(biāo)；剖腹后取出肝組織放于離心空管中，并置于-80 ℃密封保存，取出部分肝組織后，用玻璃勻漿器研磨均勻，采用RT-PCR法檢測(cè)肝組織中Nrf2 mRNA的表達(dá)，Nrf2引物，上游5′-TCTGCTGCCATTAGTCAGTCGCTCTC-3′，下游5′-CCACCGTGCCTTCAGTGTGCTTCT-3′；β-actin引物，上游5′-GAAGATCAAGATCATTGCTCCT-3′,下游5′-TACTCCTGCTTGCTGATCCA-3′。采用Western Blot法檢測(cè)肝組織中Nrf2蛋白的表達(dá)，嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)操作。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 血液流變學(xué)

從表1中可以發(fā)現(xiàn)，與空白組相比，模型組大鼠血液黏度以及血細(xì)胞比容升高(P<0.05或P<0.01)；與模型組相比，中藥組、刮痧組大鼠的血液黏度以及血細(xì)胞比容降低(P<0.05或P<0.01)；中藥組和刮痧組大鼠比較，血液流變學(xué)指標(biāo)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表1 各組大鼠血液流變學(xué)指標(biāo)比較Tab.1 The effect of scraping therapy and TCM on rat hemorheology

與空白組相比，(1)P<0.05，(2)P<0.01；與模型組相比，(3)P<0.01，(4)P<0.05

2.2 APTT、TT、PT和FIB

從表2中可以發(fā)現(xiàn)，與空白組相比，模型組大鼠APTT和TT明顯縮短，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與模型組相比，中藥組、刮痧組大鼠APTT和TT明顯延長(zhǎng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)，PT、FIB差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，中藥組和刮痧組大鼠TT、APTT、PT及FIB差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表2 各組大鼠PT、TT、APTT、FIB的比較Tab.2 The effect of scraping therapy and TCM on rat PT， TT，APTT and FIB

與空白組相比，(1)P<0.01；與模型組相比，(2)P<0.05，(3)P<0.01

2.3 肝組織Nrf2 mRNA及Nrf2 蛋白表達(dá)

RT-PCR技術(shù)檢測(cè)大鼠肝臟組織中Nrf2 mRNA的含量，Western Blot法測(cè)定肝臟組織中Nrf2蛋白含量，如圖1及圖2顯示，模型組大鼠肝組織中的Nrf2 mRNA及Nrf2蛋白高于空白組(P<0.05)；與模型組相比，中藥組、刮痧組大鼠經(jīng)治療后均可上調(diào)肝組織Nrf2 mRNA及蛋白表達(dá)(P<0.05或P<0.01)；而中藥組和刮痧組大鼠比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

(1)與空白組相比，P<0.05;(2)與模型組相比，P<0.05圖1 各組肝組織Nrf2 mRNA表達(dá)Fig.1 The effect of scraping and TCM on liver Nrf2 mRNA expression

(1) 與空白組相比，P<0.01;(2)與模型組相比，P<0.01圖2 各組肝組織Nrf2蛋白表達(dá)的比較Fig.2 The effect of scraping and TCM on liver Nrf2 protein expression

3 討論

氣滯血瘀證多由情志不舒、或外邪侵襲引起肝氣久郁不解所致[1]。本研究通過(guò)腹腔注射腎上腺素模擬氣滯，并施以不可預(yù)見(jiàn)性應(yīng)激刺激來(lái)建立符合中醫(yī)特點(diǎn)的氣滯血瘀證大鼠模型。從以往研究者對(duì)氣滯血瘀證雌性大鼠模型的報(bào)道來(lái)看，血液流變學(xué)是氣滯血瘀證的客觀診斷標(biāo)準(zhǔn)，凝血功能與氣滯血瘀證密切相關(guān)[8,11-12]。因此本課題選用血液流變學(xué)和凝血指標(biāo)，判斷所建立的大鼠模型是否符合中醫(yī)氣滯血瘀證特點(diǎn)。本次實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，與空白組相比，模型組的血液黏度、血細(xì)胞比容都升高(P<0.05或P<0.01)，TT、APTT時(shí)間明顯縮短(P<0.01)，符合中醫(yī)氣滯血瘀證診斷標(biāo)準(zhǔn)。

氧化應(yīng)激(oxidative stress)是由于機(jī)體活性氧類產(chǎn)生，超過(guò)機(jī)體內(nèi)源性抗氧化防御水平而造成的一種氧化和抗氧化失衡狀態(tài)[13]。氣滯血瘀證會(huì)引起氧化應(yīng)激[2]，氧化應(yīng)激會(huì)損傷女性的生殖能力并誘發(fā)一系列婦科疾病，如痛經(jīng)、閉經(jīng)、卵巢早衰、心血管疾病、肥胖病、更年期綜合征女性諸多疾病[14]?！芭右愿螢橄忍臁?，肝氣郁滯是氣滯血瘀證女性疾病的主要病因病機(jī)，這與古人認(rèn)為的“女性情緒的多變性易引起肝氣不疏，導(dǎo)致肝氣郁結(jié)”觀點(diǎn)不謀而合,因此選擇肝組織作為本次實(shí)驗(yàn)的研究對(duì)象。在氧化應(yīng)激反應(yīng)中，Nrf2轉(zhuǎn)錄因子起著重要氧化-抗氧化的調(diào)控作用，并且在肝臟的表面有Nrf2轉(zhuǎn)錄因子的大量表達(dá)[4]。本研究選擇大鼠肝組織Nrf2轉(zhuǎn)錄因子，究其原因是該因子不但能夠延長(zhǎng)細(xì)胞壽命、維持細(xì)胞氧化還原穩(wěn)態(tài)[5]，還可以在氧化應(yīng)激狀態(tài)下保護(hù)肝臟[15]。在正常生理狀態(tài)下，細(xì)胞漿內(nèi)Nrf2與Keap1結(jié)合，當(dāng)機(jī)體ROS水平升高處于氧化應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，Nrf2與Keap1解離，經(jīng)磷酸化的Nrf2轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核，與細(xì)胞核內(nèi)的小Maf蛋白結(jié)合形成二聚體，與ARE啟動(dòng)NQO1、HO-1、SOD等Ⅱ相解毒酶的轉(zhuǎn)錄，翻譯后細(xì)胞內(nèi)Ⅱ相解毒酶增加，可加速ROS的清除和代謝，增強(qiáng)組織細(xì)胞的抗氧化能力，消除或減輕氧化應(yīng)激損傷[16-19]。因此肝組織Nrf2表達(dá)是否上調(diào)可提示能否提高肝組織的抗氧化能力，從而抑制氧化應(yīng)激。本次實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)顯示，經(jīng)治療干預(yù)后的大鼠模型Nrf2 mRNA及蛋白的表達(dá)均上調(diào)(P<0.05或P<0.01)，促使肝組織的抗氧化能力提高，抵抗氧化應(yīng)激。

桃紅四物湯源于清朝年間知名醫(yī)家吳謙所著《醫(yī)宗金鑒》，它不但能夠改善機(jī)體的凝血功能，降低血液黏度，抑制PLT的粘附和聚集；還能夠有效上調(diào)組織Nrf2的表達(dá)[20-21]。本課題實(shí)驗(yàn)結(jié)果也支持以上觀點(diǎn)，與模型組對(duì)比，中藥組的血液黏度、血細(xì)胞比容均降低(P<0.05)，TT、APTT時(shí)間均延長(zhǎng)(P<0.05)，肝組織Nrf2 mRNA及蛋白表達(dá)上調(diào)(P<0.05或P<0.01)。該藥方不僅具有活血化瘀的作用，而且能夠提高肝組織抗氧化作用，同時(shí)還是婦科血瘀證治療常用的代表方，因此本實(shí)驗(yàn)以桃紅四物湯灌胃治療作為治療對(duì)照組。

通絡(luò)刮痧是基于臟腑-經(jīng)絡(luò)-穴位中醫(yī)皮部理論，用刮痧板等工具在相應(yīng)經(jīng)絡(luò)和穴位進(jìn)行刮拭，起到刺激作用。通絡(luò)刮痧除了具有調(diào)氣行血、活血化瘀、舒筋通絡(luò)等功效，廣泛應(yīng)用于各種病癥的治療和保健領(lǐng)域，還能夠提高肝組織抗氧化能力[22]。由本課題實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見(jiàn)，模型組對(duì)比，刮痧組血液黏度降低(P<0.01)、血細(xì)胞比容降低(P<0.05)，TT延長(zhǎng)(P<0.05)、APTT延長(zhǎng)(P<0.01)，肝組織Nrf2 mRNA及蛋白的表達(dá)(P<0.05或P<0.01)，刮痧組和中藥組各指標(biāo)之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示通絡(luò)刮痧和中藥治療的作用類似，均能上調(diào)肝組織Nrf2 mRNA及蛋白質(zhì)的表達(dá)，從而達(dá)到提高肝的抗氧化能力，抑制氧化應(yīng)激的目的。

總之，通絡(luò)刮痧和桃紅四物湯均能降低氣滯血瘀證模型雌性大鼠的血液黏度、改善凝血功能、上調(diào)肝組織Nrf2 mRNA及蛋白的表達(dá)，兩者的作用效果類似，無(wú)論從蛋白層面還是基因?qū)用婢崾緝煞N治療方法的作用機(jī)制均可能與提高肝組織抗氧化能力，改善氧化應(yīng)激狀態(tài)有關(guān)。由此有理由認(rèn)為，肝組織Nrf2相關(guān)的具體信號(hào)通路及機(jī)制可能成為治療和預(yù)防女性疾病的潛在抗氧化靶點(diǎn)，值得深入研究。