牛雪可， 蘭永哲， 李文均， 曹煜， 黃勁， 廖萬清， 康穎倩*

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 微生物學(xué)教研室， 貴州 貴陽 550025； 2.貴州醫(yī)科大學(xué) 貴州省微生物與人類健康關(guān)系研究人才基地暨貴州省普通高校病原生物學(xué)特色重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 貴州 貴陽 550025； 3.中山大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 廣東 廣州 510275； 4.貴州醫(yī)科大學(xué)附院 皮膚科， 貴州 貴陽 550004； 5.第二軍醫(yī)大學(xué)上海長征醫(yī)院 真菌學(xué)研究所， 上海 200003)

在深海熱液口發(fā)現(xiàn)的、以化能無機(jī)營養(yǎng)生物為基礎(chǔ)的生態(tài)系統(tǒng)已顛覆了所有生命都依賴于光的理論[1]，喀斯特洞穴作為極端環(huán)境中一種特殊的生態(tài)系統(tǒng)，具有黑暗、對(duì)流交換緩慢、營養(yǎng)物質(zhì)匱乏等特點(diǎn)，洞穴環(huán)境雖特殊但仍有大量生理功能特殊和耐受適應(yīng)的生物存在，且多樣性豐富[2]。由于地理?xiàng)l件的限制，大多數(shù)洞穴未被探測或極難進(jìn)入，因此受到外界環(huán)境干擾少，能夠較好的保持其原始性，洞穴內(nèi)常生存著一些能夠耐受極端環(huán)境的微生物，且微生物還處于較為原始的抗藥性階段，可以在其中尋找天然的抗菌藥物。目前貴州省喀斯特地區(qū)放線菌研究主要集中在土壤放線菌生物多樣性[3-5]、喀斯特環(huán)境與微生物的相互作用方面，對(duì)天然喀斯特洞穴內(nèi)放線菌生物多樣性及抗菌活性研究有限，而位于貴州荔波縣的茂蘭國家級(jí)喀斯特森林自然保護(hù)區(qū)，是我國中亞熱帶喀斯特地貌上原生性森林植被保存較完好的一塊寶地，本實(shí)驗(yàn)從茂蘭喀斯特天然洞穴中采集樣本，對(duì)原生態(tài)微生物進(jìn)行純培養(yǎng)，選擇真菌、細(xì)菌、放線菌中5種致病菌進(jìn)行放線菌的抗菌活性研究，為貴州省放線菌的分類及資源開發(fā)提供研究資料。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1樣品 2018年8～9月于貴州省荔波市茂蘭喀斯特森林無名洞穴內(nèi)采集，置于無菌紙袋中，運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室4 ℃保存。

1.1.2培養(yǎng)基 發(fā)酵培養(yǎng)基1(AM3)：可溶性淀粉10 g, 大豆粉10 g, 甘油10 g,蛋白胨15 g,CaCO32 g。發(fā)酵培養(yǎng)基2(RA)：可溶性淀粉20 g,葡萄糖10 g,麥芽提取物10 g,麥芽糖 10 g,玉米粉5 g，微量元素100 U/L,CaCO32 g。發(fā)酵培養(yǎng)基3(ISP5)：葡萄糖10 g,酵母提取物4 g,麥芽提取物10 g。 純化培養(yǎng)基(TSA)：大豆蛋白胨5 g,胰蛋白胨15 g,NaCl 15 g，瓊脂 15 g。

1.1.3測試病原微生物 金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)ATCC25923、大腸埃希菌(Escherichiacoli)ATCC25922、白色念珠菌(Candidaalbicans)ATCC10231、新生隱球菌(Cryptococcusneformans)H99、土地戈登氏菌(Gordoniaterrae)IFM 161，大腸埃希菌及金黃色葡萄球菌為貴州醫(yī)科大學(xué)微生物學(xué)教研室保存菌株，其余均獲贈(zèng)于日本千葉大學(xué)真菌研究所。

1.1.4主要試劑 TIANGEN?細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、Genstar?PCR MIX、國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 方法

1.2.1放線菌分離 將土壤樣本風(fēng)干研磨后，使用無菌水制成10-2土壤懸液，取200 μL涂布于分離平板上，28 ℃培養(yǎng)7 d，觀察生長菌落的形態(tài)特征，挑取單菌落接種于TSA板進(jìn)行純化，28 ℃培養(yǎng)4～5 d，直至獲得單一純菌。

1.2.2基因組DNA提取及16S rRNA擴(kuò)增 采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒制備DNA模板，采用16S rRNA通用引物[6]27f(5′-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)1492r(5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系及條件參照文獻(xiàn) [7]。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測后送英淮捷基(上海)貿(mào)易有限公司進(jìn)行序列測定。

1.2.316S rRNA 基因比對(duì) 將獲得的序列在CLUSTAL_X program進(jìn)行比對(duì)后[8]，與現(xiàn)有的純培養(yǎng)序列在NCBI 數(shù)據(jù)庫 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)及EzTaxon-e 工具進(jìn)行比對(duì)[9]。

1.2.4抗菌活性實(shí)驗(yàn) 將篩選出的放線菌每株接種于AM3、RA、ISP5三種不同的培養(yǎng)基中，置于28 ℃搖床中發(fā)酵1周，10 000 r/min離心取上清,過0.22 μm濾膜，獲得發(fā)酵液。將病原菌活化后，制成菌懸液(0.5麥?zhǔn)?，均勻涂布于無菌PDA/TAS平板上，使用管碟法[10]，于37 ℃正置培養(yǎng)24～48 h。十字交叉法記錄抑菌圈直徑。

2 結(jié)果

2.1 分離到的放線菌

從茂蘭喀斯特洞穴樣品中共分到35株放線菌，歸屬于放線菌門下3個(gè)目5個(gè)科9個(gè)屬22個(gè)種，其中優(yōu)勢菌屬為Rhodococcus屬(45.7%)，Arthrobacter屬(17.1%)。見表1。

表1 貴州荔波茂蘭喀斯特森林無名洞穴放線菌分離結(jié)果Tab.1 Actinomycetes isolation result in Kast caves

2.2 抗菌活性

35株放線菌中15株對(duì)至少一種病原菌具有抑制作用，占比42.8%，其中編號(hào)為K1028、K1006、K2049的菌株對(duì)白念珠菌有抑制作用，尤其K1028菌株抑制作用最強(qiáng)，屬于微桿菌屬；9株放線菌對(duì)新生隱球菌有抑制作用，其中K4211-2(巴氏桿菌)、K4213(厄氏菌屬)、K4239-2(鏈霉菌屬)表現(xiàn)出了極強(qiáng)的抑制作用；K4239-2(鏈霉菌屬)及K3102(鏈霉菌屬)、K4212-3(紅球菌屬)對(duì)戈登氏菌具有抑制作用；K3218-1、K417對(duì)金黃色葡萄球菌具有抑制作用，K4213、K417、K3219、K2010對(duì)大腸埃希菌具有抑制作用。見表2。

表2 分離放線菌對(duì)5種病原菌抗菌活性Tab.2 Antibacteria activity of actinomycetes

續(xù)表

菌株編號(hào)發(fā)酵培養(yǎng)基Cryptococcus neformansCandida albicansGordonia terraeStaphylococcus aureusEscherichia coli1+----K4412----3++----1-++---K20492-----3-----1++----K20312++----3+----1-----K31022-----3--++--1-----K4172---+++++3----1----+++K32192-----3-----1-----K20102-----3----+++

注:+++表示抑菌圈直徑>25 mm， ++表示抑菌圈直徑15 mm～25 mm， +為抑菌圈直徑<15 mm， -表示無抑菌圈

2.3 不同培養(yǎng)基獲得抗菌活性的差異

在抗菌活性試驗(yàn)中，同一菌株使用不同的培養(yǎng)基發(fā)酵，其代謝產(chǎn)物對(duì)同一病原菌的抗菌活性差異顯著。15株活性菌株中，在AM3培養(yǎng)基中具有抗菌活性的菌株有8株，占53.3%，ISP5培養(yǎng)基有抗菌活性菌株數(shù)量與AM3相同，RA培養(yǎng)基有抗菌活性菌株數(shù)量為5株，占比33.3%。見圖1、圖2。

注：A為E.coli，B為S.aureus，C為G.terrae，D為C.neformans，E為C.albicans圖1 放線菌在不同培養(yǎng)基發(fā)酵條件下的抑菌譜Fig.1 Antimicrobial spectrum of actinomycetes under different fermentation conditions

注：A為K1032菌株3號(hào)發(fā)酵液對(duì)Gordonia terrae的抑制作用，B為K441菌株3號(hào)發(fā)酵液對(duì)Cryptococcus neformans的抑制作用，C為K1028菌株2號(hào)發(fā)酵液對(duì)Candida albicans的抑制作用，D為K2049菌株1號(hào)發(fā)酵液對(duì)Candida albicans的抑制作用圖2 部分菌株在不同發(fā)酵培養(yǎng)條件下的抑菌情況Fig.2 Difference antimicrobial activity under different culture condition

3 討論

本研究首次對(duì)貴州茂蘭喀斯特森林內(nèi)的洞穴進(jìn)行了放線菌類群的分離鑒定及抗菌活性篩選研究，選擇使用了3種不同的發(fā)酵培養(yǎng)基(RA、ISP5、AM3)對(duì)放線菌產(chǎn)生抗菌活性差異的影響因素進(jìn)行了比較和探討。共分離獲得35株可培養(yǎng)放線菌，其中棒桿菌目和微球菌目所占比例各半，優(yōu)勢菌屬為紅球菌屬(45.7%)、其次為節(jié)桿菌屬(17.1%)，另有少量的鏈霉菌屬，而湖北、云南、河南等地洞穴放線菌優(yōu)勢菌屬為鏈霉菌屬[11-13]，表明微生物群落多樣性存在地域性差異。在分離到的放線菌中42.8%的菌株表現(xiàn)出了抗菌活性，尤其是對(duì)病原真菌有較強(qiáng)的抑制作用?？拐婢股氐陌l(fā)展一直較抗細(xì)菌抗生素緩慢[14]。近年來，隨著 HIV 感染的蔓延、免疫抑制劑的廣泛使用、免疫功能低下患者的增加、人口的老齡化、器官移植等醫(yī)療技術(shù)的發(fā)展以及留置醫(yī)療器械的廣泛使用等，導(dǎo)致侵襲性真菌感染的發(fā)病率及耐藥率逐漸升高[15-16]。侵襲性真菌感染不僅能造成皮膚、黏膜的淺表感染，還能造成免疫功能低下患者致命的系統(tǒng)感染。有學(xué)者從肺癌、艾滋病、慢性粒細(xì)胞白血病等樣本中分離出大量念珠菌[17-18]，成為醫(yī)院感染排名第四位的病原菌[19]，也是導(dǎo)致血液、腫瘤和 ICU 病房患者最主要的死亡原因之一，致死率達(dá)到 40%～60%[20]。白念珠菌感染的日益流行及其較高的致死率一直都是人們關(guān)注的。本研究發(fā)現(xiàn)了多株對(duì)念珠菌及隱球菌具有抑制作用的活性菌株，研究結(jié)果有助于天然、高效、廣譜、抗真菌抗生素的開發(fā)，具有巨大的利用價(jià)值。

本次研究使用的3種發(fā)酵培養(yǎng)基，碳氮源的成分的差異影響了放線菌抗菌活性。碳源和氮源是影響微生物代謝的重要因素，從AM3及ISP5培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)物中獲得具有抗性菌株的比例高于RA培養(yǎng)基?？紤]單因素影響，促進(jìn)放線菌抗菌活性物質(zhì)產(chǎn)生的最佳碳源為玉米粉其次為可溶性淀粉及葡萄糖，最佳氮源為蛋白胨其次為黃豆粉酵母粉[21-24]。本次洞穴中分離到的放線菌在使用葡萄糖作為碳源或麥芽提取物作為氮源的培養(yǎng)基發(fā)酵時(shí)，產(chǎn)生具有抗菌活性的物質(zhì)量少或無抗菌活性的物質(zhì)產(chǎn)生，一方面提示麥芽提取物并非理想的洞穴放線菌活性物質(zhì)產(chǎn)生的營養(yǎng)因子，另一方面說明淀粉作為碳源有利于發(fā)酵液中活性物質(zhì)的產(chǎn)生和代謝[25]，培養(yǎng)基的碳氮源差異最終導(dǎo)致分離到的放線菌的代謝譜變化，使抑菌活性更強(qiáng)或失去了抑菌活性。因此在進(jìn)行洞穴放線菌活性篩選時(shí)，可以選擇黃豆粉、酵母粉等復(fù)合氮源，其中不僅含糖，氮素和灰分，還含有促進(jìn)放線菌生成及孢子萌發(fā)的生長因素，可以促進(jìn)新的天然活性產(chǎn)物的發(fā)現(xiàn)[26]。

綜上所述，本研究對(duì)黔南喀斯特洞穴極端環(huán)境的放線菌資源進(jìn)行了初步調(diào)查，分離得到了具有潛在開發(fā)利用價(jià)值的放線菌資源，對(duì)當(dāng)?shù)胤啪€菌微生物資源的開發(fā)和保護(hù)有重要的意義。