趙明明 張金祝 李海德 尹桂華 姚宗芹 宋 杰 趙 蒙 付存玉
擴(kuò)張型心肌病是一類以心力衰竭、猝死、惡性心律失常為臨床表現(xiàn)的常見心肌病。給患者家庭和社會帶來了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。心肌纖維化是促進(jìn)擴(kuò)張型心肌病心功能惡化的關(guān)鍵因素[1]。逆轉(zhuǎn)心肌纖維化可能是治療擴(kuò)張型心肌病的重要靶點(diǎn),但擴(kuò)張型心肌病心肌組織纖維化的發(fā)生發(fā)展機(jī)制目前尚不清楚。有研究表明轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGP-β1)/miRNA208a在多種病因所致心肌纖維化的發(fā)生、發(fā)展中皆起到重要作用[2]。但該信號通路是否在擴(kuò)張型心肌病心肌纖維化中也起到重要作用,目前尚不清楚。
阿托伐他汀是一種新型羥甲基戊二酰單酰輔酶A還原酶抑制劑,具有降脂、抗炎、降低TGP-β1的表達(dá)等作用[3]。本研究擬使用阿托伐他汀作為干預(yù)措施,觀察擴(kuò)心病大鼠心肌組織中miRNA208a、TGP-β1、膠原蛋白I(COL-1)等指標(biāo),探討阿托伐他汀對擴(kuò)心病大鼠心肌組織纖維化的影響及其機(jī)制,從而為阿托伐他汀在擴(kuò)張型心肌病中的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
1.實(shí)驗(yàn)材料 (1)實(shí)驗(yàn)動物:健康雄性,Wistar大鼠30只,7周齡,體質(zhì)量220~240 g,購自山東省實(shí)驗(yàn)動物中心。隨機(jī)分為正常對照組、擴(kuò)張型心肌病(dilated cardio myopathy,DCM)模型組,阿托伐他汀處理組,每組10只。
(2)主要試劑及儀器:阿霉素(10 mg/瓶,共6瓶)購自北京嘉林藥業(yè)有限公司。兔抗大鼠多克隆抗體、HE染色試劑盒、Masson染色試劑盒、DAB顯色試劑盒均購自武漢博士德公司,阿托伐他汀片(20 mg/片,共7片)由瑞輝公司友情提供。
(3)動物模型制備:采用連續(xù)腹腔注射阿霉素法(2.5 mg·kg-1·w-1)制備擴(kuò)張型心肌病大鼠模型[1]。
(4)正常對照組給予等劑量0.9%氯化鈉溶液腹腔注射,共6周。模型制備成功后,阿托伐他汀處理組給予(12 mg·kg-1·d-1)灌胃。正常對照組、擴(kuò)張型心肌病模型組給予等量0.9%氯化鈉溶液灌胃,共12周。
2.觀察指標(biāo)及方法 (1)大鼠心功能及基本指標(biāo):實(shí)驗(yàn)12周時(shí),應(yīng)用動物心臟彩超(HRQ-230 A)獲取實(shí)驗(yàn)動物心功能相關(guān)指標(biāo),稱量體質(zhì)量,2%戊巴比妥鈉針左下腹腔注射充分麻醉后,取出各組大鼠心臟,用0.9%氯化鈉溶液清洗,稱各大鼠心臟質(zhì)量。
(2)HE染色法觀察心肌病理學(xué)變化:4%甲醛溶液固定心肌組織,石蠟包埋,切片。石臘切片依次放入二甲苯,乙醇脫蠟,用蒸餾水浸洗后,蘇木紫染色,0.1%鹽酸乙醇分化;浸泡伊紅液染色,風(fēng)干后中性樹膠封片,鏡檢觀察。
(3)Masson染色觀察心肌組織中膠原纖維的表達(dá)及含量:石蠟切片常規(guī)脫蠟至水洗;Weigert鐵蘇木精染液染核,1%鹽酸酒精分化,麗春紅酸性品紅染液染色,1%磷鉬酸溶液分化,甩干,苯胺藍(lán)染液復(fù)染,1%冰醋酸沖洗切片,快速水洗后,乙醇脫水,二甲苯透明、風(fēng)干后中性樹膠封片,鏡檢并攝片;隨機(jī)選取5個視野,Olmpus-BX50顯微鏡攝像系統(tǒng)攝像,膠原纖維呈藍(lán)色,肌肉、胞漿呈紅色,細(xì)胞核呈藍(lán)黑色。用高清晰彩色圖文報(bào)告分析系統(tǒng)分析,計(jì)算每個視野的心肌膠原面積與心肌總面積比值即心肌膠原容積分?jǐn)?shù)。
(4)RT-PCR檢測心肌組織中TGP-β1、miRNA208a、內(nèi)皮素(ET)、βMHC、COL-1表達(dá)水平:Trizol法提取總RNA,嚴(yán)格按RT-PCR試劑盒說明操作,各檢測指標(biāo)引物序列如下:GAPDH上游5′-ACAGCAACAGGGTGGTGGAC-3′,下 游:5′-TTTGAGGGTGCAGCGAACTT-3′;TGP-β1上 游:5′-GCGATCTAACCTGTTGCCTG-3′,下 游:5′-AGCCATGGAGTAGACATCCG-3′;βMHC上 游:5′-TACGATTATGCGTTCTTCTCCC-3′,下 游:5′-TCCTCCCTCTGCTTCTGTTTG-3′;ET上游:5′-TGTGTCTACTTCTGCCACCT-3′,下游:5′-CTGCATGGTACTTTGGGCTC-3′;COL-1上 游:5′-TGACTGGAAGAGCGGAGAGT-3′,下 游5′-GAATCCATCGGTCATGCTCT-3′;U6上游5′-CGCTTCGGCAGCACATATAC-3′,下 游5′-AAATATGGAACGCTTCACGA-3′;hsa-miR208a-5p loop primer5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACGCTTTTTG-3‘F primer 5′-TGCGCATAAGACGAGCA-3′mircoRNA反義鏈通用引物序列5′-CCAGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3′。RT-PCR反應(yīng)條件:50℃2 min,95℃10 min;95℃30 s,60℃30 s,40個循環(huán)。繪制溶解曲線,最終數(shù)據(jù)以2-△△Ct進(jìn)行分析。(RT-PCR儀器型號QuantStudio 6)
(5)Western blot法檢測心肌組織中TGP-β1、ET、βMHC、COL-1表達(dá)水平:石蠟組織切片脫蠟后行抗原修復(fù)封閉,然后分別滴加兔多抗GAPDH抗體(1:1 000稀釋),鼠單抗ET(1:1 000稀釋),鼠單抗βMHC(1:500稀釋),兔多抗TGFβ1(1:1 000稀釋),鼠單抗COL-1(1:1 000稀釋),4℃孵育過夜,TBST洗去多余一抗后分別滴加封閉液稀釋(1:50 000稀釋)的HRP標(biāo)記羊抗小鼠、羊抗兔二抗。TBST洗去多余二抗后滴加工作液覆上保鮮膜,X光膠片壓片、顯影、定影、沖洗膠片用BandScan分析膠片灰度值。
3.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。所有計(jì)量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,三組間比較采用單因素方差分析分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
1.動物心臟彩超結(jié)果 實(shí)驗(yàn)動物心臟彩超結(jié)果表明,與對照組相比,擴(kuò)心病模型大鼠心臟指數(shù)增加,大鼠LVEF降低,LVEDD明顯增大,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。阿托伐他汀組與擴(kuò)心病組比,LVEF提高、LVEDD減少,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。詳見表1。
表1 兩組大鼠心臟彩超結(jié)果比較()
表1 兩組大鼠心臟彩超結(jié)果比較()
注:與對照組相比,*P<0.05,與擴(kuò)心病組相比,#P<0.05
項(xiàng)目 對照組(n=9)擴(kuò)心病組(n=9)阿托伐他汀組(n=9)體質(zhì)量/g 367±15.5 250.5±15.6* 296.1±24.4#心臟指數(shù)/(mg/g) 2.02±0.1 2.89±0.43* 2.28±0.27#LVEDD/mm 6.34±0.39 7.60±0.52* 6.85±0.26#LVESD/mm 3.25±0.38 3.76±0.16* 3.41±0.15#LVEF% 91.3±1.65 74.1±2.78* 78.6±2.55#
2.心臟HE染色結(jié)果 對照組心肌纖維走形正常,排列緊密,心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰;擴(kuò)心病組心肌纖維走形一致,細(xì)胞間質(zhì)模糊,細(xì)胞肥大、水腫。阿托伐他汀組仍見細(xì)胞肥大、水腫。心肌纖維排列稀疏,走形基本正常(圖1)。
3.Masson染色結(jié)果 對照組心肌間質(zhì)見少量膠原纖維分布,擴(kuò)心病組膠原纖維較對照組明顯增多(P<0.05),而經(jīng)阿托伐他汀處理后心肌間質(zhì)膠原纖維含量降低(P<0.05,圖2)。
4.RT-PCR結(jié)果 與對照組相比,擴(kuò)心病組microRNA208a表達(dá)量及TGFβ1、ET、βMHC、COL-1 mRNA的表達(dá)量明顯增加,差異具體統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與擴(kuò)心病組相比,阿托伐他汀大鼠心肌組織中microRNA208a表達(dá)水平及TGFβ1、ET、βMHC、COL-1 mRNA的表達(dá)水平降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,圖3)。
5.Western blot結(jié)果 與對照組相比,擴(kuò)心病組TGFβ1、內(nèi)皮素(ET)、βMHC、膠原蛋白1(COL-1)蛋白的表達(dá)量明顯增加,差異具體統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與擴(kuò)心病組相比,阿托伐他汀組大鼠心肌組織中TGFβ1、ET、βMHC、COL-1蛋白的表達(dá)量降低(P<0.05)結(jié)果與RT-PCR檢測的上述指標(biāo)的mRNA的表達(dá)水平一致。差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示阿托伐他汀可減輕擴(kuò)心病大鼠模型心肌組織中TGFβ1、ET、βMHC、COL-1的過表達(dá)(圖4)。
圖1 各組大鼠心肌組HE染色(×400)A:對照組;B:擴(kuò)心病組;C:阿托伐他汀組
圖2 各組大鼠心肌組Masson染色(×400)A:對照組;B:擴(kuò)心病組;C:阿托伐他汀組
圖3 各組microRNA208a及TGFβ1、ET、βMHC、COL1的mRNA表達(dá)量 A:三組miRNA208a表達(dá)量的比較;B:三組TGFβ1mRNA表達(dá)量的比較;C:三組ET mRNA表達(dá)量的比較;D:三組βMHC mRNA表達(dá)量的比較;E:三組COL1 mRNA表達(dá)量的比較;注:與對照組相比,*P<0.05,與擴(kuò)心病組相比,#P<0.05
圖4 各組microRNA208a及TGFβ1、ET、βMHC、COL1的mRNA表達(dá)量A:對照組;B:擴(kuò)心病組;C:阿托伐他汀組;注:與對照組相比,*P<0.05,與擴(kuò)心病組相比,#P<0.05
心肌纖維化是擴(kuò)張型心肌病的重要病理生理變化。高糖可通過TGP-β1/Smad2信號通路促進(jìn)心肌纖維化,導(dǎo)致心功能下降[5]。抑制該信號通路則可減輕心肌纖維化程度[6]。ERK1/2可通過TGFβ1信號旁路促進(jìn)骨膜素的表達(dá)。而骨膜素是心肌纖維化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[7]。TGP-β1可促進(jìn)Rho相關(guān)激酶(ROCK)過表達(dá),從而抑制BMP-2的表達(dá),促進(jìn)心肌組織纖維化[8]。除此以外,TGFβ1還可以與血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2型受體結(jié)合直接導(dǎo)致纖維組織生成和膠原蛋白表達(dá)增多。減少TGP-β1的表達(dá)可能為一種逆轉(zhuǎn)心肌纖維化的重要方法。
miRNAs是一類大小約22核苷酸的非編碼RNA,多種miRNA參與了心肌纖維化的發(fā)生、發(fā)展[9-11]。miRNA208a是miRNA208家族一員,由β—MHC基因編碼,特異性表達(dá)于心肌組織。在心肌梗死大鼠模型中,miRNA208a促使心肌纖維化、肥大。降低miRNA208a的表達(dá),可減輕心肌纖維化的程度[12]。抑制miRNA208a的表達(dá)可減輕高鹽飲食大鼠心肌肥厚及周圍血管纖維化程度[13]。機(jī)械牽張H9C2細(xì)胞可通過TGP-β1刺激miRNA208a的表達(dá),從而促進(jìn)心肌細(xì)胞肥大及內(nèi)皮素、COL-1生成[14]。miRNA208a主要通過其靶標(biāo)內(nèi)皮素、β-MHC發(fā)揮其致心肌纖維化及心肌細(xì)胞肥大作用。內(nèi)皮素是一種跨膜糖蛋白,與TGFβ1具有共同受體。可調(diào)節(jié)TGFβ1在細(xì)胞外基質(zhì)中的合成作用。目前已有研究表明miRNA208a與擴(kuò)張型心肌病患者的LVEF成正相關(guān),與左心室收縮末期容量指數(shù)呈負(fù)相關(guān)。是很強(qiáng)的心臟不良事件發(fā)生率及心臟源猝死的重要預(yù)測因子,但其在擴(kuò)張型心肌病的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮作用的具體機(jī)制目前尚不清楚[15]。
本研究應(yīng)用阿霉素制造擴(kuò)張型心肌病大鼠模型,心臟彩超示心臟指數(shù)(mg/g)LVEDD、LVESD均明顯增大。免疫組織化學(xué)進(jìn)一步提示心肌間質(zhì)纖維化程度較正常對照組重。同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)其心肌組織TGP-β1、miRNA208a、內(nèi)皮素、βMHC、COL-1高表達(dá)。提示TGP-β1/miRNA208a信號通路在擴(kuò)張型心肌病心肌纖維化的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用,與COL-1的高表達(dá)密切相關(guān)。因此干預(yù)此信號通路可能降低心肌纖維化程度,從而改善心功能。阿托伐他汀是一種新型羥甲基戊二酰單酰輔酶A還原酶抑制劑。有研究表明,阿托伐他汀可通過抗炎作用抑制兔鈣化性主動脈瓣疾病病變發(fā)展進(jìn)程[16];可降低擴(kuò)張型心肌病患者血清炎癥因子水平[17]。田艷等研究發(fā)現(xiàn)阿托伐他汀可降低擴(kuò)張型心肌病大鼠心肌組織中TGFβ1的表達(dá),降低心肌纖維化[18]。通過本研究,我們觀察到經(jīng)阿托伐他汀處理后大鼠較擴(kuò)心病組大鼠LVEDD、LVESD縮小,射血分?jǐn)?shù)增高,表示阿托伐他汀具有一定改善擴(kuò)心病心肌重構(gòu)作用。同時(shí)通過心肌Masson染色,我們觀察到,經(jīng)阿托伐他汀處理后大鼠心肌組織纖維化程度明顯降低。我們進(jìn)一步證實(shí)阿托伐他汀改變了擴(kuò)張型心肌病模型大鼠心肌組織中TGFβ1/miRNA208a信號通路的表達(dá)。我們推測其降低心肌纖維化的左右 與其對該信號的調(diào)節(jié)有關(guān)。其機(jī)制可能與其具有一定的抑制炎癥反應(yīng)有關(guān)。
綜上所述,本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,阿托伐他汀具有一定減輕擴(kuò)心病大鼠心肌纖維的作用,該作用與 可能與其抑制TGFβ1/miRNA208a信號通路,降低COL-1的表達(dá)相關(guān)。但對其具體藥理作用機(jī)制尚需進(jìn)一步研究;阿托伐他汀抗炎、抗氧化作用是否與該途徑有關(guān)仍需進(jìn)一步研究。