魏海峰，趙肖依,2，王闖,2，劉潘,2，劉長發(fā),2,*，黃欣,2，霍玉潔,2，趙雨朦,2，夏寧,2

1. 大連海洋大學(xué)，遼寧省海洋近岸海洋環(huán)境科學(xué)與技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，大連 116023 2. 大連海洋大學(xué)，海洋科技與環(huán)境學(xué)院，大連 116023

多環(huán)芳烴化合物(polycyclic aromatic hydrocarbons, PAHs)是指由2個或2個以上苯環(huán)以線狀、角狀或簇狀排列的中性或非極性碳?xì)浠衔?，是一類典型持久性有機(jī)污染物，具有強(qiáng)致癌和致突變性[1]。多環(huán)芳烴因其化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、生物富集量高、難降解等特點(diǎn)，被列為海洋環(huán)境監(jiān)測的指標(biāo)之一[2-3]。

海洋環(huán)境中PAHs污染主要來源于海洋溢油事故以及沿海石油化工企業(yè)的廢水排放[4]。2008年我國進(jìn)口石油2億噸的90%經(jīng)海洋運(yùn)輸。2010年大連“7.16溢油”和2011年蓬萊“19-3溢油”事故中，多環(huán)芳烴是一類重要的污染因子[5-6]。近年來，國內(nèi)外學(xué)者對海洋中多環(huán)芳烴開展了相關(guān)研究，取得了一定的研究進(jìn)展。高穎等[7]研究了海水和海洋沉積物中多環(huán)芳烴的分布情況，發(fā)現(xiàn)我國南黃海海水中PAHs溶解態(tài)和顆粒態(tài)中PAHs的總濃度為15.8～233.4 ng·L-1；大遼河口、黃河口中海洋沉積物中的PAHs含量均較高，其中大遼河口海洋沉積物中PAHs的含量范圍為276.3～1 606.9 ng·g-1；河口區(qū)域海洋沉積物中PAHs略高于近岸海域沉積物中PAHs。葉志波等[8]研究了消油劑對海洋溢油中PAHs環(huán)境行為的影響，發(fā)現(xiàn)消油劑能增大溢油中PAHs在海水中的溶解度，促進(jìn)形成粒徑更小的化學(xué)分散油滴，而較小的油滴更容易和海洋中懸浮顆粒物(suspended particulate matter, SPM)作用形成油-顆粒物聚集體(oil-SPM aggregates, OSAs)。此外，消油劑還會對溢油的遷移及PAHs的生物降解產(chǎn)生影響。鄭關(guān)超等[9]研究了環(huán)渤海地區(qū)養(yǎng)殖水產(chǎn)品中PAHs污染殘留及健康風(fēng)險的問題，發(fā)現(xiàn)該區(qū)域養(yǎng)殖水產(chǎn)品中PAHs污染狀況較為普遍，尤其是菲的平均含量及檢出率最高；還發(fā)現(xiàn)PAHs污染表現(xiàn)出一定的生物相關(guān)性。

菲是最具代表性的三環(huán)PAHs，其在石油中含量較高，而3-甲基菲是菲的烷基化衍生物，存在于煙氣之中[10]。蒽的9,10位比較活潑，很容易發(fā)生諸如溴化、醛化、溴甲基化等反應(yīng)而與其他化合物作用形成功能材料[11]。9,10-甲基蒽多用于有機(jī)合成、染料制備。多環(huán)芳烴的化學(xué)性質(zhì)與其結(jié)構(gòu)相關(guān)，針對多環(huán)芳烴的結(jié)構(gòu)特征，一些學(xué)者提出了“K區(qū)”理論和“L區(qū)”理論。具有3～4環(huán)的PAH，因分布廣泛、烷基大小、組成不同構(gòu)成了一系列化合物，這類化合物的持久性可以導(dǎo)致慢性毒性的發(fā)生，并且可以小到被水生生物富集在組織體內(nèi)[12]。3-甲基菲和9,10-甲基蒽是中國海洋溢油優(yōu)先監(jiān)測的16種多環(huán)芳烴(PAHs)中的2種。鮑魚作為北方地區(qū)具有極為重要經(jīng)濟(jì)價值和食用價值的經(jīng)濟(jì)動物，然而隨著海洋環(huán)境污染加重，鮑魚對PAHs的生物富集成為影響鮑魚生長發(fā)育和威脅人體健康的重要因素[13-14]。但是目前國內(nèi)外對于PAHs在鮑魚體內(nèi)富集過程研究較少。依據(jù)PAHs在海洋環(huán)境中的分布特征和海洋生物在海洋生態(tài)系統(tǒng)中的重要作用，本研究選擇皺紋盤鮑作為受試生物，開展了3-甲基菲和9,10-甲基蒽2種多環(huán)芳烴對鮑魚的毒性作用研究，以期為確定我國海洋環(huán)境多環(huán)芳烴的環(huán)境基準(zhǔn)、保護(hù)海洋生態(tài)環(huán)境提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)用海水為來自大連黑石礁海域的砂濾海水，鹽度為30～31，pH為7.8～8.1，進(jìn)行沙濾充分曝氣后使用。實(shí)驗(yàn)用鮑魚苗，殼長(3±0.3) cm，購買自大連太平洋海珍品有限公司，于實(shí)驗(yàn)室海水養(yǎng)殖循環(huán)系統(tǒng)中暫養(yǎng)1周后，選取健康的個體用于實(shí)驗(yàn)。氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC6890N/MSD5975B, Agilent Co, USA)；加速溶劑提取儀(ASE350, Dionex Co, USA)；Heidolph旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(Hei-VAP, 德國)；所有試劑(正己烷、二氯甲烷、丙酮)均為農(nóng)殘級，購自TEDIA公司，硅膠(0.100 mm)購自Merck公司，弗羅里硅土(Florsil, 60～100目)購自美國Floridin公司。內(nèi)標(biāo)(替代內(nèi)標(biāo)Z-014J：含菲-d10和芘-d12；進(jìn)樣內(nèi)標(biāo)：三聯(lián)苯-d14)購自Wellington公司。3-甲基菲和9,10-甲基蒽是我國海洋溢油優(yōu)先監(jiān)測的幾種PAHs，在所有水產(chǎn)養(yǎng)殖海域監(jiān)測中均有發(fā)現(xiàn)。因此選擇此2種PAHs作為研究對象。實(shí)驗(yàn)用3-甲基菲和9,10-甲基蒽購買自Sigma公司(Sigma-Aldrich Corporation, USA)，純度分別大于97%和98%；使用丙酮(濃度為99.5%)作為助溶劑將2種PAHs配制成一定濃度的母液。

1.2 生物蓄積實(shí)驗(yàn)

通過96 h急性毒性實(shí)驗(yàn)得到2種PAHs 3-甲基菲和9,10-甲基蒽對鮑魚的半致死濃度LC50分別為653.7 μg·L-1和488.5 μg·L-1。以此為依據(jù)設(shè)置2種PAHs的生物蓄積實(shí)驗(yàn)所需PAHs的濃度。3-甲基菲濃度分別為5、10、100 μg·L-1，9,10-甲基蒽的濃度分別為5、10、50 μg·L-1。另外設(shè)置1組海水對照組，1組丙酮對照組，丙酮濃度為所加入所有體系的最大量的0.01%。每組設(shè)置3個重復(fù)，每個1 L玻璃燒杯中放入鮑魚12只。試驗(yàn)期間保持充氧，使水中溶解氧濃度保持6 mg·L-1以上，實(shí)驗(yàn)水溫為18～20 ℃，每天定時投喂一次鮮海帶，投喂量為體質(zhì)量(以第一次稱重為準(zhǔn))的1.5%。以此時為時間起始點(diǎn)，每天換一次新鮮海水，投加相應(yīng)的污染物至所設(shè)置的濃度。取樣時間，自實(shí)驗(yàn)開始第3、7、14天取樣，每次每個處理組取鮑魚3只，用錫箔紙包裹，放入-80 ℃冰箱保存待測。

1.3 樣品處理

本文對鮑魚體內(nèi)3-甲基菲和9,10-甲基蒽的測定方法依據(jù)李天云等[15]對生物體內(nèi)多環(huán)芳烴測定所采用的氣相色譜-質(zhì)譜法。全量稱取冷凍干燥后的生物樣品，加入無水硫酸鈉和氘代回收率指示物(Z-014J, 10.0 μg·mL-1)用來控制樣品前處理的目標(biāo)化合物的回收率，用100 mL正己烷和丙酮混合溶液(1:1,V:V)進(jìn)行加速溶劑萃取，萃取溫度100 ℃，加熱時間5 min，靜態(tài)時間10 min，循環(huán)3次，沖洗體積60%，吹掃時間60 s。樣品提取液過無水硫酸鈉小柱，加鹽酸處理過的銅粉除硫：生物樣品提取液直接轉(zhuǎn)入潔凈的燒瓶中，加入一定量(視有機(jī)相的透明度而定)的酸性硅膠，磁力攪拌約0.5 h。去除脂肪等大分子雜質(zhì)將萃取液濃縮至2.0 mL左右，濃縮液過佛羅里土(5.0 g)與硅膠(8.0 g)復(fù)合柱凈化，50 mL正己烷預(yù)淋洗，80 mL正己烷/二氯甲烷(1:1,V:V)淋洗液，接取淋洗液濃縮定容至200 μL，添加1 μL進(jìn)樣內(nèi)標(biāo)(三聯(lián)苯-d14, 10.0 μg·mL-1)。上機(jī)測定，加入內(nèi)標(biāo)的作用為了消除系統(tǒng)誤差及定量目標(biāo)化合物。樣品采用DB-5ms毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)進(jìn)行氣相分離，采用EI源電離方式進(jìn)行質(zhì)譜檢測。色譜柱升溫程序?yàn)椋?0 ℃開始，不停留；以4 ℃·min-1升溫到220 ℃，停留3 min；以10 ℃·min-1升溫到300 ℃，停留9 min。載氣(氦氣)流速為1.0 mL·min-1，恒流，進(jìn)樣口溫度280 ℃，無分流進(jìn)樣，進(jìn)樣量為1 μL；傳輸線溫度290 ℃，四極桿溫度150 ℃，離子源溫度230 ℃，離子掃描為SIM模式。

所有樣品和空白中標(biāo)準(zhǔn)替代內(nèi)標(biāo)3-甲基菲和9,10-甲基蒽回收率分別71.2%～83.9%和65.5%～88.3%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為7.3%和6.7%，每個樣品3個平行測試?？瞻讓?shí)驗(yàn)結(jié)果顯示所有目標(biāo)物低于方法檢測限，文中給出的數(shù)據(jù)均已經(jīng)過回收率校準(zhǔn)。

1.3.1 雙箱動力學(xué)模型

雙箱動力學(xué)模型是在近幾年發(fā)展起來的一類數(shù)學(xué)模型，主要用于重金屬、有機(jī)污染物的生物富集研究，它能較好地描述污染物在水體與生物體之間的作用過程，并能模擬出達(dá)到生物富集平衡情況下的動力學(xué)參數(shù)(圖1)。

圖1 生物富集雙箱動力學(xué)模型Fig. 1 Two-compartment kinetic model of bioconcentration

雙箱動力學(xué)模型生物富集公式為：

CA=C0+Cw×K1/K2×(1-e-K2t) (0

(1)

其中：CA為生物體中PAHs濃度(ng·g-1)；C0為實(shí)驗(yàn)開始前生物體內(nèi)PAHs濃度(ng·g-1)；K1為吸收速率常數(shù)，K2為釋放速率常數(shù)，Cw為水體中PAHs濃度(μg·L-1)，t*為富集天數(shù)。由方程(1)進(jìn)行非線性擬合可得到K1、K2。

理論平衡狀態(tài)下BCF用公式(2)表示：

BCF=K1/K2=limCA/Cw(t→∞)

(2)

生物半衰期公式：

t1/2=ln2/K2

(3)

富集達(dá)到平衡時，生物體內(nèi)PAHs含量Cmax用公式表示為:

Cmax=BCF×Cw

(4)

1.3.2 模型的擬合優(yōu)度檢驗(yàn)

應(yīng)用MatLab2014A對數(shù)據(jù)進(jìn)行非線性擬合，根據(jù)3個實(shí)驗(yàn)濃度的生物富集量數(shù)據(jù)獲得3個方程(1)，以上3個方程(1)聯(lián)立，可得到K1、K2，結(jié)合判定系數(shù)R2來評價該模型的擬合優(yōu)度，并采用F檢驗(yàn)對模型整體的顯著性進(jìn)行檢驗(yàn)，以此驗(yàn)證雙箱模型用于鮑魚對PAHs的生物富集研究的可行性。采用SSPS 13.0軟件(SPSS Inc.)對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和回歸分析。采用ANOVA方法分析PAHs暴露組與空白對照組之間的差異，P<0.05、P<0.01表示差異顯著。

2 結(jié)果(Results)

從圖2可知，空白對照組和丙酮對照組檢測出少量的9,10-甲基蒽，由于對照組并未加入該污染物，因此可以判定對照組中的9,10-甲基蒽來自環(huán)境本底值。隨著暴露時間的延長，9,10-甲基蒽在鮑魚體內(nèi)的蓄積量也有所增長，說明鮑魚體內(nèi)沒有或者有少部分代謝的途徑無法通過該途徑使9,10-甲基蒽代謝出體外。如表1所示，隨暴露時間的延長鮑魚體內(nèi)的蓄積量越來越多，濃度為5 μg·L-1條件下，符合雙箱動力學(xué)模型，K1=1.494，K2=0.101，R2=0.977(95%置信區(qū)間)。9,10-甲基蒽在10 μg·L-1濃度條件下隨著暴露時間的延長，9,10-甲基蒽在鮑魚體內(nèi)的蓄積量也有所增長，符合雙箱動力學(xué)模型，K1=3.906，K2=0.584，R2=0.760(95%置信區(qū)間)。在50 μg·L-1濃度下，9,10-甲基蒽在鮑魚體內(nèi)的蓄積量隨時間一直增加，使用雙箱動力學(xué)模型進(jìn)行擬合，K1=9.431，K2=0.533，R2=0.759(95%置信區(qū)間)。在5 μg·L-1和10 μg·L-1濃度下，3～14 d生物蓄積量之間差異不顯著(P<0.05)，認(rèn)為在第3天達(dá)到富集平衡。

從圖3可知，在5 μg·L-1濃度的情況下鮑魚對于3-甲基菲富集第3天富集量與第14天富集量之間無顯著差異(P<0.05)，說明鮑魚對3-甲基菲富集在第3天達(dá)到了平衡。如表1所示，在5 μg·L-1濃度下，鮑魚符合雙箱動力學(xué)模型，K1=3.308，K2=0.462，R2=0.912(95%置信區(qū)間)。10 μg·L-1濃度下，隨著3-甲基菲濃度的升高，3-甲基菲在鮑魚體內(nèi)的蓄積量明顯增加，其雙箱動力學(xué)模型參數(shù)分別為K1=3.061，K2=0.261，R2=0.994(95%置信區(qū)間)。在100 μg·L-1的濃度下，鮑魚體內(nèi)3-甲基菲隨著暴露時間的延長蓄積量也有所增長。此濃度下K1=0.538，K2=0.377，R2=0.919(95%置信區(qū)間)。

圖2 9,10-甲基蒽在鮑魚體內(nèi)富集過程Fig. 2 Enrichment of 9,10-dimethylanthracene in abalone Haliotis discus hannai

圖3 3-甲基菲在鮑魚體內(nèi)富集過程Fig. 3 Enrichment process of 3-methylphenanthrene in abalone Haliotis discus hannai

表1 鮑魚對2種多環(huán)芳烴(PAHs)3 d、7 d和14 d的生物富集動力學(xué)參數(shù)Table 1 Bioaccumulation kinetic parameters of two polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) (3 d, 7 d and 14 d) with different concentrations of H. discus hannai

注：BCF表示生物富集因子，Cmax表示平衡狀態(tài)下鮑魚體內(nèi)2種多環(huán)芳烴的含量，t1/2表示生物學(xué)半衰期。

Note: BCF represents biological enrichment factor;Cmaxrepresents the content of two polycyclic aromatic hydrocarbons in abalone at equilibrium;t1/2represents the biological half-life.

3 討論(Discussion)

PAHs一旦通過各種途徑進(jìn)入水生生物體內(nèi)，易積累于生物脂肪中，形成生物富集，對生物體造成巨大的傷害[16]。目前，有關(guān)PAHs的生態(tài)毒理學(xué)研究大部分涉及陸生動物和淡水生物[17-20]。李磊等[21]研究了苯并[a]芘、菲在縊蟶體內(nèi)的富集情況，發(fā)現(xiàn)縊蟶對苯并[a]芘的富集能力高于菲；縊蟶對苯并[a]芘、菲的K1平均值分別為0.44、0.36，K2平均值分別為0.0016、0.0030，BCF平均值分別為268.18、118.57。K1、BCF均隨苯并[a]芘、菲暴露濃度的增大而減少。陳輝輝等[22]研究了PAHs對唐魚的急性毒性效應(yīng)，發(fā)現(xiàn)菲和萘對唐魚96 h的LC50分別為0.913 mg·L-1和10.849 mg·L-1，其安全質(zhì)量濃度分別為0.091 mg·L-1和1.085 mg·L-1。本研究表明，14 d內(nèi)鮑魚體內(nèi)吸收9,10-甲基蒽和3-甲基菲的濃度最大可達(dá)960.3 μg·L-1和600 μg·L-1，隨著PAHs濃度的增加，鮑魚對2種PAHs的生物富集量逐漸增加。鮑魚體內(nèi)PAHs含量在前期增加迅速，隨后增加趨于平衡。與高萍等[23]對菲律賓蛤仔對石油烴的富集與釋放特征的研究一致。究其原因，生物體對有機(jī)污染物的吸收主要取決于其生物體體內(nèi)脂肪與水體中有機(jī)物的比例[24-26]。實(shí)驗(yàn)開始時鮑魚體內(nèi)PAHs含量比較低，生物體開始大量吸收PAHs，污染物主要由水相向有機(jī)相遷移，即生物體體內(nèi)脂肪對PAHs的吸附起主要作用，此時吸附速率K1高于釋放速率K2。經(jīng)過一段時間富集以后，鮑魚體內(nèi)PAHs逐漸趨于飽和，富集增加幅度減小。

與母體多環(huán)芳烴相比，烷基多環(huán)芳烴具有種類繁多，持久性更強(qiáng)的特點(diǎn)。在受石油污染的環(huán)境中，水生生物體內(nèi)的烷基多環(huán)芳烴含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于非烷基多環(huán)芳烴。在瓦德茲溢油事件中，當(dāng)海水青鳉(Oryziasmelastigma)暴露在含有高濃度的烷基化合物中，死亡率、畸形率都明顯升高，說明烷基化合物對早期幼魚的發(fā)育影響占有主要地位[27]。

實(shí)驗(yàn)由于使用了丙酮作為助溶劑提高了2種PAHs的水溶性，因此生物富集能力可能得到了進(jìn)一步加強(qiáng)。鮑魚較其他水生生物相比，富集系數(shù)從大到小為：三疣梭子蟹>圓海鰺≈棱鯔≈鮑魚>鱸魚>河蜆[28-29]。鮑魚富集系數(shù)在1.05～19.21之間，屬于低富集能力，低代謝能力的生物，鮑魚對于多環(huán)芳烴富集系數(shù)隨時間和濃度呈指數(shù)增長。Cmax的范圍是75.7～960.3 μg·L-1，說明在不同PAHs濃度下生物體內(nèi)達(dá)到富集平衡時的濃度是不同的。半衰期的不同也說明鮑魚對PAHs的代謝程度。由此推斷，在低濃度PAHs污染海域的鮑魚受到的影響可能并不嚴(yán)重。但如果是高濃度PAHs污染海域，鮑魚富集能力增強(qiáng)，且難以代謝，可能造成嚴(yán)重的后果。建議海洋環(huán)境管理部門加強(qiáng)對海洋環(huán)境中的16種優(yōu)先監(jiān)測PAHs的監(jiān)測，及時對養(yǎng)殖環(huán)境質(zhì)量狀況做出評價和預(yù)警；同時應(yīng)加強(qiáng)入海排污總量的管理，嚴(yán)格控制石油類污染物的排放量，保護(hù)海洋環(huán)境特別是海珍品如鮑魚、海參、扇貝等養(yǎng)殖區(qū)水環(huán)境。

表2 文獻(xiàn)中水生生物對PAHs的生物富集系數(shù)Table 2 Literature data on BCF of PAHs for various aquatic organisms