楊占寧，丁光輝,*，于源志，李西山，張楠楠，李瑞娟，張晶，崔福旭

1. 大連海事大學 環(huán)境科學與工程學院，大連 116026 2. 武漢大學 生命科學學院，武漢 430072 3. 大連大學 環(huán)境與化工學院，大連 116622

單壁碳納米管(Single-Walled Carbon Nanotubes, SWCNTs)是一種典型的碳納米材料，其幾何結構可以視為由單層石墨烯卷曲而成。SWCNTs具有巨大的比表面積和優(yōu)異的電子、機械、力學等性能，在電子、化工、醫(yī)學以及環(huán)境保護等方面展現(xiàn)出巨大的應用價值[1]。隨著碳納米科技領域的迅速發(fā)展，在其生產(chǎn)、使用和處置等過程中不可避免地產(chǎn)生環(huán)境排放，其潛在的生態(tài)安全及健康風險日益受到研究者的重視[2]。

海洋是地球上位勢最低的地方，也是污染物的匯聚地，能夠通過廢水排放、地表徑流、大氣沉降等多種方式匯聚各種污染物。受海水高離子強度和碳納米材料易團聚性質(zhì)的共同作用，沿海地區(qū)將成為碳納米材料的最終聚集地和高暴露風險區(qū)域。細菌、藻類、甲殼類動物及魚類的急性毒性實驗數(shù)據(jù)表明，納米顆粒(nanometer particles, NPs)對水生物種具有一定的毒性效應[3-5]。已有的毒理學研究表明，碳納米材料暴露能夠在生物體內(nèi)形成超氧陰離子等氧自由基[6]，進而發(fā)生歧化反應產(chǎn)生額外的活性氧(reactive oxygen species, ROS)，致使生物體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)失衡，引起生理生化過程的異常[7]，即所謂的氧化應激。Canesi等[8]發(fā)現(xiàn)富勒烯(C60)和納米TiO2暴露導致海洋貽貝消化腺中的溶酶體膜失衡及脂褐質(zhì)的堆積。Ringwood等[9]將美洲牡蠣暴露于C60，發(fā)現(xiàn)牡蠣的肝胰腺組織中出現(xiàn)大量的溶酶體，并產(chǎn)生較高的內(nèi)吞作用。

海洋雙殼貝類具有高度發(fā)達的微納米級顆粒的細胞內(nèi)化系統(tǒng)，其強大的吞噬作用可以濾過大量的水、微藻、細菌及沉積物，使得其組織中累積大量的納米顆粒[10]。太平洋牡蠣(Crassostreagigas)是一種典型的海洋底棲雙殼類生物，其運動能力較弱，沿海分布廣泛，對鹽度的適應性較強，易受水體中碳納米顆粒的暴露影響，是研究NPs毒性效應的理想模式生物。因此，本研究采用太平洋牡蠣作為受試生物，研究SWCNTs暴露對其造成的毒性效應以及牡蠣自身的防御行為，以期為碳納米管的海洋生態(tài)風險評價提供科學依據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實驗材料

實驗用太平洋牡蠣購于大連環(huán)洲水產(chǎn)市場。實驗前，篩選體長5～8 cm、健康的牡蠣于實驗室海水循環(huán)養(yǎng)殖系統(tǒng)中馴養(yǎng)一周以適應實驗環(huán)境。馴養(yǎng)條件為：溫度17～18 °C；鹽度34 PSU；馴養(yǎng)期間定時投喂單孢藻粉。

SWCNTs(Purity: >95 wt%, OD: <2 nm, Length: 1～3 μm)購自中國科學院成都有機化學有限公司。

實驗用總超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)試劑盒、過氧化氫酶(catalase, CAT)試劑盒、丙二醛(malondialdehyde, MDA)試劑盒以及總蛋白定量試劑盒均購自南京建成生物有限公司；P-gp蛋白抑制劑Tariquidar(XR9576)購自MedChem Express (MCE)公司；總RNA提取試劑(RNAiso Plus)和反轉錄試劑盒(PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser)購自寶生物工程有限公司；熒光定量PCR染料(SYBR Green)購于羅氏(Roche)診斷產(chǎn)品有限公司。

1.2 實驗方法

SWCNTs采用混酸(硫酸∶硝酸=3∶1)酸化24 h，超聲分散于天然海水中。SWCNTs的暴露濃度設為0、0.1、1及10 mg·L-1。每個濃度組3只牡蠣，暴露于2 L的SWCNTs海水溶液中，暴露時長設為48 h和96 h。

為分析P-gp蛋白抑制劑在牡蠣防御外源污染物的毒性效應中的作用，開展了P-gp蛋白抑制劑Tariquidar和SWCNTs復合暴露的實驗。該部分實驗設置空白對照組(CK)、0.3 mg·L-1的Tariquidar暴露組、0.1 mg·L-1的SWCNTs暴露組、以及0.1 mg·L-1的SWCNTs和0.3 mg·L-1的Tariquidar復合暴露組，暴露時長為96 h。

暴露終點時，分別解剖并采集牡蠣的鰓和消化腺組織樣品進行抗氧化酶活性測定、氧化損傷和基因相對表達量分析。采用試劑盒測定牡蠣鰓和消化腺中SOD和CAT抗氧化酶活性及脂質(zhì)過氧化物MDA含量的變化。采用實時熒光定量PCR(q-PCR)測定cat基因、熱休克蛋白70(heat shock protein 70,hsp70)基因、交替氧化酶(alternative oxidase,aox)基因及細胞凋亡基因(caspase-7)的相對表達量變化。相關基因的引物設計信息如表1所示。

圖1 太平洋牡蠣組織中抗氧化酶活性變化注：字母相同表示沒有顯著性差異，字母不同表示差異顯著，P≤0.05。Fig. 1 Changes of activities of antioxidant enzyme in Crassostrea gigas tissuesNote: The same letters mean no significant difference; the different letters indicate significant difference, P≤0.05.

表1 相關基因的引物設計信息Table 1 The primer information of genes studied

圖2 太平洋牡蠣組織中MDA含量變化注：字母相同表示沒有顯著性差異，字母不同表示差異顯著，P≤0.05。Fig. 2 Changes in the MDA content in tissues of C. gigasNote: The same letters mean no significant difference; the different letters indicate significant difference, P≤0.05.

圖3 太平洋牡蠣組織中抗氧化基因相對表達量變化注：字母相同表示沒有顯著性差異，字母不同表示差異顯著，P≤0.05。Fig. 3 The relative expression of antioxidant genes in C. gigas tissuesNote: The same letters mean no significant difference; the different letters indicate significant difference, P≤0.05.

圖4 太平洋牡蠣組織中caspase-7相對表達量的變化注：字母相同表示沒有顯著性差異，字母不同表示差異顯著，P≤0.05。Fig. 4 The relative expression of caspase-7 in C. gigas tissuesNote: The same letters mean no significant difference; the different letters indicate significant difference, P≤0.05.

本研究采用SPSS 13.0軟件(SPSS Inc.)對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。不同處理組間的比較采用單因素方差分析，P≤0.05表示差異顯著。

2 結果與分析(Results and analysis)

2.1 SWCNTs暴露對太平洋牡蠣的氧化損傷

2.1.1 太平洋牡蠣鰓和消化腺中抗氧化酶活性變化

SWCNTs暴露后，太平洋牡蠣鰓和消化腺中SOD和CAT酶活性變化如圖1所示。暴露48 h后，暴露組牡蠣組織中抗氧化酶活性與對照組相比，并沒有顯著性差異(P>0.05)；但在暴露96 h后，暴露組牡蠣的2種組織中抗氧化酶活性較對照組均有顯著性升高(P≤0.05)，且呈現(xiàn)出隨暴露濃度升高而升高的劑量-效應關系。鰓是牡蠣首先暴露于SWCNTs的器官，其SOD活性變化較消化腺明顯；抗氧化系統(tǒng)中CAT是SOD的后續(xù)酶，其在消化腺中的酶活性變化較鰓中更明顯。

2.1.2 太平洋牡蠣鰓和消化腺中MDA含量的變化

SWCNTs暴露后，太平洋牡蠣鰓和消化腺中MDA含量變化如圖2所示。暴露48 h后，暴露組太平洋牡蠣組織中MDA含量與對照組并沒有顯著性差異(P>0.05)；但是在暴露96 h后，暴露組牡蠣的2種組織中的MDA含量較對照組均有顯著性升高(P≤0.05)，且在消化腺中呈現(xiàn)出隨暴露濃度升高而升高的劑量-效應關系。在鰓中，MDA含量即使在低劑量(0.1 mg·L-1)下，也與對照產(chǎn)生顯著性差異，表明SWCNTs暴露在太平洋牡蠣鰓組織中容易產(chǎn)生氧化損傷。

2.2 太平洋牡蠣鰓和消化腺中相關基因相對表達量的變化

2.2.1 太平洋牡蠣鰓和消化腺中抗氧化系統(tǒng)相關基因相對表達量的變化

SWCNTs暴露后，太平洋牡蠣鰓和消化腺中cat、hsp70、aox基因相對表達量變化如圖3所示。太平洋牡蠣鰓和消化腺中cat基因的相對表達量呈現(xiàn)出與CAT活性相似的變化趨勢。hsp70基因的相對表達量在暴露48 h和96 h后呈現(xiàn)相似的變化趨勢，即在低濃度(0.1 mg·L-1)時與對照組沒有顯著性差異(P>0.05)，而在相對較高的濃度(1～10 mg·L-1)下呈現(xiàn)出顯著的上調(diào)(P≤0.05)。aox基因的相對表達量呈現(xiàn)出隨暴露濃度升高而顯著上調(diào)的趨勢，而且隨暴露時間增長，aox基因的相對表達量上調(diào)越顯著(P≤0.05)。這些基因表達的變化與抗氧化酶活性的變化相一致。

2.2.2 太平洋牡蠣鰓和消化腺中caspase-7基因相對表達量的變化

如圖4所示，SWCNTs暴露48 h后，牡蠣2種組織中caspase-7基因的相對表達量在0.1 mg·L-1的暴露濃度下呈現(xiàn)顯著的下調(diào)(P≤0.05)。隨著暴露濃度的升高，caspase-7基因的相對表達量持續(xù)升高，在10 mg·L-1的暴露濃度下呈現(xiàn)出顯著的上調(diào)(P≤0.05)。隨暴露時間延長到96 h，caspase-7基因的相對表達量呈現(xiàn)出單調(diào)上升的劑量-效應關系。

2.3 太平洋牡蠣對SWCNTs的防御機制

2.3.1 太平洋牡蠣鰓和消化腺中p-gp蛋白基因相對表達量的變化

經(jīng)過96 h的SWCNTs暴露，太平洋牡蠣鰓和消化腺中p-gp蛋白基因相對表達量呈現(xiàn)出隨暴露濃度升高而逐漸升高的劑量-效應關系，且消化腺中的表達量略高于鰓(圖5)。這一方面表明隨外源污染物暴露濃度的增加，牡蠣的外排機制不斷增強；另一方面也表明，即使在10 mg·L-1的暴露濃度下，太平洋牡蠣防御機制還在起積極作用，能夠耐受較高濃度的SWCNTs的暴露。

2.3.2 復合暴露下太平洋牡蠣鰓和消化腺中MDA含量的變化

復合暴露實驗中，太平洋牡蠣鰓和消化腺中MDA含量變化如圖6所示。0.1 mg·L-1的SWCNTs和0.3 mg·L-1的Tariquidar單獨暴露均導致太平洋牡蠣組織中MDA的含量顯著升高(P≤0.05)。0.1 mg·L-1的SWCNTs和0.3 mg·L-1的Tariquidar的復合暴露使MDA含量相對于空白和單獨暴露均產(chǎn)生顯著性升高(P≤0.05)。這表明Tariquidar的加入顯著抑制了P-gp蛋白活性，導致太平洋牡蠣排出外源污染物的能力降低，致使更多的SWCNTs富集于組織細胞內(nèi)，進而造成更嚴重的氧化損傷。

3 討論(Discussion)

3.1 SWCNTs暴露對太平洋牡蠣的損傷作用

目前，關于SWCNTs的毒理學研究多集中于陸生哺乳生物及淡水生物，對海洋生物研究較少，其毒性作用機制也尚未明確[11]。已有毒理學研究表明，SWCNTs所產(chǎn)生毒性主要表現(xiàn)為：①氧化損傷：由于材料表面的電子活性位點(給電子或受電子基團)能與氧分子發(fā)生作用，生成大量的ROS，這些ROS作用于細胞膜表面的多不飽和脂肪酸，產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化，進而引起細胞膜結構和功能受損；②蛋白及DNA損傷：當機體氧化損傷程度嚴重時，細胞膜被破壞，大量的納米顆粒侵入細胞內(nèi)，造成嚴重的蛋白質(zhì)變性及DNA損傷。

MDA含量可以作為機體受到氧化損傷程度的一個指標[12]。SWCNTs暴露48 h后，太平洋牡蠣鰓和消化腺內(nèi)未產(chǎn)生顯著性的MDA含量增加。而在暴露96 h后，2個組織中的MDA含量均顯著升高。這表明，在本研究的暴露劑量下，短期48 h的暴露并未產(chǎn)生明顯的氧化損傷，但是隨著暴露時間延長到96 h，SWCNTs暴露在牡蠣鰓和消化腺中產(chǎn)生了一定程度的氧化損傷，且鰓和消化腺的損傷程度表現(xiàn)出一定的差異。當暴露對太平洋牡蠣產(chǎn)生效應時，鰓所受到的氧化損傷程度明顯高于消化腺；隨暴露濃度升高，消化腺所受到的氧化損傷隨之顯著升高，而鰓所受到的損傷已經(jīng)達到了較高水平，并未隨暴露濃度升高而升高。導致這種現(xiàn)象的主要原因是由于鰓是牡蠣首先暴露于污染物的器官，SWCNTs最先在鰓中誘導氧化應激。隨著SWCNTs逐漸被消化腺所吸收和富集，才逐漸在消化腺中造成氧化損傷。Trevisan等[13]的研究結果表明短期暴露于納米氧化鋅的太平洋牡蠣并沒有表現(xiàn)出明顯的氧化應激，但是在相對長時間的暴露下，牡蠣體內(nèi)的抗氧化酶水平顯著升高；而且鰓是納米氧化鋅產(chǎn)生毒性效應的初始靶器官，而消化腺則呈現(xiàn)出延遲的毒性效應。D'Agata等[14]的研究則表明貝類消化腺中納米二氧化鈦的累積量是鰓中的10倍以上。因此，隨著暴露時間的延長，消化腺可能成為納米顆粒暴露的主要靶器官。

圖5 太平洋牡蠣組織中p-gp相對表達量的變化注：字母相同表示沒有顯著性差異，字母不同表示差異顯著，P≤0.05。Fig. 5 The relative expression of p-gp in tissues of C. gigasNote: The same letters mean no significant difference; the different letters indicate significant difference, P≤0.05.

圖6 太平洋牡蠣組織中MDA含量變化注：字母相同表示沒有顯著性差異，字母不同表示差異顯著，P≤0.05。SWCNTs表示單壁碳納米管。Fig. 6 Changes in the MDA content in tissues of C. gigasNote: The same letters mean no significant difference; the different letters indicate significant difference, P≤0.05. SWCNTs stands for single-walled carbon nanotubes.

細胞凋亡是一種細胞程序性死亡，是生物體對各種應激源反應的重要防御機制[15]。通過對太平洋牡蠣細胞凋亡基因家族中caspase-7相對表達量的測定發(fā)現(xiàn)相對長時間和較高濃度的SWCNTs暴露誘導太平洋牡蠣組織產(chǎn)生顯著性的細胞凋亡(P≤ 0.05)，表明SWCNTs暴露已經(jīng)對太平洋牡蠣產(chǎn)生了一定的毒性效應，誘導機體通過調(diào)控細胞凋亡基因的表達以清除受到損傷的細胞[16]。

3.2 太平洋牡蠣對SWCNTs的防御機制

太平洋牡蠣體內(nèi)有多種抗氧化酶類可以清除ROS，如SOD、CAT和谷胱甘肽等。這些酶的活性可以反映機體受到的氧化損傷程度[17]。SOD可以將體內(nèi)的ROS催化生成H2O2，CAT則能夠清除過量的H2O2[18]，從而降低SWCNTs誘導產(chǎn)生的ROS。本研究結果表明，牡蠣在受到SWCNTs的刺激下，體內(nèi)的SOD和CAT活性增加以幫助其防御氧化損傷，牡蠣鰓作為最先接觸SWCNTs的組織，為了清除過量的ROS，SOD活性相應的上調(diào)；SWCNTs被吸收進入消化腺需要一定的時間，因此消化腺中SOD活性相對于鰓中偏低。在暴露96 h后，鰓和消化腺內(nèi)CAT活性顯著升高(P≤0.05)。Tedesco等[19]的研究發(fā)現(xiàn)納米金顆?？烧T導貽貝體內(nèi)抗氧化酶活性增加。Canesi等[20]報道納米二氧化鈦和nC60使紫貽貝消化腺中CAT等一系列抗氧化酶活性升高。Pan等[21]的研究結果也證實納米顆粒可以在貝類體內(nèi)誘導抗氧化酶活性增加，從而更加有效地清除過多的ROS。

根據(jù)Michaelis-Menten方程，在一定條件下，酶促反應速度與酶分子的濃度成正比。暴露96 h后，CAT活性與cat的相對表達量都隨著SWCNTs暴露濃度的升高而升高。由于cat的表達調(diào)控著機體內(nèi)CAT的含量，因此太平洋牡蠣體內(nèi)CAT作用的底物，即H2O2的濃度足夠大。這也間接證實了太平洋牡蠣在受到SWCNTs的暴露后，機體產(chǎn)生了氧化應激。

AOX是線粒體交替途徑末端的氧化酶[22]，可以使分子氧和還原醌發(fā)生相互作用，從而降低生物體內(nèi)ROS含量[23]，起到防御氧化損傷的作用。本研究結果表明，當SWCNTs的暴露濃度升高時，aox的相對表達量隨之升高，調(diào)控AOX含量升高以幫助其抵御氧化損傷。Maxwell等[24]的研究表明，當aox超量表達以應對氧化脅迫時，體內(nèi)ROS的含量隨之降低，反之則ROS升高。Zhou等[25]也發(fā)現(xiàn)AOX在抗氰呼吸途徑中起到了清除ROS的重要作用。

熱休克蛋白家族(HSPs)是生物體內(nèi)廣泛存在的應激蛋白[26]，能夠抑制產(chǎn)生ROS的關鍵酶(還原型輔酶Ⅱ, NADPH)以及增強抗氧化酶的代謝水平[27]，在受到環(huán)境脅迫時起到保護機體的重要作用。HSP70是熱休克蛋白家族中一種被廣泛認為是各種水體污染物的高效生物標志物[28]。太平洋牡蠣在高濃度SWCNTs的刺激下調(diào)控hsp70超量表達，表明此暴露條件下的SWCNTs對牡蠣造成了一定程度的氧化脅迫，誘導牡蠣細胞調(diào)節(jié)hsp70的表達來維穩(wěn)機體相關蛋白的合成。Hamdoun等[29]的研究表明，太平洋牡蠣發(fā)生氧化應激時hsp70的表達水平會顯著提高。Cicchetti等[30]也發(fā)現(xiàn)HSP70能夠保護人口腔細胞防御SWCNTs的侵害。

3.3 P-gp蛋白的清除功能

多外源性物質(zhì)抗性機制(Multixenobiotic Resistance Mechanism, MXR)是雙殼貝類體內(nèi)的一種重要的防御機制，是其對抗外源污染物時的“第一道防線”[31]。P-gp蛋白是貝類MXR系統(tǒng)中重要的跨膜轉運蛋白，它通過ATP供能將各種異物排出細胞[32]。通過對p-gp的測定，發(fā)現(xiàn)鰓和消化腺中p-gp的相對表達量都隨著SWCNTs暴露濃度的升高而升高。Huang等[33]在研究利馬原甲藻(Prorocentrumlima)對翡翠貽貝的MXR系統(tǒng)的調(diào)控機制時也發(fā)現(xiàn)，p-gp的表達量會顯著的升高以清除毒素；當加入Tariquidar抑制劑之后，P-gp蛋白受到抑制，牡蠣所受到的氧化損傷程度顯著升高。這表明太平洋牡蠣能夠通過P-gp蛋白將部分SWCNTs排出體外，從而降低牡蠣所受到的氧化損傷，這與Palace等[34]的研究結果相一致。

本文研究了SWCNTs對太平洋牡蠣的毒性效應及太平洋牡蠣的防御機制。實驗結果表明，在本研究的暴露條件下，SWCNTs對太平洋牡蠣所造成的毒性效應主要為氧化損傷，而牡蠣體內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)和多外源性物質(zhì)抗性機制系統(tǒng)在防御SWCNTs的過程中起到了至關重要的作用。鰓作為太平洋牡蠣先接觸SWCNTs的器官，最先受到SWCNTs暴露的脅迫，誘導產(chǎn)生氧化應激；消化腺逐漸吸收并累積SWCNTs，其所產(chǎn)生的氧化應激隨暴露時長和暴露濃度的升高而升高。太平洋牡蠣多外源性物質(zhì)抗性機制系統(tǒng)中的P-gp蛋白在SWCNTs的細胞外排過程中起重要作用，因此在太平洋牡蠣的防御系統(tǒng)中起到至關重要的作用。

致謝：感謝國家自然科學基金(51479016; 51308083)，遼寧省博士科研啟動基金(20170520368)對本研究的資助。