柯東平，毛俊倩，劉 琪，郭甲民，馬龍安△

1.陜西省腫瘤醫(yī)院普外科 (西安710061)；2.陜西省楊凌示范區(qū)醫(yī)院普外科(楊凌712100)

結(jié)直腸癌(Colorectal cancer, CRC)具有高發(fā)病率、高病死率等特點。國際癌癥研究中心(IARC)在2018年9月發(fā)布的全球癌癥統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，結(jié)直腸癌在所有癌癥中發(fā)病率排在第三位，癌癥相關病死率排名第二位。腫瘤細胞的增殖、生長、浸潤與許多基因的突變、異常表達密切相關，研究CRC中相關分子機制并找尋有效分子標記有利于CRC的及早診斷和治療。TRIM21是三元基序蛋白(Tripartite motif-containing protein, TRIM)家族成員，該家族一般含有RING結(jié)構(gòu)域，具有E3泛素連接酶活性。人類的TRIM21位于第11號染色體上11p15.4區(qū)域，共475個氨基酸，包含四個結(jié)構(gòu)域：RING結(jié)構(gòu)域、B-box結(jié)構(gòu)域、Coiled-coil結(jié)構(gòu)域和PRYSPRY結(jié)構(gòu)域。TRIM21最早在系統(tǒng)性紅斑狼瘡中被鑒定。后來的研究表明TRIM21與多種腫瘤的發(fā)生也密切相關[1-3]。研究發(fā)現(xiàn)，TRIM21在人腸癌中表達顯著降低，TRIM21缺失小鼠結(jié)腸癌的發(fā)生更明顯[5]。本研究將進一步探討TRIM21在結(jié)直腸癌中的作用機制，通過干擾結(jié)直腸癌細胞中的TRIM21表達，明確TRIM21對結(jié)直腸癌細胞增殖、凋亡及TGF-β1-Smad2/3信號通路活化的影響。

材料與方法

1 試劑與材料 RPMI-1640培養(yǎng)基(Gibco，31800-014)；胎牛血清(BI，04-001-1ACS)；MTT檢測試劑盒(萬類生物，WLA021a)；細胞凋亡檢測試劑盒(萬類生物，WLA001c)；Super M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶(BioTeke，PR6502)；2×Power Taq PCR MasterMix(BioTeke，PR1702)；SYBR Green(Solarbio，SY1020)；TRIM21抗體(Bioss，bs-0635R)；TGF-β1抗體(萬類生物，WL01076R)；p-Smad2/3抗體(萬類生物，WL02305)；Smad2/3抗體(萬類生物，WL01520)CyclinD1抗體(萬類生物，WL01435a)；羊抗兔IgG-HRP(萬類生物，WLA023)；β-actin抗體(萬類生物，WL01845)。

2 實驗方法

2.1 細胞培養(yǎng)：人結(jié)直腸癌細胞HCT116細胞株用含有10 %胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，在37 ℃、5 % CO2、飽和濕度條件下的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.2 TRIM21 siRNA轉(zhuǎn)染：HCT116細胞常規(guī)培養(yǎng)至細胞密度為70 %進行轉(zhuǎn)染。在室溫下混合無血清培養(yǎng)基稀釋的Lipofectamine 2000和siRNA干擾片段或陰性對照，靜置15 min。將上述溶液緩慢滴入培養(yǎng)的HCT116細胞中，不斷輕輕振蕩，置于37 ℃、5 % CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h后換液繼續(xù)培養(yǎng)。細胞共分三組：未轉(zhuǎn)染組、陰性對照(NC)組、TRIM21 siRNA轉(zhuǎn)染組。

2.3 MTT檢測細胞增殖：分別于轉(zhuǎn)染后24 h、48 h、72 h和96 h收集各組細胞，棄去培養(yǎng)基，每孔加入20 μl MTT染色液，置于37 ℃、5 % CO2培養(yǎng)箱中孵育4 h。4 h后小心吸去上清，加入150 μl DMSO，避光靜置10 min后用酶標儀測定570 nm處OD值。

2.4 Annexin V-FITC/PI法檢測細胞凋亡：轉(zhuǎn)染后48 h收集各組細胞，離心收集細胞沉淀，用PBS洗滌兩次，每管細胞用500 μl Binding Buffer重懸，依次加入5 μl Annexin V-FITC/PI和 10 μl PI混勻，室溫避光孵育15 min后上流式細胞儀檢測。

2.5 實時熒光定量PCR：分別于轉(zhuǎn)染后24 h、48 h收集細胞，加入TRIpure裂解液提取總RNA，Nano 2000測定RNA濃度。上述RNA樣本進行反轉(zhuǎn)錄得到對應的cDNA進行后續(xù)實驗。本實驗利用ERxicycler TM96熒光定量儀進行熒光定量分析，引物序列如下：TRIM21-F：5’- GCTCCAGGTGGCATTAGG-3’；TRIM21-R：5’-TGCACAAACTCTGCGTGA-3’；TGF-β1-F：5’-CCTGCCTCCGCTCCTAGT-3’；TGF-β1-R：5’-CATGGAAGATGGCAAATTAC-3’；Smad2-F：5’-CAGTGTTAGATACCCTCTTCGT-3’；Smad2-R：5’-TTGTTCATGTCCACAGACTAGATA-3’；Smad3-F：5’-AGAGGAGTGCTGGTGACTGGAT-3’；Smad3-R：5’-GGAAGGTGCTGAAGACAAGGAT-3’；Cyclin D1-F：5’-GAACACGGCTCACGCTTAC-3’；Cyclin D1-F：5’-CGATACACACAACATCCAGG-3’；β-actin-F：5’-CACTGTGCCCATCTACGAGG-3’；β-actin-R：5’-TAATGTCACGCACGATTTCC-3’。

2.6 Western blot：轉(zhuǎn)染后48 h收集細胞加入裂解液抽提總蛋白，BCA法對蛋白進行定量。取40 μg蛋白進行SDS-PAGE，電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)膜、封閉；加入相應一抗4 ℃孵育過夜，二抗37 ℃孵育45 min，之后進行ECL底物顯色反應，暗室曝光，膠片用Gel-Pro-Analyzer軟件分析光密度值。

結(jié) 果

1 TRIM21 siRNA轉(zhuǎn)染效果驗證 在轉(zhuǎn)染后24 h和48 h分別通過實時熒光定量PCR和Western blot檢測HCT116細胞中的TRIM21在mRNA和蛋白水平上的表達，結(jié)果顯示，與陰性對照組相比，TRIM21 siRNA轉(zhuǎn)染組中TRIM21在mRNA水平和蛋白水平上的表達均顯著下降，差異具有統(tǒng)計學意義(圖1)。

圖1轉(zhuǎn)染后細胞中的TRIM21表達(A：Real-time PCR檢測TRIM21在mRNA水平上的相對表達量；B、C：Western blot檢測TRIM21在蛋白水平上的相對表達量與陰性對照組比，**P<0.01)

2 TRIM21 siRNA轉(zhuǎn)染后的細胞增殖 分別于轉(zhuǎn)染24 h、48 h、72 h和96 h后采用MTT檢測HCT116細胞的增殖情況，結(jié)果顯示(圖2)，24 h、48 h、72 h和96 h時TRIM21 siRNA轉(zhuǎn)染組細胞活力均高于陰性對照組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。Real-time PCR檢測細胞中增殖相關蛋白Cyclin D1表達，結(jié)果顯示(圖3)，與陰性對照組比，TRIM21 siRNA轉(zhuǎn)染組Cyclin D1的相對表達量明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

3 TRIM21 siRNA轉(zhuǎn)染后的細胞凋亡 細胞轉(zhuǎn)染48 h后采用Annexin-V/PI法檢測細胞凋亡情況，結(jié)果顯示(圖4)，TRIM21 siRNA轉(zhuǎn)染組細胞凋亡比例為(6.27±0.05)%，顯著低于陰性對照組的(7.76±0.12)%，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見表1。

圖2MTT檢測轉(zhuǎn)染后的細胞增殖 (與陰性對照組比較，*P<0.05，**P<0.01)

圖3Cyclin D1的相對表達量 (A：Real-time PCR檢測Cyclin D1在mRNA水平上的相對表達量；B、C：Western blot檢測Cyclin D1在蛋白水平上的相對表達量;與陰性對照組比，**P<0.01)

表1 轉(zhuǎn)染后的細胞凋亡比例

注：與陰性對照組比，*P<0.01

4 TRIM21 siRNA轉(zhuǎn)染后細胞TGF-β1-Smad2/3通路活化情況 在轉(zhuǎn)染后48 h，采用實時熒光定量PCR和Western blot檢測TGF-β1、Smad2、Smad3的表達量，結(jié)果顯示(圖5)，與陰性對照組相比TRIM21 siRNA轉(zhuǎn)染組的TGF-β1在mRNA和蛋白水平的表達量均有所下降，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；各組間Smad2/3在mRNA和蛋白水平的表達沒有差異，但采用Western blot檢測Smad2/3的磷酸化，結(jié)果顯示TRIM21 siRNA轉(zhuǎn)染組的p-Smad2/3水平低于陰性對照組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

圖4 流式細胞術檢測轉(zhuǎn)染后的細胞凋亡(A：未轉(zhuǎn)染組；B：陰性對照組；C：TRIM21 siRNA轉(zhuǎn)染組)

圖5TRIM21 siRNA轉(zhuǎn)染后HCT116細胞TGF-β1-Smad2/3通路相關蛋白表達 (A：Real-time PCR檢測TGF-β1、Smad2和Smad3在mRNA水平上的相對表達量；B、C：Western blot檢測TGF-β1、Smad2/3、p-Smad2/3在蛋白水平上的相對表達量；與陰性對照組比，**P<0.01)

討 論

目前的研究已經(jīng)證實，TRIM21在多種癌癥中存在異常表達，在不同的癌癥中扮演不同的角色。在CRC中，有研究曾報道了TRIM21與結(jié)腸炎相關結(jié)腸癌的發(fā)生[4]、CRC細胞順鉑敏感性[3]相關。本研究在此基礎上探討了TRIM21與CRC細胞增殖、凋亡的相關性，結(jié)果顯示在HCT116細胞中干擾TRIM21的表達使HCT116細胞增殖能力增強，同時凋亡細胞比例下降，說明TRIM21在CRC中可能發(fā)揮類似抑癌基因的作用，沉默TRIM21的表達使腫瘤細胞增殖能力進一步增強。此外，轉(zhuǎn)染TRIM21 siRNA的細胞中增殖相關蛋白Cyclin D1的表達也顯著升高。

TGF-β是一類多功能的細胞因子，通過與受體結(jié)合發(fā)揮功能。通常TGF-β1首先與TGF-βRⅡ結(jié)合，然后再與TGF-βRⅠ結(jié)合，形成的具有活性的復合物可以磷酸化Smads蛋白，如Samd1、Smad2、Smad3、Smad5、Smad8等，它們與co-Smad(Smad4)結(jié)合形成復合體，該復合體轉(zhuǎn)位至細胞核可以調(diào)控下游靶基因的轉(zhuǎn)錄[5]。TGF-β1-Smads通路是腫瘤中較為經(jīng)典的信號通路，在不同類型、不同發(fā)展階段的腫瘤中功能不同，與腫瘤細胞的增殖、轉(zhuǎn)移能力密切相關。一方面，TGF-β1誘導周期依賴性激酶(Cycle dependent kinase, CDK)抑制劑p15的合成，阻止CDK和Cyclin的作用，抑制細胞增殖[6]；另一方面，在腫瘤的發(fā)展晚期，TGF-β1信號通路誘導上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，促進腫瘤的侵襲和遷移[7]。在CRC發(fā)展期間，TGF-β1的功能也存在類似的變化[8]。

有文獻曾報道，TRIM21正調(diào)控TGF-β信號通路[9]。本研究主要探討TRIM21通過TGF-β1通路影響CRC增殖的機制。研究表明，在CRC早期，BAG-1通過抑制TGF-β1促進腫瘤細胞存活[10]；阿司匹林通過誘導TGF-β1抑制CRC細胞增殖[11]。本研究中，在HCT116細胞中轉(zhuǎn)染TRIM21 siRNA后，細胞中的TGF-β1表達量顯著下降，同時Smad2/3的磷酸化水平降低，說明干擾TRIM21的表達可以抑制TGF-β1—Smad2/3通路的活化，同時Western blot結(jié)果顯示細胞增殖相關蛋白Cyclin D1的表達水平也明顯下降，Cyclin D1是由p-Smad2/3調(diào)控的下游基因之一，提示TRIM21可能通過調(diào)控TGF-β1—Smad2/3通路的活化水平進而影響增殖相關蛋白的表達，從而影響CRC細胞增殖和凋亡，參與CRC發(fā)展進程。