蘭 凱,王讓周,錢燕芳, 陳 楊，木 森△

1.陸軍第75集團軍醫(yī)院麻醉科(大理 671000)；2.陸軍軍醫(yī)大學第一附屬醫(yī)院麻醉科(重慶 400038)

肝肺綜合征(Hepatopulmonary syndrome, HPS)病死率高、防治困難。近年報道發(fā)現(xiàn)病理性肺血管新生在HPS的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用[1]。同時動物實驗也證實血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、基質(zhì)細胞衍生因子-1(SDF-1)以及血小板衍生生長因子-BB(PDGF-BB)等血管新生相關(guān)因子在HPS大鼠外周血和肺組織中表達增高[2]。這些因子一方面可通過直接作用于微血管內(nèi)皮細胞促進其增殖，另一方面可以通過募集干細胞及單核細胞的間接促進HPS大鼠肺病理性血管新生[3-4]。激活蛋白AP-2是一種序列特異性的轉(zhuǎn)錄因子，由AP-2α、AP-2β、AP-2γ、AP-2δ 和 AP-2ε等幾個關(guān)系密切、結(jié)構(gòu)保守的成員組成。在乳腺癌相關(guān)的研究中發(fā)現(xiàn)AP-2α對在維持乳腺癌管腔樣表型中起重要作用[5]；且AP-2α還可以通過HIF-1α信號通路促進鼻咽癌細胞的生長[6]。另外有研究發(fā)現(xiàn)，人肺的非癌肺正常組織、腺癌組織和鱗癌組織有AP-2α的表達，顯示AP-2α在人存在于人肺組織中存在[7]。由此可見，AP-2在調(diào)控多種基因的表達中發(fā)揮廣泛的生理和病理生理作用。本研究擬通過建立應用HPS動物模型，應用動物模型的血清刺激體外培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細胞(BM-MSCs)并通過siRNA抑制AP-2α表達，檢測各組細胞AP-2α表達及旁分泌SDF-1、VEGF、PDGF-BB水平。

材料與方法

1 實驗動物 SPF級健康雄性SD大鼠，體重200～220 g，購自第三軍醫(yī)大學野戰(zhàn)外科研究所，飼養(yǎng)于有燈光控制、分12 h白晝變換的房間，自由飲水和進食標準食物。實驗前至少1周在該房間適應環(huán)境。

2 實驗分組及HPS大鼠模型的建立 將實驗動物分為兩組，每組12只：Sham手術(shù)組(S組)、膽總管結(jié)扎(CBDL)手術(shù)組(C組)，每組均于12 h、24 h和48 h三個時間點以血清刺激，即分為三個亞組，每亞組樣本數(shù)為4例。在實驗之前，大鼠禁食12 h，僅給自由飲水。麻醉方法：腹腔注射5% 水合氯醛麻醉(0.08ml/kg)。CBDL大鼠手術(shù)方法：沿上腹正中線切開皮膚，剪開皮下組織、腹膜進腹；沿肝十二指腸韌帶尋找膽總管，于胰腺上方近十二指腸處游離膽總管，雙重結(jié)扎，并于兩結(jié)扎線之間切斷；連續(xù)縫合腹膜、皮下組織、皮膚、關(guān)腹；待復溫至動物蘇醒后，移入動物房，術(shù)后動物自由飲食。Sham組手術(shù)方法：僅行一個簡單的剖腹手術(shù)，分離膽總管但并不結(jié)扎，術(shù)后4周分離各組大鼠外周血，離心獲取血清保存于-80℃待用。

3 Western blot檢測AP-2α的表達 大鼠稱重麻醉后，將雙下肢皮膚剝離后離斷并放入含有青霉素-鏈霉素溶液的PBS中漂洗。在無菌條件下去除肌肉及附著軟組織，剪開長骨兩端，用注射器將骨髓沖入無菌小燒杯中并加入10 ml完全培養(yǎng)基吹打混勻，使用200目的細胞濾網(wǎng)過濾懸液以去除大塊組織。向每個T25細胞培養(yǎng)瓶中加入4～5 ml細胞懸液并置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。隨后將獲取的細胞破碎后用裂解液裂解，使用BCA法測定組織樣品蛋白濃度，按每孔20 μg上樣并進行SDS-PAGE分析，轉(zhuǎn)膜后，5%脫脂奶粉封閉，一抗孵育過夜，TBST洗3次后，二抗孵育2 h，TBST洗3次、后ECL顯色后置于Bio-rad成像儀中分析條帶吸光度值。

4 SDF-1、VEGF和PDGF-BB的檢測 獲取各組細胞培養(yǎng)液，采用ELISA法按照試劑盒說明書檢測各組細胞在不同時間點各組細胞旁分泌SDF-1、VEGF和PDGF-BB的水平。

5 BM-MSCs轉(zhuǎn)染AP-2α siRNA 通過Ribobio生物公司購買AP-2α特異性siRNA(5'-GATCGAACTGACCGCCCGCGGCCCGT-3')和對照siRNA(5'-GCAAATATCACCCAGGCCCAT-3')。 根據(jù)試劑說明，使用轉(zhuǎn)染試劑分別將AP-2α siRNA(50nmol/L)和對照RNA(50nmol/L)轉(zhuǎn)染到BM-MSCs中。 然后，將BM-MSCs與正常大鼠血清或HPS大鼠血清一起溫育48 h，通過Western blot檢測轉(zhuǎn)染效率。

結(jié) 果

1 S組和C組細胞各時間點AP-2α表達及旁分泌SDF-1、VEGF、PDGF-BB水平 與S組相比，C組血清刺激體外培養(yǎng)的BM-MSCs后，AP-2α的表達以及SDF-1、VEGF的分泌在各個時間點均明顯升高且呈遞增趨勢(P<0.05)，而PDGF-BB的分泌僅在C組血清刺激后48h明顯升高(P<0.05)。見表1(圖1)。

表1 CBDL大鼠血清刺激后各時間點BM-MSCs旁分泌 細胞因子水平

注：與0 h組比較，*P<0.05

2 Western blot檢測AP-2αsiRNA轉(zhuǎn)染效率 Western blot結(jié)果顯示，與對照siRNA相比AP-2α siRNA轉(zhuǎn)染能明顯降低S組和C組細胞中AP-2α的表達水平(P<0.05，圖2)。

圖1 CBDL大鼠血清刺激后BM-MSCs各時間點AP-2α表達

與S組+對照siRNA比較，*P<0.05；與C組+對照siRNA比較，#P<0.05

圖2siRNA轉(zhuǎn)染后各組BM-MSCs的AP-2α表達

3 siRNA抑制AP-2α表達后檢測各組細胞旁分泌SDF-1、VEGF和PDGF-BB的水平 ELISA試驗結(jié)果顯示，siRNA降低AP-2α的表達后能明顯抑制C組血清刺激48 h引起的SDF-1、VEGF、PDGF-BB分泌增加(P<0.05)，見表2。

討 論

肝肺綜合征是慢性肝病的嚴重肺部并發(fā)癥，最近的研究表明，病理性肺血管新生在 HPS 的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用[1]，然而其發(fā)生機制還沒有完全闡明。AP-2α作為一種序列特異性的轉(zhuǎn)錄因子，既往的研究發(fā)現(xiàn)其可以促進病理性血管新生，從而參與多種癌癥細胞的生長過程中[5-6]。本研究通過觀察肝肺綜合征動物模型CBDL大鼠血清對骨髓間充質(zhì)干細胞(BM-MSCs)旁分泌功能的影響，并探索轉(zhuǎn)錄因子AP-2α在其中的相關(guān)機制后發(fā)現(xiàn)：與對照組相比，C組(CBDL大鼠)血清刺激體外培養(yǎng)的BM-MSCs后，AP-2α的表達以及SDF-1、VEGF的分泌在各個時間點均明顯升高且呈遞增趨勢，而PDGF-BB的分泌僅在C組血清刺激后48 h明顯升高。而AP-2α siRNA轉(zhuǎn)染可明顯能明顯抑制C組血清刺激引起的SDF-1、VEGF、PDGF-BB分泌增加。以上結(jié)果表明HPS血清刺激體外培養(yǎng)的BM-MSCs可能通過激活轉(zhuǎn)錄因子AP-2α從而增強其旁分泌功能，且該結(jié)果也表明AP-2α可能在HPS肺血管新生中起到重要作用。

表2 siRNA轉(zhuǎn)染后各組BM-MSCs旁分泌相關(guān)細胞因子水平

注：與S組+對照siRNA比較，*P<0.05；與C組+對照siRNA比較，#P<0.05

既往研究發(fā)現(xiàn),干細胞對促進血管新生過程具有重要作用[8-9]，然而在不同疾病狀態(tài)下主要動員的干細胞類型和調(diào)控機制有所不同。在急性肺損傷模型中，參與修復性血管新生的細胞主要來源于肺組織自身來源的EPCs和MSCs[10-11]。在慢性疾病的病理性血管新生過程中，由于病理性因子的持續(xù)刺激，來源最豐富的BM-MSCs動員并歸巢到作用部位發(fā)揮主要效應作用。MSCs 的旁分泌功能增強是一個眾多細胞因子和信號通路參與的過程，組織損傷后釋放大量促血管生成因子，如血管內(nèi)皮生長因子A (Vascular endothelial growthfactor-A, VEGF-A)、基質(zhì)細胞衍生因子-1(Stromal cell derived factor-1，SDF-1)、血小板衍生生長因子-BB(Platelet-derived growth factor，PDGF-BB)、成纖維細胞生因子(Fibroblast growth factor, FGF)等。SDF-1是小分子的細胞因子，屬于趨化因子蛋白家族，其特異受體是CXCR4。CXCR4是CXC趨化因子亞家族的受體，為高度保守的具有7次跨膜結(jié)構(gòu)組成的G蛋白耦聯(lián)受體，在體內(nèi)大部分組織和器官上都有表達。研究表明，SDF-1 通過與CXCR4 N端區(qū)域和細胞外環(huán)-2(Extracellular loop，ECL)結(jié)合啟動下游PI3K/Akt、MAPK/ERK、JAK/STAT等信號通路來調(diào)控細胞的運動、趨化、黏附和分泌功能表達[12]。研究發(fā)現(xiàn)在血小板減少的小鼠中，血漿中SDF-1升高及CXCR4+、VEGFR1+細胞的動員和組織修復嚴重受損，在給予血小板后或加強SDF-1表達后，則能夠重新進行血管新生，說明SDF-1在血管新生中和組織修復中起到重要作用[13]。另外發(fā)現(xiàn)SDF-1/CXCR4趨化信號軸在介導BM-MSCs細胞參與HPS肺血管新生中起到重要的作用，該研究也顯示SDF-1可通過激活下游信號促進細胞旁分泌VEGF功能增強[3]。同時，F(xiàn)allon等人的研究團隊發(fā)現(xiàn)CX3CL1可趨化單核細胞在肺內(nèi)聚集，最后通過促進VEGF的表達從而促進引起HPS動物模型后期肺微血管的炎性增生。我們既往的研究表明，HPS狀態(tài)下CBDL大鼠的骨髓間充質(zhì)干細胞的動員增多，并可通過旁分泌SDF-1、VEGF以及PDGF-BB等細胞因子促進HPS肺血管新生[14]。以上研究提示,SDF-1、VEGF以及PDGF-BB均在病理性血管新生中起到重要作用，通過抑制這些血管新生因子以控制血管新生對HPS起到治療作用。針對這些血管新生因子進行調(diào)控可控制HPS血管新生進程從而對HPS起到治療作用。

在本次研究中，我們進一步發(fā)現(xiàn)了HPS狀態(tài)下轉(zhuǎn)錄因子AP-2α明顯上調(diào)并促進了BM-MSCs旁分泌相關(guān)細胞因子的功能。表明針對AP-2α這一治療靶點進一步探索HPS新的治療方式具有重要意義。然而在本研究中，AP-2α的敲低并未完全消除CBDL血清對本研究中BM-MSCs旁分泌功能的影響，這可能是由于HPS狀態(tài)下BM-MSCs旁分泌功能的變化受到多種機制的調(diào)控，例如文獻報道HPS狀態(tài)下可機體通過激活氧化應激因子Nrf 2增強BM-MSCs促血管新生相關(guān)功能[12]。因此提示，僅僅抑制HPS的致病靶點之一是不夠的，應進一步研究HPS聯(lián)合治療方式以達到治療目的具有重要意義。然而，我們的研究也存在一些局限性：首先，我們沒有進行體內(nèi)試驗來闡明AP-2α是如何調(diào)控BM-MSCs從而參與HPS的肺血管生成；其次，我們的本研究結(jié)論還需要進一步的臨床試驗驗證證據(jù)支持。盡管需要進一步完善相關(guān)機制的探索，但綜上所述，我們的本研究發(fā)現(xiàn)AP-2α在HPS的潛在作用并為其進一步針對HPS肺血管新生的相關(guān)的HPS治療提供了依據(jù)基礎(chǔ)。