沈小鐘 崔穗旭 鄭曉娜 李淑嫻 吳良發(fā)

九華痔瘡栓由大黃、浙貝母、側柏葉（炒）、厚樸、白及、冰片、紫草7味中藥材組成，具有消腫化瘀、生肌止血、清熱止痛之功效。本品為中藥保護品種，收載于《衛(wèi)生部藥品標準》中藥成方制劑第十八冊，標準號為WS3-B-3359-98，規(guī)格為每粒重2.1 g。江西瑞金三九藥業(yè)有限公司為本品研發(fā)和獨家生產(chǎn)單位，2007年增加了每粒重1.7 g規(guī)格，由國家藥品監(jiān)督管理局批準（標準號為YBZ00182007）。大黃是君藥，其主要的活性成分是蒽醌類成分[1-2]，其中大黃素、大黃酚在植物中含量較高[3-4]，蒽醌類化合物具有較強的瀉下、消炎、抗菌作用[5-6]。但九華痔瘡栓現(xiàn)行標準未對大黃素和大黃酚進行定量控制，為了進一步完善九華痔瘡栓的質量標準，本文研究建立了大黃素和大黃酚HPLC含量測定方法。結果表明該法簡便、準確、重現(xiàn)性好，可作為本品質量控制和考察工藝穩(wěn)定性的指標。

1 儀器與試藥

Agilent 1100高效液相色譜儀，可變波長紫外檢測器；大黃素對照品（批號：110756-200110，含量測定用）、大黃酚對照品（批號：110796-201118，含量測定用）均購自中國食品藥品檢定研究院；色譜純甲醇，超純水，其它試劑均為分析純級。

2 方法與結果

2.1 對照品溶液制備

取大黃素、大黃酚對照品適量，精密稱定，加甲醇制成含大黃素3 μg/mL、大黃酚6 μg/mL的混合溶液，即得。

2.2 供試品溶液制備

取重量差異項下的本品，研勻，精密稱定2 g，精密加入甲醇25 mL，稱定重量，加熱回流1小時，取出，放至室溫，再稱定重量，用甲醇補足減少的重量，搖勻，濾過，精密吸取續(xù)濾液10 mL，置平底燒瓶中，蒸干，殘渣加20 mL的8%鹽酸溶液超聲溶解，再加三氯甲烷20 mL，加熱回流1小時，取出，放至室溫，提取液移入分液漏斗中，用適量三氯甲烷洗滌平底燒瓶，并入分液漏斗中，待分層后取三氯甲烷液，鹽酸溶液再用三氯甲烷振搖提取3次，每次20 mL，合并三氯甲烷液，蒸干，殘渣加甲醇溶解并轉移至10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 陰性樣品溶液制備

取缺大黃的其他六味藥材按制法制成大黃陰性對照樣品，按照“2.2”項下方法制備溶液，即得。

2.4 色譜條件

色譜柱采用Wondasil C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），柱溫30℃；流動相為甲醇-0.1%磷酸溶液（70∶30），流速1.0 mL/min；檢測波長254 nm；進樣量20 μL。在上述色譜條件下，對照品、樣品及陰性樣品色譜圖見圖1。

2.5 線性范圍

精密吸取大黃素（0.103 6 mg/mL）和大黃酚（0.272 5 mg/mL）混合溶液0.1，0.5，1，2，3 mL，分別置25 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，分別進樣20μL測定，橫坐標為對照品進樣量X（μg），縱坐標為峰面積Y，進行線性回歸分析，大黃素回歸方程為Y=3 762.260 50X-0.557 32，r=0.999 99；大黃酚回歸方程為Y=4 244.299 95X-0.419 75，r=0.999 98。結果表明大黃素在0.008 288～0.248 64 μg之間呈良好的線性關系；大黃酚在0.0218～0.654 μg之間呈良好的線性關系。

2.6 精密度試驗

按“2.4”項下色譜條件連續(xù)進樣“2.1”項下對照品溶液6次，每次進樣量20 μL，測定峰面積，結果大黃素RSD=0.4%，大黃酚RSD=0.3%，表明儀器具有良好的精密度。

2.7 穩(wěn)定性試驗

分別在0，6，12，18，24 h各進樣同一供試品溶液2次，每次20 μL，計算峰面積平均值，結果大黃素RSD=0.4%，大黃酚RSD=0.7%，表明供試品溶液在24 h內基本穩(wěn)定。

2.8 重復性試驗

按“2.2”項下方法制備6份供試品溶液，分別精密吸取20 μL，注入液相色譜儀，按“2.4”項下色譜條件測定，結果大黃素含量平均值為35.95 μg/g，RSD為2.0%；大黃酚含量平均值為65.20μg·g-1，RSD為2.1%。

2.9 加樣回收率試驗

取已知含量的樣品，研勻，取6份，每份1 g，精密稱定，分別精密加入大黃素（1.244 μg/mL）和大黃酚（2.18 μg/mL）混合對照品甲醇溶液25 mL，按“2.2”項下方法制備加標溶液，按“2.4”項下色譜條件分別進樣20 μL測定，結果大黃素平均回收率（n=6）為99.6%，RSD=2.2%；大黃酚平均回收率（n=6）為95.4%，RSD=2.3%。

2.10 樣品測定

按“2.2”項下制備方法和“2.4”項下測定條件，對9批樣品中大黃素和大黃酚的含量進行測定，采用外標法計算。結果上述9批樣品中每粒含大黃素和大黃酚的總量分別為0.17，0.15，0.23，0.21，0.19，0.18，0.21，0.13，0.20 mg。

3 討論

3.1 指標成分考察

曾對本品中大黃素、大黃酸、大黃酚、大黃素甲醚、蘆薈大黃素5種成分的含量進行測定，發(fā)現(xiàn)供試品色譜中蘆薈大黃素和大黃素甲醚峰面積很小，積分波動大，定量不準確，而大黃酸峰面積很大，通過陰性試驗發(fā)現(xiàn)大黃酸陰性有干擾，在同一色譜條件下，大黃酸與和厚樸酚色譜峰保留時間基本一致，兩者重疊在一起，很難分離，大黃酸峰中包含和厚樸酚峰造成大黃酸含量高于實際含量，因此蘆薈大黃素、大黃素甲醚和大黃酸三個成分均不宜作為本品的定量指標，最終確定選擇大黃素、大黃酚作為指標成分。

3.2 提取方法考察

曾比較不同溶劑種類、提取方式、提取時間和酸水解時間以及三氯甲烷振搖提取次數(shù)對大黃素和大黃酚的含量影響，結果采用甲醇25 mL加熱回流1 h，再加酸水解1 h后加三氯甲烷振搖提取3次，能基本提取完全，大黃素和大黃酚的含量可達最高，并且雜質干擾較少，故采用“2.2”項下制備方法。

3.3 檢測波長考察

在400～200 nm波長范圍內對大黃素、大黃酚對照品甲醇溶液進行光譜掃描，結果大黃素在252.5 nm、大黃酚在255.5 nm波長處有最大吸收，并參考中國藥典2015年版一部大黃[7]的檢測波長，選擇254 nm作為檢測波長。

3.4 流動相考察

圖1 大黃素對照品（A）、大黃酚對照品（B）、樣品（C）、陰性樣品（D）色譜圖

據(jù)文獻報道[8-13]，測定大黃中蒽醌類成分多采用甲醇與0.1%磷酸溶液作為流動相，只是兩者比例有所不同，本文摸索了流動相比例，發(fā)現(xiàn)兩者比例為75∶25時，大黃素和大黃酚峰保留時間適中，峰形和分離均較好，故確定流動相為甲醇-0.1%磷酸溶液（75∶25）。

3.5 檢測限與耐用性考察

通過逐級降低質量濃度，進樣測定，確定大黃素最低檢測限（S/N=3）為1.7 ng，定量限（S/N=10）為3.3 ng；大黃酚最低檢測限（S/N=3）為1.7 ng，定量限（S/N=10）為4.4 ng。曾采用三種不同的色譜柱進行測定，結果大黃素、大黃酚峰在各種色譜柱均分離良好，測得含量無顯著差異，方法具有較好的耐用性。

3.6 含量限度確定

通過分析9批九華痔瘡栓中大黃素和大黃酚總量的測定結果，本品每粒含大黃素和大黃酚總量在0.134 0～0.227 9 mg之間，平均含量為0.187 4 mg/粒?？紤]到藥材的來源、制劑生產(chǎn)損耗以及貯藏等因素，選擇含量的最小值作為限度基點，以80%的系數(shù)作為含量限度，暫定本品含大黃素和大黃酚的總量不得少于0.10 mg/粒。

4 結論

本研究建立了九華痔瘡栓中大黃素和大黃酚HPLC含量測定方法，簡便、準確、重現(xiàn)性好，實用性強，可用于實際生產(chǎn)的質量控制和工藝穩(wěn)定性的考察指標。