方 芳 肖衛(wèi)華 田志剛

(中科院天然免疫和慢性疾病重點實驗室，細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)協(xié)同創(chuàng)新中心，生命科學(xué)院及醫(yī)學(xué)中心，中國科學(xué)技術(shù)大學(xué),合肥230027)

方 芳，中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)副研究員。哈爾濱工業(yè)大學(xué)(威海)本科(2003～2007)；中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)博士(2007～2012)、博士后(2012～2014)；中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)副研究員 (2014～現(xiàn)在)。主要研究方向為腫瘤免疫，包括腫瘤免疫逃逸和NK細胞免疫治療。主持國家自然科學(xué)基金面上項目、青年基金及安徽省自然科學(xué)基金；參與新藥創(chuàng)制、傳染病重大專項，國家自然科學(xué)基金創(chuàng)新群體、973、安徽省重大研究專項等科研項目。相關(guān)研究成果發(fā)表在Sci Rep、J Immunol等期刊。

肖衛(wèi)華，中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)教授、博士生導(dǎo)師。中科大醫(yī)藥生物技術(shù)系常務(wù)副主任，生物醫(yī)藥工程技術(shù)研究中心主任，安徽省生物工程學(xué)會理事長。長春生物制品研究所助理研究員(1987～1995),美國馬里蘭大學(xué)腫瘤研究中心博士后(1995～1997),美國國立衛(wèi)生研究院腫瘤研究所研究員(1997～2004),中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)生命科學(xué)院(2004～現(xiàn)在)。主要研究方向為腫瘤與免疫細胞生物學(xué)、醫(yī)藥生物技術(shù)研究和開發(fā)。承擔了包括國家新藥創(chuàng)制專項、國家自然科學(xué)基金、973、863等十余項科研基金項目。完成抗體藥物、透皮蛋白質(zhì)藥物、重組細胞因子和腫瘤免疫治療技術(shù)等生物技術(shù)藥物的開發(fā)或臨床前研究。開發(fā)的人外周血NK細胞體外擴增試劑盒獲第四屆全國創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)大賽醫(yī)藥團隊組三等獎，并已成功轉(zhuǎn)讓企業(yè)。在Nat Med、PNAS、Cancer Res等雜志發(fā)表50余篇SCI論文；申請國家發(fā)明專利13項，獲授權(quán)9項。

田志剛，中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)教授、中國工程院院士，博士生導(dǎo)師。中國科學(xué)院“百人計劃”獲得者、國家杰出青年科學(xué)基金獲得者、國家教育部和國家基金委“天然免疫”創(chuàng)新研究群體學(xué)術(shù)帶頭人?，F(xiàn)任中國免疫學(xué)會理事長、國際免疫學(xué)聯(lián)盟執(zhí)委、中國科技大學(xué)醫(yī)學(xué)中心主任、免疫學(xué)研究所所長、中國科學(xué)院天然免疫與慢性疾病重點實驗室主任。曾任中國科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院院長。中國免疫學(xué)會英文會刊《Cell Mol Immunol》執(zhí)行主編，《中國免疫學(xué)雜志》主編，《中國腫瘤生物治療雜志》副主編，《Cytokine》副主編，《Hepatology》編委，《Journal of Autoimmunity》編委。主要集中于NK細胞生物學(xué)研究、肝臟免疫學(xué)研究以及 NK細胞為基礎(chǔ)的新型生物治療技術(shù)及產(chǎn)品研制等方面的研究。并以通訊作者在Cell、Nat Immunol、Immunity、J Exp Med、J Clin Invest、Nat Commune、PNAS、Gastroenterology、Hepatology等發(fā)表SCI論文300余篇。獲國家發(fā)明專利授權(quán)20余項。2008年獲國家自然科學(xué)二等獎,2011年獲國家科技進步二等獎。2015年獲何梁何利科技進步獎。2004年創(chuàng)辦中國免疫學(xué)會英文會刊《Cell Mol Immunol》，列中國大陸醫(yī)學(xué)類SCI刊物前列。

自然殺傷細胞(Natural killer cell,NK cell)是具有直接殺傷功能的天然免疫效應(yīng)細胞。細胞表面固有表達多種活化性和抑制性受體，起到監(jiān)視惡性病變細胞的作用。依賴細胞固有表達受體的識別方式，使得NK細胞無需致敏，即可泛特異性識別惡性病變細胞，起到快速殺傷病變細胞的功能[1]。獲得性免疫系統(tǒng)中的T細胞同樣具有直接殺傷功能，但需通過樹突狀細胞提呈的抗原，獲得識別病變細胞特異性抗原的能力。雖然T細胞在體內(nèi)生存周期長，可產(chǎn)生長時間的免疫應(yīng)答，但也是存在長期不可預(yù)期風(fēng)險。與T細胞相比，NK細胞在腫瘤免疫治療上具有獨特的優(yōu)勢：NK細胞亞群少，體內(nèi)存活時間短，不可預(yù)期風(fēng)險低；此外，由于免疫排斥機制，T細胞治療目前多采用自體細胞，而已報道基于異體NK細胞的腫瘤免疫治療均未見嚴重非可控移植物排斥宿主反應(yīng)，表明異體NK細胞治療的可行性，擴寬了免疫細胞治療的來源，為腫瘤聯(lián)合治療提供可行性；NK細胞與T細胞治療在細胞來源、病變細胞識別與殺傷機制上互補不足，是繼T細胞后具有臨床應(yīng)用前景的另一類抗腫瘤免疫細胞。

1 基于NK細胞的抗腫瘤免疫治療策略及技術(shù)進展

NK細胞殺傷活性以及瘤內(nèi)浸潤數(shù)量與患癌風(fēng)險和癌癥治療預(yù)后顯著相關(guān)[2]，因此增加NK細胞數(shù)量、提高NK細胞活力成為靶向NK細胞免疫治療的主要策略，基于NK細胞的免疫治療策略主要包括以下幾類：①NK細胞過繼轉(zhuǎn)輸：將外周血來源、干細胞來源以及iPS誘導(dǎo)來源NK細胞轉(zhuǎn)輸?shù)交颊唧w內(nèi)，增加患者體內(nèi)NK細胞數(shù)量和活性；②免疫檢驗點抑制劑：阻斷NK細胞免疫檢驗點，逆轉(zhuǎn)細胞免疫抑制狀態(tài)；③基因修飾NK細胞：將CAR裝載于NK細胞上，增強NK細胞的腫瘤靶向性；④多功能連接器：雙特異性或三特異性抗體增強NK細胞靶向性、增強NK細胞活性(圖1)。

過繼轉(zhuǎn)輸NK細胞的來源廣泛，包括外周血、干細胞以及NK細胞系，但不同來源NK細胞因表型及殺傷活性差異較大，臨床研究應(yīng)用方案及效果有待深入研究[3]。其中，外周血來源NK細胞因來源廣泛、生產(chǎn)成本低、安全性和殺傷活性高，在NK細胞過繼轉(zhuǎn)輸中應(yīng)用較多[4]。干細胞誘導(dǎo)來源NK細胞需經(jīng)3～4周誘導(dǎo)分化和擴增培養(yǎng)，耗時長、成本高，每批生產(chǎn)的細胞最多可滿足2～3個患者回輸，仍不能達到即用的目的[5-7]。近期Zeng等[8]成功建立iPSC誘導(dǎo)NK細胞體系，雖可建立種子庫方式達到批量生產(chǎn)，建立即用型NK細胞體系，但其臨床安全性仍有待驗證。另外，NK細胞體外擴增體系仍是NK細胞臨床應(yīng)用的主要技術(shù)瓶頸。目前主要有飼養(yǎng)細胞和無飼養(yǎng)細胞兩種體系：基于飼養(yǎng)細胞的擴增體系所得NK細胞純度高、數(shù)量多，但由于飼養(yǎng)細胞多為如K562等基因修飾的腫瘤細胞，臨床應(yīng)用仍有潛在風(fēng)險顧慮；無飼養(yǎng)細胞擴增體系可獲得滿足臨床需要的細胞數(shù)量和純度的NK細胞，但個體差異范圍較大，工藝穩(wěn)定性仍有待提高。

圖1 NK細胞腫瘤免疫治療策略Fig.1 Strategies of NK cell-based tumor immunotherapy

CAR-NK通過增強細胞靶向起到提高腫瘤抑制的效率，近期報道的iPS來源CAR-NK動物試驗顯示，CAR-NK與CAR-T細胞相比較，具有同樣的抗卵巢癌活性，但毒副作用較低[9]，提示CAR-NK細胞比CAR-T細胞更安全。由于NK細胞胞內(nèi)信號與T細胞有顯著差異，NK細胞特異CAR結(jié)構(gòu)中胞內(nèi)信號段仍需優(yōu)化。目前除直接引用T細胞CAR結(jié)構(gòu)中包括4-1BB/CD3ζ、CD28/CD3ζ、2B4/CD3ζ等在內(nèi)的胞內(nèi)信號設(shè)計外，針對NK特異的4-1BB或2-B4與CD3ζ連用的胞內(nèi)信號結(jié)構(gòu)域[10]以及DAP10、DAP12[11]等展示出更強的活性。雖然多數(shù)CAR-NK研究仍處于臨床前階段，但CAR-NK細胞顯示出的抗腫瘤活性及安全性使它的臨床應(yīng)用受到期待。另外，原代NK細胞轉(zhuǎn)基因效率僅約15%，NK細胞轉(zhuǎn)基因效率是CAR-NK應(yīng)用的主要技術(shù)瓶頸。無病毒的轉(zhuǎn)座子基因轉(zhuǎn)染系統(tǒng)和基于慢病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒的轉(zhuǎn)染體系是CAR基因轉(zhuǎn)染的兩大系統(tǒng)。無病毒轉(zhuǎn)染系統(tǒng)臨床應(yīng)用潛在風(fēng)險低，是開發(fā)的首選，然而轉(zhuǎn)染效率仍有待提高，規(guī)?；可a(chǎn)也有挑戰(zhàn)?；诓《镜霓D(zhuǎn)染體系，雖具有潛在風(fēng)險，但轉(zhuǎn)染效率較高。近期，Elena和Rezvani研究團隊分別報道，使用K562飼養(yǎng)細胞加IL-2預(yù)處理原代外周血來源以及臍帶血來源NK，可顯著提高病毒系統(tǒng)轉(zhuǎn)基因效率至約50%[12,13]，表明提前激活原代NK細胞，可有效提高NK細胞轉(zhuǎn)基因效率，為CAR-NK的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

目前開發(fā)中主要針對NK細胞的免疫檢驗點包括KIR、NKG2A、Tim-3、LAG3和TIGIT等[14-16]。動物模型研究顯示，單獨使用抗NKG2A抗體未能顯著逆轉(zhuǎn)NK細胞耗竭，當聯(lián)合其他抗藥物使用時，如抗PD-1抗體，可顯著提高抗腫瘤效果。近期報道的Ⅱ期臨床研究數(shù)據(jù)顯示，NKG2A抑制劑聯(lián)合西妥昔單抗治療頭頸部鱗癌，約31%患者部分緩解，54%患者病情無進展[17]。KIR分子抑制劑IPH2101也已進入Ⅱ期臨床研究，然而研究結(jié)果顯示，大劑量(1 mg/kg)使用抑制劑后，導(dǎo)致NK細胞表面KIR2D分子和細胞功能顯著降低[18]。其原因可能與患者體內(nèi)單核細胞的功能有關(guān)，因此改變單獨抑制劑治療方案或聯(lián)合治療可能達到提高抗腫瘤效果的目的[19]。NK細胞免疫檢驗點TIGIT在包括黑色素瘤、乳腺癌、結(jié)腸癌等多種腫瘤浸潤的NK細胞上高表達，www.clinicaltrials.gov網(wǎng)站顯示有一項Ⅱ期和兩項Ⅰ期TIGIT抑制劑的臨床研究正在進行，但結(jié)果仍未見報道。近期研究顯示，針對TIGIT的抗體在動物模型中顯示出顯著和持續(xù)性的腫瘤抑制效果[20]；TIGIT和PD-1聯(lián)合與單藥相比，可顯著提高抗腫瘤能力；同時發(fā)現(xiàn)，NK細胞缺失導(dǎo)致PD-1抑制劑的抗腫瘤活性顯著降低[20,21]，提示NK細胞是T細胞抗腫瘤作用的重要基礎(chǔ)?？傊?，NK細胞免疫檢驗點為靶點的抑制劑可為腫瘤免疫治療提供另一把利劍，與T細胞免疫檢驗點抑制劑聯(lián)合可望形成雙劍合璧，使腫瘤免疫治療登上新的高峰。

此外，包括細胞因子[22,23]、免疫調(diào)節(jié)劑、雙特異性或三特異性抗體在內(nèi)的多種藥物也被證實能增強NK細胞功能[24,25]。Daniel 和Jeffrey團隊最新報道顯示，靶向CD16和CD33或CD16和CD133并同時表達IL-15的三特異性殺傷連接器(161533 TriKE、1615133 TriKE)可誘導(dǎo)NK細胞增殖，增強NK細胞與腫瘤細胞的連接，并顯著提高腫瘤細胞殺傷效率[26,27]。然而，由于上述藥物存在靶點多樣化或靶向分子表達譜的問題，其臨床應(yīng)用效果以及副作用都有待深入研究。

2 NK細胞治療的臨床研究進展

2.1血液腫瘤 造血系統(tǒng)惡性腫瘤的治療中NK細胞過繼回輸主要有兩種方案：一是聯(lián)合常規(guī)治療或干細胞移植，作為清除微小殘留病灶，防止復(fù)發(fā)的手段；另一種是抗腫瘤治療。早期研究顯示，接受干細胞移植的患者，其腫瘤細胞表面HLA分子缺失或與NK細胞表面抑制性KIR分子錯配時，NK細胞起到主要的抗腫瘤作用[28,29]。因此，異體來源NK細胞成為造血系統(tǒng)惡性腫瘤治療的首選。據(jù)臨床研究結(jié)果統(tǒng)計，接受干細胞移植聯(lián)合NK細胞治療的白血病患者，2年總生存率約36%，而單純干細胞移植患者2年總生存率約15%[30-32]。研究提示，NK細胞治療介入干細胞移植治療的時間不同對治療效果的影響不同[30-36]，因此NK細胞介入治療的時間、頻率都有待深入研究。此外，作為防止復(fù)發(fā)的治療策略，NK細胞治療可延長白血病患者無病生存期至平均1.5年。對于無法接收干細胞移植的復(fù)發(fā)難治型白血病，NK細胞治療可獲得高達約40%的完全緩解[3]。靶向多發(fā)性骨髓瘤的臨床研究顯示，NK細胞治療聯(lián)合干細胞移植，高達83%的患者達到部分緩解，而NK細胞單獨治療，約25%的患者達到部分緩解，17%患者無疾病進展[5,37,38]；在淋巴瘤的NK細胞治療中，約17%患者達到完全緩解，42%的患者可維持疾病穩(wěn)定無進展[39,40]。使用免疫檢驗點抑制劑，免疫調(diào)節(jié)藥物等增強NK細胞抗腫瘤能力的多項臨床研究也在進展中，最終的療效還有待觀察[40-42]?？傊?，NK細胞的泛特異性殺傷作用使其抗腫瘤譜不受限制，低副作用更安全，在血液腫瘤治療中展現(xiàn)出巨大的應(yīng)用潛力。

2.2實體腫瘤 NK細胞過繼轉(zhuǎn)輸單獨治療實體瘤效果不理想，聯(lián)合治療是潛在突破點。卵巢癌中約29%的患者達到部分緩解，57%患者病情無進展[43]。約50%的黑色素瘤細胞表面HLA分子表達缺失或降低，提示黑色素瘤細胞易誘導(dǎo)NK細胞活化，是潛在的NK細胞治療的敏感適應(yīng)癥，但臨床試驗中僅18%患者無疾病進展，其余均無臨床應(yīng)答[44-47]；乳腺癌約9%的患者達到部分緩解，60%的患者病情維持穩(wěn)定[43,46,48]。此外，在結(jié)腸癌、胃癌、直腸癌、腎癌、肺癌以及食管癌的臨床試驗中，NK細胞的轉(zhuǎn)輸治療均未有臨床應(yīng)答[46,47,49,50]。實體瘤免疫治療效率較低的主要原因與腫瘤微環(huán)境的免疫抑制作用有關(guān)[51]。目前，靶向腫瘤免疫微環(huán)境、靶向腫瘤細胞同時聯(lián)合NK細胞治療的研究顯示出腫瘤治療潛力。NK細胞聯(lián)合IgG1抗體治療胃癌與結(jié)腸癌中約50%的患者部分緩解，17%的患者病情穩(wěn)定[52]；NK細胞聯(lián)合單克隆抗體和化學(xué)藥物治療復(fù)發(fā)難治型神經(jīng)母細胞瘤，患者一年生存率可達77%[53]。NK細胞也具有免疫調(diào)節(jié)功能，細胞因子干擾素γ可促進調(diào)節(jié)性T細胞凋亡，降低免疫抑制微環(huán)境[54]，招募樹突狀細胞，增強腫瘤局部免疫細胞浸潤[55]。針對實體瘤，NK細胞聯(lián)合療法應(yīng)用可能會顯著增強療效。

3 NK細胞免疫治療展望

3.1精準醫(yī)學(xué) NK細胞可泛特異性識別惡性病變細胞，具有廣譜抗腫瘤作用。但臨床試驗結(jié)果顯示，NK細胞治療對不同腫瘤的療效存在差異。NK細胞的活化機制和殺傷機制在一定程度上解釋了NK治療不同的腫瘤效果各異的原因。NK細胞功能激活由接收的活化性信號和抑制性信號的整合決定[56]。靶細胞表達NK細胞活化性受體和抑制性受體的配體數(shù)量和豐度影響NK的激活。然而，關(guān)于腫瘤細胞上NK細胞活化性受體和抑制性受體的配體表達情況研究尚少。我們利用Firebrowse網(wǎng)站對腫瘤細胞基因轉(zhuǎn)錄測序結(jié)果分析，發(fā)現(xiàn)不同腫瘤NK細胞活化性受體和抑制性受體的配體表達類型和豐度各有差異。對NKG2D、NCR家族、CD96、LFA-1、DNAM-1等活化性受體及FASL、TRAIL等殺傷相關(guān)分子對應(yīng)配體的表達豐度分析比較顯示：食道癌、甲狀腺癌等腫瘤細胞上高表達8種以上活化性受體的配體； NK細胞抑制性受體NKG2A/CD94復(fù)合物對應(yīng)的配體HLA-E在不同腫瘤細胞上的表達無顯著差異；包括PD-1、TIGIT在內(nèi)的抑制性受體的配體在不同腫瘤上均存在差異表達。在前列腺癌和子宮肉瘤等腫瘤中低表達3種以上的抑制性配體。綜合腫瘤細胞表達活化性配體和抑制性配體來看，推測食道癌、甲狀腺癌、前列腺癌、子宮肉瘤等腫瘤細胞對NK細胞的殺傷敏感度較高。通過分析腫瘤細胞表達NK功能相關(guān)配體的種類和表達豐度建立NK細胞治療適應(yīng)癥敏感譜具有突破性的意義。使得NK細胞治療適應(yīng)癥不再按照傳統(tǒng)概念上的根據(jù)腫瘤發(fā)生部位進行區(qū)分，而是根據(jù)腫瘤細胞分子標志物進行劃分，使NK細胞治療的適應(yīng)癥選擇更有依據(jù)，有可能是實現(xiàn)NK細胞精準治療的突破點。通過CAR裝載提高NK細胞治療靶向及有效率，也是精準治療的有效策略。臨床前研究結(jié)果顯示，由于NK細胞亞群少、體內(nèi)存活時間短，CAR-NK的預(yù)期風(fēng)險上優(yōu)于CAR-T細胞治療。此外，早期臨床前研究提示，CAR-NK細胞的激活由CAR信號和NK細胞自身信號整合決定[57]，因此CAR-NK細胞抗腫瘤效果以及臨床應(yīng)用副作用有待驗證。設(shè)計適合NK細胞的CAR胞內(nèi)激活信號結(jié)構(gòu)域、提高NK細胞激活率和尋找NK細胞治療敏感的適應(yīng)癥是提高CAR-NK治療有效率的可行方法。

3.2聯(lián)合治療 傳統(tǒng)腫瘤治療手段包括手術(shù)、放療和化療，可一定程度上降低腫瘤負荷，為腫瘤免疫治療提供有利條件，提高腫瘤細胞免疫治療療效[58]。研究表明，NK細胞治療聯(lián)合傳統(tǒng)腫瘤治療手段能夠有效提高腫瘤治療效果[59]。然而，放療和化療劑量、頻率對腫瘤細胞表面分子的調(diào)節(jié)具有差異性[60]，臨床方案有待深入研究和優(yōu)化。

NK細胞不僅直接殺傷惡性病變細胞，還能參與調(diào)節(jié)免疫細胞應(yīng)答，在多種腫瘤免疫治療策略中發(fā)揮了作用。近期報道NK細胞參與樹突狀細胞免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)：NK細胞一方面通過分泌趨化因子，增強傳統(tǒng)樹突狀細胞在腫瘤內(nèi)的浸潤，促進腫瘤免疫監(jiān)控[55]；另一方面通過分泌細胞因子激活瘤內(nèi)浸潤樹突狀細胞，增強PD-1、TIGIT等免疫檢驗點抑制劑療效，上調(diào)免疫應(yīng)答響應(yīng)率[21]。NK細胞也參與調(diào)節(jié)T細胞亞群功能：NK細胞分泌的主要細胞因子干擾素γ，一方面可促進記憶T細胞的形成[61,62]；另一方面可促進調(diào)節(jié)性T細胞的凋亡[54]，降低免疫微環(huán)境抑制，增強腫瘤免疫應(yīng)答。綜上所述，NK細胞不僅具備直接殺傷腫瘤的能力，且可通過重塑腫瘤微環(huán)境，維持和發(fā)揮其抗腫瘤能力。因此，免疫檢驗點抑制劑、T細胞治療、NK細胞治療等新興免疫治療手段聯(lián)合也具有增強抗腫瘤療效的潛力。此外，基于NK細胞泛特異性識別與T細胞特異性識別腫瘤細胞的互補性，多種免疫細胞聯(lián)合治療也是提高抗腫瘤效率的策略。