孫麗娜 張 婷 郭錦錦 余運運 姚新生 孫萬邦

(遵義醫(yī)科大學(xué)珠海校區(qū)/貴州省免疫學(xué)研究生教育創(chuàng)新基地，珠海519041)

結(jié)直腸癌(Colorectal cancer，CRC)是最常見惡性腫瘤之一，是死亡率較高的腫瘤[1,2]。CRC的發(fā)生、發(fā)展受多因素的影響，治療以手術(shù)切除聯(lián)合術(shù)后化療為主，然而多藥耐藥(Multidrug resistence，MDR)是造成CRC化療失敗的關(guān)鍵原因[3-5]。怎樣提高化療敏感性以及逆轉(zhuǎn)MDR成為了CRC治療中的關(guān)鍵問題[6]。近年來研究證實MDR與細胞凋亡和自噬關(guān)系密切[7]。自噬和凋亡作為兩種不同程序性細胞死亡途徑,二者協(xié)調(diào)地調(diào)節(jié)細胞存活和細胞死亡[8,9]。細胞凋亡對維持機體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)有至關(guān)重要的作用[10]。自噬是區(qū)別于細胞凋亡的另一種細胞程序性死亡路徑[11,12]。因此，以自噬和凋亡的發(fā)生過程、二者間的關(guān)聯(lián)性及其對腫瘤的影響為方向展開研究，為抗癌治療打開全新的思路。

順鉑(Cisplatin，DDP)在多種腫瘤中常作為首選化療藥，臨床研究表明，對行結(jié)直腸癌根治術(shù)后的患者使用DDP腹腔持續(xù)熱灌注進行化療，可顯著降低復(fù)發(fā)率和肝轉(zhuǎn)移率，提高其免疫功能；順鉑與地西他濱或伊利替康聯(lián)合應(yīng)用不僅可以緩解結(jié)直腸癌腫瘤生長速度還可以延長生存期[13,14]。而長春新堿(Vincristine，VCR)作為常用化療藥物易產(chǎn)生耐藥性，長春新堿與金絲桃苷或姜黃素聯(lián)合應(yīng)用可產(chǎn)生耐藥逆轉(zhuǎn)作用[15]。本研究選用DDP與 VCR單獨及聯(lián)合用藥對HCT-8/V進行藥物干預(yù)研究，采用實時動態(tài)活細胞成像(Real-time live-cell imaging，RT-LCI)高內(nèi)涵技術(shù)平臺，觀察HCT-8/V細胞生長、凋亡與自噬，以期為CRC耐藥性的治療提供理論支持。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1腫瘤細胞株 直結(jié)腸癌細胞株HCT-8細胞(3111C0001CCC000104)、直結(jié)腸癌耐長春新堿細胞株HCT-8/V細胞(3111C0001CCC000486)均由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院提供。

1.1.2儀器與藥物 IncuCyte ZOOM 實時動態(tài)活細胞成像系統(tǒng)為美國Essen Bioscience公司產(chǎn)品；順鉑(DDP)、長春新堿(VCR)為Sigma公司產(chǎn)品；CellEventTMCaspase-3/7 Green ReadyProbesTMReagent為Thermo Fisher公司產(chǎn)品；細胞自噬mRFP-GFP-LC3腺病毒由lgebio公司生產(chǎn)。

1.2方法

1.2.1RT-LCI平臺篩選腫瘤細胞生長條件 HCT-8和HCT-8/V細胞在RPMI1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)至細胞數(shù)目分別為1×103個/ml、1×104個/ml、1×105個/ml，置于RT-LCI平臺觀察HCT-8與HCT-8/V細胞生長規(guī)律及對數(shù)生長期。

1.2.2RT-LCI平臺觀察腫瘤細胞增殖、凋亡與自噬 取傳代的細胞，分別接種于兩塊96孔培養(yǎng)板，調(diào)整細胞數(shù)為8 000個/孔，每孔100 μl，37℃培養(yǎng)24 h，待細胞完全貼壁，吸出各孔中培養(yǎng)基。第一板分別設(shè)置正常對照組以及16個實驗組，實驗組包括不同濃度DDP(0.5～5 μg/ml)和不同濃度的VCR(1～5 μg/ml)細胞增殖與凋亡實驗組，每組3個孔；DDP(2～4 μg/ml)分別與VCR(1.5 μg/ml)或(2 μg/ml) 聯(lián)合實驗組，每組3個孔。另一塊板分別設(shè)置HCT-8/V細胞自噬正常對照組以及16個實驗組，實驗組包括不同濃度的DDP(1～5 μg/ml)和不同濃度的VCR(0.5～3 μg/ml)細胞自噬實驗組，每組3個孔；DDP(2～4 μg/ml)分別與VCR(1.5 μg/ml)或(DDP 2 μg/ml)聯(lián)合用藥自噬實驗組，每組3個孔。

對實驗組細胞進行免疫熒光染色，加入Apo-488即用型熒光染料、CellEventTMCaspase-3/7 Green ReadyProbesTMReagent凋亡試劑和自噬腺病毒(mRFP-LC3-GFP)分別進行凋亡早期檢測和不同濃度DDP、VCR單獨以及聯(lián)合用藥對HCT-8/V自噬進行檢測。將設(shè)置好的兩塊96孔板分別置于IncuCyte系統(tǒng)載物臺，共觀察105孔，使用10倍物鏡，每孔每小時拍攝3個視野，第一塊板白光用于觀察每個視野中細胞增殖情況，綠光用于觀察每個視野中細胞凋亡情況；第二塊板白光用于觀察每個視野中細胞增殖情況，綠光用于觀察每個視野中自噬LC3-GFP形成過程，紅光觀察細胞自噬聚合物L(fēng)C3-RFP形成過程。

2 結(jié)果

2.1RT-LCI平臺觀察HCT-8與HCT-8/V細胞生長規(guī)律 HCT-8與HCT-8/V細胞用IncuCyte ZOOM實時活細胞成像平臺觀察，細胞增殖結(jié)果(見圖1)：HCT-8細胞密度為1×103個/ml時，接種后64 h細胞增殖進入對數(shù)生長期，此時細胞融合度達40%，而細胞密度為1×104個/ml時，接種后30 h細胞增殖進入對數(shù)生長期，此時細胞融合度達80%。相比HCT-8細胞HCT-8/V細胞生長緩慢，細胞密度為1×103個/ml時，接種后120 h細胞融合度僅僅達到10%，細胞密度為1×104個/ml時，接種后64 h細胞融合度達40%，120 h之后細胞可以達到55%細胞飽和度，延長觀察時間后發(fā)現(xiàn)144 h達到對數(shù)生長期；HCT-8與HCT-8/V兩株細胞均以1×105個/ml密度鋪板時，因細胞太多不能觀察生長規(guī)律。

2.2DDP單獨及聯(lián)合應(yīng)用VCR對HCT-8/V增殖的影響

2.2.1DDP單獨應(yīng)用對HCT-8/V增殖的影響 應(yīng)用IncuCyte ZOOM動態(tài)觀察DDP(0.5～5 μg/ml)對HCT-8/V(1×104)的抑制作用，結(jié)果(圖2)在觀察時間點70 h時DDP(1～5 μg/ml)對HCT-8/V均有抑制作用，與未加藥組比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。但DDP的抑制作用出現(xiàn)不規(guī)律的情況，當DDP為4 μg/ml藥物濃度時抑制細胞增殖的作用效率最強。

圖1 人HCT-8與HCT-8/V細胞不同培養(yǎng)時間生長曲線Fig.1 Growth curve of HCT-8 and HCT-8/V in logarithmic phaseNote: HCT-8 cells were cultured at 1×104 cells/well for 30 h to enter the logarithmic growth phase.HCT-8 reached 100% cell saturation at 45 h;HCT-8/V grew slowly,and 1×104 ml-1 63 h entered the logarithmic growth phase.

2.2.2VCR單獨應(yīng)用對HCT-8/V增殖的影響 應(yīng)用IncuCyte ZOOM動態(tài)觀察VCR(1～5 μg/ml)對HCT-8/V(1×104)抑制細胞增殖的作用效率表現(xiàn)為明顯的劑量依賴關(guān)系，圖3結(jié)果顯示，5個不同藥物濃度的VCR干預(yù)HCT-8/V細胞增殖后的38 h內(nèi)各濃度抑制細胞生長無差異，38 h后各濃度抑制作用逐漸加強，抑制作用的強弱與VCR的濃度呈正比，加藥組與未加藥組相比較其細胞增殖抑制率有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.2.3DDP聯(lián)合VCR對HCT-8/V增殖的影響 DDP(2～4 μg/ml)分別與VCR(1.5 μg/ml)聯(lián)合用藥對細胞增殖的影響，結(jié)果顯示(見圖4)聯(lián)合用藥組細胞增殖抑制率均高于無藥物干預(yù)組，藥物聯(lián)合組以DDP (2 μg/ml)+VCR(2 μg/ml)濃度聯(lián)合抑制作用最強，在加藥后24 h出現(xiàn)明顯的抑制作用，用藥70 h與未加藥組比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.3DDP、VCR干預(yù)對HCT-8/V細胞凋亡的影響 藥物干預(yù)對HCT-8/V細胞凋亡的影響，結(jié)果顯示(圖5)與對照組比較，DDP(0.5～5 μg/ml)20 h內(nèi)與VCR(0.5～5 μg/ml)36 h內(nèi)對HCT-8/V細胞的抑制作用都主要表現(xiàn)在抑制細胞的生長，而不是促進細胞凋亡。DDP與VCR對HCT-8/V細胞凋亡促進作用非常小，差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義。

圖2 DDP對HCT-8/V增殖的影響結(jié)果Fig.2 Effect of DDP on HCT-8/V proliferationNote: Different concentrations of DDP inhibit proliferation of HCT-8/V cells，*.P<0.05 vs normal control(HCT-8/V).

圖3 VCR對HCT-8/V增殖的影響結(jié)果Fig.3 Effect of VCR on HCT-8/V proliferationNote: Different concentrations of VCR inhibit proliferation of HCT-8/V cells，*.P<0.05 vs normal control(HCT-8/V).

2.4DDP單獨及聯(lián)合應(yīng)用VCR對HCT-8/V自噬的影響 應(yīng)用IncuCyte ZOOM觀察DDP(1～5 μg/ml)、VCR(0.5～3 μg/ml)不同濃度單獨及聯(lián)合用藥對HCT-8/V(1×104)自噬細胞的影響。

2.4.1DDP單獨應(yīng)用對HCT-8/V自噬的影響 不同濃度DDP單獨應(yīng)用對HCT-8/V細胞處理后，用IncuCyte ZOOM觀察細胞自噬，計算每孔自噬體個數(shù)。圖6A是70 h未加藥物處理組與不同濃度DDP(1～5 μg/ml)對HCT-8/V細胞處理后的顯微鏡圖像結(jié)果，圖中清晰可見有自噬體的形成，其中DDP(2 μg/ml )組與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖6B。

圖4 DDP聯(lián)合VCR對HCT-8/V增殖的影響結(jié)果Fig.4 Effect of DDP alone and combined VCR on HCT-8/V proliferationNote: Combination of DDP and VCR inhibits the proliferation of HCT-8/V cells，*.P<0.05 vs normal control(HCT-8/V).

圖5 DDP、VCR干預(yù)HCT-8/V細胞70 h內(nèi)凋亡檢測結(jié)果Fig.5 DDP and VCR interfered with HCT-8/V cell apoptosis within 70 hoursNote: A.Effect of DDP on the HCT-8/V cell apoptosis graph(0-70 h)；B.Effect of VCR on the HCT-8/V cell apoptosis graph(0-70 h).

圖6 DDP對HCT-8/V自噬的影響結(jié)果Fig.6 Effect of DDP on autophagy of HCT-8/VNote: A.HCT-8/V cells treated with DDP alone at different concentrat-ions were used to observe autophagy using IncuCyte ZOOM.Green light (cell autophagosomes),red light (autophagy),and yellow light (autophagosomes).A1.Non Treated;A2-A6.DDP(1 μg/ml)，(2 μg/ml)，(3 μg/ml)，(4 μg/ml)，(5 μg/ml);B.*.P<0.05 vs normal control(HCT-8/V).

圖7 VCR對HCT-8/V自噬的影響結(jié)果Fig.7 Effect of VCR on Autophagy of HCT-8/VNote: A.HCT-8/V cells treated with VCR alone at different concentrations were used to observe autophagy using IncuCyte ZOOM.Green light (cell autophagosomes),red light (autophagy),and yellow light (autophagosomes).A1.Non Treated;A2-A6.VCR(1 μg/ml)，(1.5 μg/ml)，(2 μg/ml)，(3 μg/ml);B.*.P<0.05 vs normal control(HCT-8/V).

2.4.2VCR單獨應(yīng)用對HCT-8/V自噬的影響 不同濃度VCR單獨應(yīng)用對HCT-8/V細胞處理后，用IncuCyte ZOOM觀察細胞自噬，計算每孔自噬體個數(shù)。圖7A是70 h未加藥物處理組與不同濃度VCR(0.5～3 μg/ml)對HCT-8/V細胞處理后的顯微鏡圖像結(jié)果，圖中清晰可見有自噬體的形成，其中VCR(0.5～1.5 μg/ml)組與對照組比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖7B。

2.4.3DDP聯(lián)合VCR對HCT-8/V自噬的影響 DDP(2～4 μg/ml)分別與VCR(1.5 μg/ml)或(2 μg/ml)聯(lián)合對HCT-8/V細胞處理后，用IncuCyte ZOOM觀察細胞自噬，計算每孔自噬體個數(shù)。圖8是70 h未加藥物處理組與不同濃度DDP(2～4 μg/ml)分別與VCR(1.5 μg/ml)或 (2 μg/ml)聯(lián)合處理后的顯微鏡圖像結(jié)果，圖中清晰可見有自噬溶酶體的形成，除了DDP(3 μg/ml)+VCR(1.5 μg/ml)與DDP(4 μg/ml)+VCR(1.5 μg/ml)兩個實驗組外，其他實驗組與對照組比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

圖8 DDP聯(lián)合VCR對HCT-8/V自噬檢測的結(jié)果Fig.8 Effect of DDP and combined VCR on HCT-8/V apoptosisNote: A.Combined use of DDP and VCR on HCT-8/V cells for observing autophagy using IncuCyte ZOOM.Green light (cell autophagosomes),red light (autophagy),and yellow light (autophagosomes).A1.Non Treated;A2-A7.DDP(2 μg/ml)+VCR(1.5 μg/ml);DDP(2 μg/ml)+VCR(2 μg/ml);DDP(3 μg/ml)+VCR(1.5 μg/ml);DDP(3 μg/ml)+VCR(2 μg/ml);DDP(4 μg/ml)+VCR(1.5 μg/ml);DDP(4 μg/ml)+VCR(2 μg/ml)；B.*.P<0.05 vs normal control(HCT-8/V).

3 討論

實時動態(tài)活細胞成像技術(shù)以其高通量、特異性強、靈敏度高、檢測深度較大、定量精確等優(yōu)點被廣泛應(yīng)用于細胞增殖、遷移與侵襲、細胞凋亡、免疫細胞殺傷、細胞自噬、三維腫瘤球體成像等細胞檢測[17-23]。常規(guī)的腫瘤細胞檢測方法多為終點法，即預(yù)先設(shè)定某時間點進行觀察[24,25]，該方法明顯的缺點就是無法記錄細胞生長時的實時動態(tài)增殖過程，更無法對細胞的生長過程做出準確分析?；赗T-LCI系統(tǒng)的優(yōu)越性，我們采用IncuCyte ZOOM平臺對HCT-8細胞與HCT-8/V細胞進行篩選，從細胞生長規(guī)律觀察發(fā)現(xiàn)，HCT-8細胞1×103個/ml濃度時64 h細胞增殖進入對數(shù)生長期，1×104個/ml濃度時30 h細胞增殖進入對數(shù)生長期，細胞融合度達80%；而HCT-8/V細胞1×103個/ml濃度時120 h細胞融合度僅僅達10%，1×104個/ml濃度時64 h細胞融合度達40%，延長觀察時間后發(fā)現(xiàn)144 h達到對數(shù)生長期。這一結(jié)果為準確研究細胞生長時間、數(shù)量提供了參考?；贖CT-8/V生長增殖緩慢，144 h達到對數(shù)生長期。根據(jù)不同細胞濃度、不同時間結(jié)果分析，從兩株細胞同時實驗的可比性出發(fā)，實驗選擇細胞濃度1×104個/ml種植更適合生長增殖實時動態(tài)觀察。

自噬是一個吞噬自身細胞質(zhì)蛋白或細胞器并使其包被進入囊泡，并與溶酶體融合形成自噬溶酶體，降解其所包裹的內(nèi)容物的過程。自噬已經(jīng)在癌癥中被廣泛研究，自噬可以促進癌細胞的存活，也可以抑制癌癥[26,27]。誘導(dǎo)或抑制自噬在許多疾病中具有潛在價值[28]。自噬抑制可以增加癌細胞對抗癌藥物的毒性和敏感性，耐藥性是癌癥治療中的主要問題，但是對藥物抗腫瘤細胞生長的機制知之甚少。細胞自噬現(xiàn)象存在于結(jié)直腸癌細胞中，研究發(fā)現(xiàn)其在發(fā)生、發(fā)展的不同階段，自噬可能起著不同的作用[29]。Sasaki等[30]發(fā)現(xiàn)用5-氟尿嘧啶處理結(jié)腸癌HT-29細胞可誘導(dǎo)自噬產(chǎn)生，而抑制自噬可增強HT-29細胞對5-氟尿嘧啶的敏感性。近年來研究發(fā)現(xiàn)化療耐藥可能與自噬相關(guān)。Bao等[31]研究發(fā)現(xiàn)自噬可介導(dǎo)卵巢癌細胞A2780對DDP的耐藥，抑制自噬可增強DDP對A2780的細胞毒性。因此，探索自噬在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的這把“雙刃劍”的功能，特別是化療藥物逆轉(zhuǎn)MDR為結(jié)直腸癌治療尋求新的治療靶點提供依據(jù)。

順鉑(Cisplatin)為目前常用的金屬鉑類絡(luò)合物，具有抗瘤譜廣、作用強、與多種抗腫瘤藥有協(xié)同作用、無交叉耐藥等特點，為當前聯(lián)合化療中最常用的藥物之一。但對腎、神經(jīng)系統(tǒng)及胰腺有毒性。能與DNA結(jié)合形成交叉鍵，從而破壞DNA的功能不再復(fù)制，高濃度時也抑制RNA及蛋白質(zhì)的合成，為一種周期非特異性藥物[32]。針對結(jié)直腸癌耐長春新堿細胞，本研究選用DDP聯(lián)合VCR干預(yù)HCT-8/V細胞的增殖、凋亡和自噬，實驗結(jié)果表明，DDP(0.5～5 μg/ml)、VCR(1～5 μg/ml)單獨應(yīng)用抑制HCT-8/V細胞增殖，DDP(0.5～5 μg/ml)對HCT-8/V的抑制作用無規(guī)律性，而VCR(1～5 μg/ml)對HCT-8/V的抑制作用與VCR的濃度呈劑量依賴性，且與未加藥組相比較其抑制率有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；DDP(2～4 μg/ml)分別與VCR(1.5 μg/ml)聯(lián)合用藥的細胞增殖抑制率均高于無藥物干預(yù)組(P<0.05)，DDP顯著增強VCR對HCT-8/V的生長抑制作用，并能減少VCR的用量。

通過IncuCyte ZOOM系統(tǒng)觀察，HCT-8/V細胞自然增殖過程中伴隨有細胞自噬現(xiàn)象，HCT-8/V細胞增殖受到了抑制作用后，自噬現(xiàn)象也會受到抑制，HCT-8/V細胞有可能通過細胞自噬現(xiàn)象產(chǎn)生了耐藥性，即細胞自噬現(xiàn)象對HCT-8/V細胞的增殖是有利的。本實驗采用DDP聯(lián)合VCR干預(yù)HCT-8/V細胞的自噬，研究發(fā)現(xiàn)DDP(0.5～5 μg/ml)、VCR(1～5 μg/ml) 單獨及聯(lián)合應(yīng)用抑制HCT-8/V細胞自噬，且聯(lián)合用藥組對HCT-8/V的增殖與自噬的抑制作用要優(yōu)于單獨用藥組。

細胞自噬與凋亡關(guān)系復(fù)雜，有研究報道在執(zhí)行CRC細胞死亡時，自噬可能與凋亡并存。如Xiong等[33]用purvalanol處理結(jié)腸癌HCT116細胞后，在CRC細胞中觀察到自噬和凋亡的連續(xù)發(fā)生，提示這兩種程序性細胞死亡途徑可能分別驅(qū)動細胞死亡。本研究利用IncuCyte ZOOM實時動態(tài)活細胞成像系統(tǒng)觀察，參照對照組細胞凋亡水平，可以看出DDP(0.5～5 μg/ml)和VCR(0.5～5 μg/ml)對HCT-8/V細胞的抑制作用，都主要表現(xiàn)在抑制細胞的生長，而不促進細胞凋亡，DDP與VCR對HCT-8/V細胞凋亡的促進作用沒有統(tǒng)計學(xué)差異，表明DDP、VCR不能通過凋亡的途徑達到治療HCT-8/V的目的。已有文獻報道，誘導(dǎo)結(jié)腸癌HCT-8對VCR耐藥后，耐藥細胞表現(xiàn)為Bax和PUMA缺陷[34]；本實驗DDP聯(lián)合VCR抑制自噬但不可促進其凋亡，其機制可能是由于自噬無法在Bax和PUMA缺陷的HCT-8/V細胞誘導(dǎo)，而進一步的機制探討將在后續(xù)研究中進行。

綜 上所 述，DDP聯(lián)合VCR可抑制HCT-8/V細胞的增殖，誘導(dǎo)細胞自噬，DDP聯(lián)合VCR通過抑制細胞增殖與誘導(dǎo)細胞自噬實現(xiàn)耐藥性逆轉(zhuǎn)。