劉邦儉 王 琦 郜 磊 于德新

(安徽省太和縣第二人民醫(yī)院泌尿外科，太和236600)

膀胱癌是我國(guó)常見(jiàn)的泌尿系統(tǒng)腫瘤之一，具有高發(fā)病率和高復(fù)發(fā)率的特點(diǎn)，其發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多階段多基因的復(fù)雜過(guò)程，涉及到癌基因活化、抑癌基因失活、細(xì)胞周期調(diào)控失常等諸多方面[1]，因此研究膀胱癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制具有重要意義。同源盒(HOX)基因家族是同源框基因中的一大類(lèi)，分為A、B、C和D四個(gè)族，既往研究表明，HOX異常表達(dá)與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[2,3]。HOXB5為HOX家族成員之一，有研究顯示，HOXB5可通過(guò)上調(diào)β-catenin誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞侵襲及遷移[4]。HOXB5可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖及侵襲[5]。膀胱癌中HOXB5呈現(xiàn)高表達(dá)，抑制其表達(dá)可降低癌細(xì)胞致癌性[6]。HOXB5基因?qū)Π螂装┘?xì)胞凋亡、免疫抑制因子表達(dá)的影響研究尚未明確。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(Transforming growth factor-β1，TGF-β1)是腫瘤免疫抑制中最重要的因子[7]。異?；罨腟TAT3信號(hào)與細(xì)胞的增殖異常和惡性轉(zhuǎn)化密切相關(guān)，抑制STAT3信號(hào)可降低腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)[8]。因此，本研究旨在探討HOXB5基因?qū)Π螂装┘?xì)胞凋亡、免疫抑制因子VEGF和TGF-β1表達(dá)及STAT3信號(hào)的影響。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞 正常膀胱上皮細(xì)胞SV-HUC-1及T24、5637、BIU-87三組膀胱癌細(xì)胞系均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。

1.1.2主要試劑和儀器 DMEM培養(yǎng)基、FBS均購(gòu)自美國(guó)Gibco；蛋白裂解液購(gòu)自日本TaKaRa；BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自上海索寶生物；Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡試劑盒購(gòu)自南京凱基；兔抗人HOXB5抗體購(gòu)自美國(guó)GeneCopoeia(貨號(hào)：F0041)；兔抗人p-JAK2抗體(貨號(hào)：4406)、兔抗人p-STAT3抗體(貨號(hào)：9145)、兔抗人Bax抗體(貨號(hào)：2772)、兔抗人VEGF抗體(貨號(hào)：2479)和兔抗人TGF-β1抗體(貨號(hào)：5154)及HRP標(biāo)記兔抗鼠二抗均購(gòu)自美國(guó)CST；流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD；凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自北京六一儀器廠(chǎng)。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞常規(guī)復(fù)蘇后，接種于培養(yǎng)瓶中，在5%CO2、37℃條件下用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。隔天換液，細(xì)胞在瓶壁鋪滿(mǎn)75%時(shí)進(jìn)行傳代。選擇生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)研究。1.2.2轉(zhuǎn)染 siRNA序列設(shè)計(jì)及合成均由上海吉瑪公司完成。T24細(xì)胞分為3組處理，si-HOXB5組(轉(zhuǎn)染HOXB5的特異性siRNA)、NC組(轉(zhuǎn)染無(wú)干擾的siRNA)和空白組(細(xì)胞未經(jīng)特殊處理)。參照LipofectamineTM2000(美國(guó)，Invitrogen)說(shuō)明，以2×105個(gè)/孔細(xì)胞濃度接種生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期的T24細(xì)胞于6孔板，恒溫孵箱中孵育24 h，細(xì)胞貼壁且生長(zhǎng)密度達(dá)到70%后將制備的lip2000-siRNA復(fù)合物加入至6孔板，孵育6 h后換為含血清的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，收集轉(zhuǎn)染48 h細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)研究。

1.2.3Western blot RIPA蛋白裂解液適量提取細(xì)胞總蛋白，BCA法定量蛋白，參照碧云天試劑盒說(shuō)明配制10%濃度的膠，每孔道加總蛋白40 μg，100 V 恒壓電泳2 h，蛋白分離后在100 V恒壓下轉(zhuǎn)膜1.5 h，轉(zhuǎn)好的膜用5%脫脂奶粉室溫條件封閉1 h，將膜與一抗(均按照1∶1 000稀釋的HOXB5、p-JAK2、p-STAT3、Bax、VEGF和TGF-β1抗體)，4℃孵育過(guò)夜，洗膜，室溫孵育HRP標(biāo)記的二抗1 h，洗膜，ECL顯色，GAPDH蛋白為內(nèi)參，Gel Pro 4.0軟件分析各蛋白與內(nèi)參的灰度值比值，以其比值為各目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4細(xì)胞凋亡檢測(cè) 胰酶消化生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期的T24細(xì)胞(細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)75%)，制備成細(xì)胞懸液，細(xì)胞濃度調(diào)整為5×105個(gè)/ml，取混懸液1 ml，離心，棄掉上清，PBS洗滌后用1×binding buffer 400 μl重懸細(xì)胞，分別在每處理組細(xì)胞中加入5 μl的Annexin V-FITC和10 μl的PI，4℃避光染色15～20 min，上機(jī)前再加入300 μl的1×binding buffer，1 h內(nèi)通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.5抑制STAT3信號(hào)對(duì)膀胱癌細(xì)胞凋亡的影響 si-HOXB5或STAT3信號(hào)通路抑制劑AG490(50 μmol/L)單獨(dú)或聯(lián)合處理T24細(xì)胞48 h，細(xì)胞分為 si-HOXB5組、AG490組和si-HOXB5+AG490組，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，Western blot檢測(cè)p-JAK2、p-STAT3、Bax、p53和VEGF的蛋白表達(dá)。方法同1.2.3。

2 結(jié)果

2.1HOXB5在膀胱癌細(xì)胞的表達(dá) 以正常膀胱上皮細(xì)胞SV-HUC-1為對(duì)照，Western blot檢測(cè)膀胱癌T24、5637和BIU-87細(xì)胞HOXB5的蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示，HOXB5在T24、5637和BIU-87細(xì)胞的蛋白表達(dá)均顯著高于在SV-HUC-1細(xì)胞表達(dá)(P<0.05)。T24細(xì)胞中HOXB5的表達(dá)最高，選擇作為研究對(duì)象。見(jiàn)圖1、表1。

圖1 HOXB5在膀胱癌細(xì)胞的表達(dá)Fig.1 Expression of HOXB5 in bladder cancer cells

2.2HOXB5 siRNA轉(zhuǎn)染T24細(xì)胞效果 HOXB5 siRNA轉(zhuǎn)染T24細(xì)胞后HOXB5蛋白表達(dá)檢測(cè)結(jié)果如圖2和表2所示，si-HOXB5組HOXB5表達(dá)顯著低于空白組(P<0.05)，NC組HOXB5的表達(dá)與空白組差異不顯著(P>0.05)。

2.3HOXB5 siRNA對(duì)T24細(xì)胞凋亡的影響 各組細(xì)胞凋亡率檢測(cè)結(jié)果如圖3和表3所示，si-HOXB5組細(xì)胞凋亡率高于NC組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.4HOXB5 siRNA對(duì)T24細(xì)胞STAT3信號(hào)通路的影響 Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞p-JAK2、p-STAT3及STAT3信號(hào)通路下游凋亡相關(guān)的Bax和免疫抑制因子VEGF、TGF-β1的蛋白表達(dá)，結(jié)果如圖4和表4所示，與NC組比較，si-HOXB5組p-JAK2、p-STAT3、VEGF和TGF-β1的蛋白表達(dá)均明顯降低，Bax的蛋白表達(dá)明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1 HOXB5在膀胱癌細(xì)胞的表達(dá)

Tab.1 Expression of HOXB5 in bladder cancer cells

CellsRelative expression of HOXB5 proteinSV-HUC-10.048±0.007T240.656±0.0571)56370.479±0.0481)BIU-870.511±0.0511)F100.350P0.000

Note：1)P<0.05 vs SV-HUC-1.

圖2 HOXB5 siRNA轉(zhuǎn)染T24細(xì)胞后HOXB5蛋白表達(dá)電泳圖Fig.2 Electrophoresis of HOXB5 protein after HOXB5 siRNA was transfected into T24 cells

表2 HOXB5 siRNA轉(zhuǎn)染T24細(xì)胞后HOXB5蛋白相對(duì)表達(dá)量

Tab.2 Relative expression of HOXB5 protein after HOXB5 siRNA was transfected into T24 cells

GroupsRelative expression of HOXB5 proteinBlank group0.508±0.047NC group0.487±0.045si-HOXB5 group0.088±0.0101)F116.304P0.000

Note：1)P<0.05 vs Blank group.

2.5抑制STAT3信號(hào)通路對(duì)T24細(xì)胞凋亡的影響 si-HOXB5或STAT3信號(hào)通路抑制劑AG490處理T24細(xì)胞后，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率，如圖5和表5所示，si-HOXB5+AG490組細(xì)胞凋亡率均顯著高于si-HOXB5組(P<0.05)和AG490組(P<0.05)。

圖3 HOXB5 siRNA對(duì)T24細(xì)胞凋亡的影響Fig.3 Effect of HOXB5 siRNA on apoptosis of T24 cells

表3 HOXB5 siRNA對(duì)T24細(xì)胞凋亡的影響

Tab.3 Effect of HOXB5 siRNA on apoptosis of T24 cells

GroupsApoptosis rate(%)Blank group3.24±0.21NC group3.08±0.19si-HOXB5 group24.76±1.681)F482.236P0.000

Note：1)P<0.05 vs NC group.

圖4 HOXB5 siRNA對(duì)T24細(xì)胞STAT3信號(hào)通路的影響Fig.4 Effect of HOXB5 siRNA on JAK2/STAT3 signaling pathway in T24 cells

表4 HOXB5 siRNA對(duì)T24細(xì)胞STAT3信號(hào)通路的影響

Tab.4 Effect of HOXB5 siRNA on JAK2/STAT3 signaling pathway in T24 cells

Groupsp-JAK2p-STAT3BaxVEGFTGF-β1Blank group0.202±0.0230.142±0.0130.113±0.0140.506±0.0560.325±0.032NC group0.195±0.0200.158±0.0150.110±0.0130.519±0.0590.341±0.036si-HOXB5 group0.046±0.0071)0.053±0.0081)0.477±0.0481)0.174±0.0211)0.125±0.0151)F71.45162.889150.16548.75751.225P0.0000.0000.0000.0000.000

Note：1)P<0.05 vs NC group.

圖5 抑制STAT3信號(hào)通路對(duì)T24細(xì)胞凋亡的影響Fig.5 Effect of inhibition of STAT3 signaling pathway on apoptosis of T24 cells

表5 抑制STAT3信號(hào)通路對(duì)T24細(xì)胞凋亡的影響

Tab.5 Effect of inhibition of STAT3 signaling pathway on apoptosis of T24 cells

GroupsApoptosis rate(%)si-HOXB5 group25.88±1.77AG490 group16.54±1.09si-HOXB5+AG490 group34.61±2.181)2)F81.002P0.000

Note：1)P<0.05 vs si-HOXB5；2)P<0.05 vs AG490 group.

3 討論

近些年的研究表明，HOX家族的一些基因與膀胱癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。如膀胱癌中HOXB7表達(dá)上調(diào)，其表達(dá)強(qiáng)度與TNM分期及病理分級(jí)呈現(xiàn)正相關(guān)[9]；HOXA13表達(dá)失調(diào)與膀胱癌預(yù)后不良有關(guān)[10]。MiR-193a-3p可靶向HOXC9增強(qiáng)膀胱癌的耐藥性[11]。HOXB5為HOX家族的一個(gè)成員，在腫瘤中的研究較少，有研究顯示，口腔鱗癌等腫瘤中HOXB5出現(xiàn)異常表達(dá)[12]，膀胱癌中HOXB5表達(dá)上調(diào)，抑制其表達(dá)可降低癌細(xì)胞生長(zhǎng)[6]，但HOXB5對(duì)膀胱癌細(xì)胞凋亡及免疫的影響研究尚未明確。RNA干擾(RNAi)是由雙鏈RNA介導(dǎo)的在轉(zhuǎn)錄后水平阻斷基因表達(dá)的技術(shù)，具有高效性和特異性，利用該技術(shù)可將細(xì)胞癌變過(guò)程中抑癌基因、癌基因、凋亡相關(guān)基因、多藥耐藥基因等特異性封閉，從而達(dá)到腫瘤治療的目的，目前已在基因功能研究、腫瘤基因治療等方面有廣泛的應(yīng)用[13,14]。本研究首先檢測(cè)了不同膀胱癌細(xì)胞HOXB5的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)膀胱癌T24細(xì)胞HOXB5的表達(dá)最高，因此選擇T24細(xì)胞作為研究對(duì)象。通過(guò)RNAi技術(shù)抑制T24細(xì)胞HOXB5表達(dá)，發(fā)現(xiàn)HOXB5表達(dá)受到抑制后T24細(xì)胞的凋亡率明顯升高。

腫瘤細(xì)胞分泌的免疫抑制分子是其發(fā)生免疫逃逸的一個(gè)重要機(jī)制，可影響一些腫瘤的發(fā)生發(fā)展。迄今已報(bào)道在不同腫瘤細(xì)胞可見(jiàn)的免疫分子約有20余種，VEGF、TGF-β1、IL-4、IL-6和IL-10五種免疫抑制分子較為常見(jiàn)。TGF-β1是一種有多種功能的蛋白多肽，生物學(xué)特征復(fù)雜，與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，可對(duì)免疫細(xì)胞的增殖起抑制作用[15,16]。VEGF是一個(gè)最有效的促血管生長(zhǎng)因子[17]，有研究表明，膀胱癌中TGF-β1和VEGF的表達(dá)均明顯升高，促進(jìn)TGF-β1和VEGF表達(dá)可參與膀胱癌免疫逃逸[18]。本研究結(jié)果顯示，HOXB5表達(dá)抑制可降低T24細(xì)胞TGF-β1和VEGF表達(dá)，這提示抑制HOXB5表達(dá)可提高膀胱癌細(xì)胞免疫反應(yīng)。STAT3為STATs家族成員之一，為一類(lèi)核轉(zhuǎn)錄因子，參與細(xì)胞增殖、凋亡、分化等細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)控，其異?；罨蓞⑴c膀胱癌、肺癌等多種人類(lèi)惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展，因此被稱(chēng)為癌基因，阻斷STAT3信號(hào)已成為腫瘤治療的新靶點(diǎn)[19,20]。目前已發(fā)現(xiàn)JAK2激酶抑制劑AG490為STAT3通路的特異性阻斷劑。有研究表明，AG490可誘導(dǎo)膀胱癌細(xì)胞凋亡[21]。此外，也有研究發(fā)現(xiàn)，AG490可阻斷肝癌細(xì)胞STAT3信號(hào)通路，降低TGF-β1和VEGF表達(dá)，從而逆轉(zhuǎn)免疫抑制[22]。Bax為Bcl-2家族成員之一，發(fā)揮促凋亡作用[23]。本研究檢測(cè)HOXB5表達(dá)抑制后p-JAK2、p-STAT3、Bax、VEGF和TGF-β1的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)p-JAK2、p-STAT3、VEGF和TGF-β1的表達(dá)明顯受到抑制，Bax表達(dá)升高，HOXB5表達(dá)抑制與AG490共同處理T24細(xì)胞后細(xì)胞的凋亡率高于si-HOXB5組和AG490組。這提示抑制HOXB5表達(dá)可能通過(guò)下調(diào)STAT3信號(hào)影響T24細(xì)胞凋亡及免疫反應(yīng)。

綜上所述，HOXB5基因表達(dá)抑制可誘導(dǎo)膀胱癌細(xì)胞凋亡，下調(diào)免疫抑制因子VEGF和TGF-β1表達(dá)，機(jī)制與抑制STAT3信號(hào)通路有關(guān)。本研究可能為膀胱癌的診療提供了一定的理論基礎(chǔ)。