楊 釩 鄭毅文 周有祥 楊玉林

(興義市人民醫(yī)院兒科,興義562400)

急性肺損傷是由感染、創(chuàng)傷、休克、有害氣體吸入和中毒等引起的機體過度炎癥反應(yīng)急性綜合征[1]。主要病理特征為肺毛細血管的通透性增加、肺泡滲出液中富含蛋白質(zhì)、肺水腫伴隨肺間質(zhì)纖維化。急性肺損傷的嚴重階段稱為急性呼吸窘迫綜合征，炎癥反應(yīng)失控持續(xù)放大后，會引發(fā)全身性的炎癥反應(yīng)綜合征[2]。急性肺炎發(fā)病急，死亡率高，常需要進重癥監(jiān)護室觀察，同時伴隨機械通氣。據(jù)統(tǒng)計，每年10萬人中約有12～23個人會患急性肺損傷，死亡率高達25%～40%，且發(fā)病機制不十分清楚[3]。目前急性肺損傷的治療難點在于準(zhǔn)確辨別急性肺損傷和心源性肺水腫，治療的方案從終止肺損傷、減輕肺水腫、保證供氧和減少并發(fā)癥等方面入手，其中減少肺部炎癥反應(yīng)是治療的根本[4]。為此，研究急性肺損傷的發(fā)病機制，尋找特定藥物靶點，開發(fā)有效的治療方法是主要方向。人參皂苷是固醇類化合物為人參的主要活性成分。從人參中提取出的皂苷單體有40多種，其中Rb、Rc、Rd、Re和Rg占90%以上。研究顯示，人參皂苷Rb2具有促進脂代謝、增強肝臟糖代謝、抑制視網(wǎng)膜色素上皮細胞增生、抗腫瘤等作用[5-7]。目前人參皂苷Rb2的研究較少，對急性肺損傷小鼠免疫功能影響的相關(guān)研究還未見報道。本文用LPS腹腔注射建立新生小鼠急性肺損傷模型，研究人參皂苷Rb2對急性肺損傷新生小鼠免疫功能的影響及其分子機制。

1 材料與方法

1.1材料 人參皂苷RB2標(biāo)準(zhǔn)品購自北京索萊寶科技有限公司；LPS粉末購自Sigma；HE染色試劑盒、TUNEL染色試劑盒均購自碧云天生物公司；Caspase-3、Caspase-9、HMGB1、MIF、NF-κB p-p65單克隆抗體，二抗及顯影液均購自Abcam；小鼠IL-6、IL-1β、TNF-α和IL-10的ELISA檢測試劑盒購自ABclonal。

1.2方法

1.2.1小鼠分組及加藥 將20只新生2 d的小鼠分為四組：對照組、GR2組、LPS組和LPS+GR2組，每組5只。GR2組為健康新生小鼠，腹腔注射GR2 50 mg/kg BW；LPS組：健康小鼠腹腔注射0.6 mg/kg BW的LPS，連續(xù)5 d；LPS+GR2組：模型小鼠腹腔注射人參皂苷 50 mg/kg BW。

1.2.2HE染色 取組織塊，用10%的甲醇固定后，常規(guī)石蠟包埋，5 μm切片。二甲苯脫蠟，乙醇梯度至水。蘇木精染色5 min，自來水沖洗；鹽酸乙醇分化30 s，自來水浸洗15 min，將切片置于伊紅染色液中2 min，85%乙醇、95%乙醇、無水乙醇各脫水1 min，二甲苯透明，中性樹膠封片。顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.3TUNEL染色 二甲苯脫蠟5 min后，換新鮮二甲苯繼續(xù)脫蠟5 min。無水乙醇5 min，90%乙醇2 min，70%乙醇2 min，蒸餾水洗2次，每次1 min。滴加20 μg/ml不含DNA酶的蛋白酶K，室溫下作用15 min。PBS清洗3次，清除蛋白酶K。PBS配制的3%過氧化氫室溫孵育20 min，滅活內(nèi)源過氧化氫酶。滴加檢測液，PBS清洗后加反應(yīng)終止液，室溫孵育10 min。PBS清洗3次，加HRP工作液，室溫孵育30 min。PBS清洗3次，加DAB顯色液，室溫孵育10 min，PBS洗滌3次。乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片觀察。

1.2.4Western blot 取組織塊，用剪刀盡量剪碎后，加含蛋白酶抑制劑的裂解液，冰上裂解30 min。低溫離心機中離心，轉(zhuǎn)移上清。BSA法測總蛋白濃度，加蛋白上樣緩沖液制作蛋白樣品，沸水浴10 min，15 000 r/min離心10 min。12%的變性蛋白凝膠分離，蛋白樣品濕轉(zhuǎn)至PVDF膜。5%脫脂牛奶室溫下孵育1 h；轉(zhuǎn)移至一抗中室溫下孵育2 h，TBST洗3次，每次10 min；再將膜轉(zhuǎn)移至二抗中，室溫下孵育1 h，TBST洗3次，每次5 min；加顯色液，凝膠成像系統(tǒng)中顯影并拍照。

1.2.5ELISA 向酶標(biāo)孔中加300 μl的洗滌液，靜置30 s，洗5次。設(shè)置空白對照，加100 μl樣品液，室溫下震蕩孵育2 h。洗滌液清洗5次，加稀釋好的生物素抗體，每孔100 μl，室溫下震蕩孵育1 h。洗滌液清洗5次，加稀釋好的親和素標(biāo)記的辣根過氧化物酶，室溫下震蕩孵育30 min。洗滌液洗5次，加顯色液，室溫避光孵育10 min。加終止液，輕輕混勻，酶標(biāo)儀下檢測450 nm處波長。

1.3統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS18.0軟件分析實驗結(jié)果，兩組間比較使用t檢驗。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1人參皂苷RB2緩解LPS誘導(dǎo)的新生小鼠急性肺損傷 對照組和GR2組肺泡結(jié)構(gòu)清晰完整，肺泡壁光滑均勻，周圍組織無水腫，炎性細胞少。LPS 組肺泡壁增厚，部分肺泡腔出現(xiàn)萎縮，出現(xiàn)大量炎性細胞浸潤。LPS+GR2組有少量炎性細胞浸潤，部分肺泡結(jié)構(gòu)不清晰。實驗結(jié)果表明，人參皂苷RB2能緩解LPS誘導(dǎo)的新生小鼠急性肺損傷。

2.2人參皂苷RB2抑制LPS誘導(dǎo)的新生小鼠肺組織細胞凋亡 GR2與對照組相比較，呈凋亡陽性的細胞數(shù)目沒有明顯的差異(圖2A)；LPS組與對照組相比，凋亡細胞的比率顯著升高(圖2A，P<0.01)；LPS+GR2組與LPS組相比較，凋亡細胞的比率顯著降低(圖2A，P<0.01)。為進一步研究人參皂苷RB2對自噬相關(guān)蛋白的影響，我們用Western blot檢測Caspase-3和Caspase-9的表達。實驗結(jié)果顯示，GR2組與對照組相比，Caspase-3和Caspase-9的表達沒有明顯的變化(圖2B)；LPS組與對照組相比，Caspase-3和Caspase-9 的表達水平顯著上調(diào)(圖2B，P<0.01)；LPS+GR2組與LPS組相比較，Caspase-3和Caspase-9 的表達水平顯著下調(diào)(圖2B，P<0.01)。實驗結(jié)果表明，人參皂苷RB2抑制LPS誘導(dǎo)的新生小鼠肺組織細胞凋亡。

圖1 HE染色觀察肺組織病理變化Fig.1 Pathological changes of lung tissue was observed by HE staining

圖2 人參皂苷RB2對LPS誘導(dǎo)的新生小鼠肺組織細胞自噬的影響Fig.2 Effect of GR2 on apoptosis of LPS induced acute lung injury in neonatal miceNote: *.P<0.01 compared with the Control group；#.P<0.01 compared with the LPS group.

2.3人參皂苷RB2抑制LPS誘導(dǎo)的新生小鼠肺組織炎癥反應(yīng) GR2組與對照組相比IL-6、IL-1β、TNF-α和IL-10的濃度均沒有顯著的變化(圖3)；LPS組與對照組相比IL-6、IL-1β和TNF-α的濃度顯著上升，IL-10的濃度沒有明顯變化(圖3，P<0.01)。LPS+GR2組與LPS組相比較IL-6、IL-1β和TNF-α的濃度顯著下降，IL-10的濃度沒有明顯變化(圖3，P<0.01)。實驗結(jié)果表明，人參皂苷RB2抑制LPS誘導(dǎo)的新生小鼠肺組織炎癥反應(yīng)。

2.4人參皂苷RB2對炎癥相關(guān)蛋白表達的影響 為進一步研究人參皂苷RB2影響炎癥反應(yīng)的分子機制，我們用Western blot檢測小鼠肺組織中HMGB1和MIF的表達。實驗結(jié)果顯示，GR2組與對照組相比，HMGB1和MIF的表達水平?jīng)]有明顯的差異(圖4)；LPS組與對照組相比，HMGB1和MIF的表達水平顯著上調(diào)(圖4，P<0.01)；LPS+GR2組與LPS組相比較， HMGB1和MIF的表達水平顯著下調(diào)(圖4，P<0.01)。實驗結(jié)果表明，人參皂苷下調(diào)LPS誘導(dǎo)急性肺損傷小鼠肺組織HMGB1和MIF的表達。

圖3 ELISA檢測炎癥因子的水平Fig.3 Concentration of inflammatory factor were detec-ted by ELISANote: *.P<0.01 compared with the Control group；#.P<0.01 compared with the LPS group.

圖4 人參皂苷RB2對炎癥相關(guān)蛋白表達的影響Fig.4 Effect of GR2 on expression of inflammation related proteinsNote: *.P<0.01 compared with the Control group；#.P<0.01 compared with the LPS group.

圖5 人參皂苷RB2對NF-κB p65磷酸化的影響Fig.5 Effect of GR2 on phosphorylation of NF-κB p65Note: *.P<0.01 compared with the Control group；#.P<0.01 compared with the LPS group.

2.5人參皂苷抑制NF-κB p65的活化 實驗結(jié)果顯示，各組p65總的表達量沒有明顯的變化(圖5)。GR2組與對照組相比，p-p65的表達水平?jīng)]有明顯的變化(圖5)；LPS組與對照組相比，p-p65的表達顯著上調(diào)(圖5，P<0.01)；LPS+GR2組與LPS組相比較，p-p65的表達顯著下調(diào)(圖5，P<0.01)。實驗結(jié)果表明，人參皂苷RB2抑制LPS誘導(dǎo)急性肺損傷小鼠肺組織NF-κB p65的活化。

3 討論

急性肺損傷是指由多種病因損傷肺臟的上皮細胞和內(nèi)皮細胞后，使組織功能、形態(tài)異常，通過炎癥介質(zhì)導(dǎo)致肺表面活性物質(zhì)降低、水腫、肺膨脹不全[8]。目前肺損傷缺少準(zhǔn)確的診斷標(biāo)準(zhǔn)和有效的治療措施[9]。尾靜脈注射、腹腔注射和吸入LPS是建立急性肺損傷動物模型的常用方法[10,11]，本文采用來源于大腸埃希菌的LPS腹腔注射建立急性肺損傷新生小鼠模型。HE染色結(jié)果顯示，模型小鼠肺組織出現(xiàn)明顯的炎性細胞浸潤，肺泡壁增厚等特點，表明模型建立成功。大量研究顯示，人參皂苷能緩解各種病因誘導(dǎo)的肺損傷。如Wang等[12]研究發(fā)現(xiàn)，人參皂苷Rb1對缺血再灌注誘導(dǎo)的大鼠肺損傷具有保護作用。Yuan等[13]研究顯示，人參皂苷Rb1能緩解LPS誘導(dǎo)的大鼠急性肺損傷。本文研究結(jié)果與前人研究一致，實驗結(jié)果表明，人參皂苷Rb2能緩解LPS誘導(dǎo)的新生小鼠急性肺損傷。

細胞凋亡在機體生長、發(fā)育和衰老過程中發(fā)揮著重要的作用。大量研究顯示，人參皂苷Rb2具有抑制細胞凋亡的作用。如Park等[14]研究發(fā)現(xiàn)，人參皂苷Rb2通過下調(diào)脂類過氧化物和環(huán)氧合酶的表達，抑制高糖誘導(dǎo)的ARPE細胞凋亡。Gao等[15]研究發(fā)現(xiàn)，人參皂苷Rb2調(diào)控Ras-ERK1/2信號通路，抑制地塞米松誘導(dǎo)的骨髓間質(zhì)干細胞凋亡。本文研究結(jié)果顯示，人參皂苷Rb2加藥處理后的模型小鼠肺組織細胞凋亡比率明顯降低。Caspase家族是細胞凋亡過程中發(fā)揮重要作用的一組半胱氨酸蛋白酶[16]。Caspase-9參與細胞凋亡的起始，能激活下游Caspase蛋白。Caspase-3被認為是執(zhí)行細胞凋亡的關(guān)鍵蛋白，被激活后通過酶解凋亡抑制蛋白、酶解細胞外基質(zhì)和骨架蛋白、酶解DNA轉(zhuǎn)錄復(fù)制及修復(fù)相關(guān)蛋白，使細胞固縮、與周圍細胞分離、染色質(zhì)聚集等，導(dǎo)致細胞不可逆轉(zhuǎn)的發(fā)生凋亡[17]。本文研究結(jié)果顯示，模型小鼠經(jīng)人參皂苷Rb2處理后，Caspase-9和Caspase-3的表達顯著下調(diào)，表明人參皂苷Rb2可抑制LPS誘導(dǎo)的新生小鼠急性肺損傷細胞凋亡。

急性肺損傷的重要特點是促炎因子的過度表達和抗炎因子相對不足。急性肺損傷治療的根本是炎癥介質(zhì)與抗炎介質(zhì)的平衡[9]。LPS進入機體后，促進巨噬細胞分泌促炎因子IL-6、IL-1β和TNF-α等，促炎因子有放大炎癥反應(yīng)的作用，常引起全身性的炎癥反應(yīng)，嚴重損害器官和機體內(nèi)穩(wěn)態(tài)[18]。IL-10是重要的炎癥抑制因子，廣泛抑制IL-6、IL-1β、TNF-α和IL-8等促炎因子。本文研究發(fā)現(xiàn), LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷大鼠肺組織中 IL-6、IL-1β和TNF-α的含量顯著上調(diào),而IL-10的含量沒有明顯的變化。此外，Wu等[19]研究發(fā)現(xiàn)，人參皂苷可通過抑制NF-κB下調(diào)TNF-α和一氧化氮的表達，進而緩解LPS誘導(dǎo)的N9小膠質(zhì)細胞炎癥反應(yīng)。Kim等[20]研究發(fā)現(xiàn),人參皂苷Rb2、Rg1能抑制外界刺激下小鼠IL-6 的表達。實驗結(jié)果表明,人參皂苷Rb2能下調(diào)LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷新生小鼠肺組織中促炎因子的高表達。

HMGB1是一種高度保守的核蛋白，是LPS致死效應(yīng)的晚期炎癥介質(zhì)[21]。細胞受損后，HMGB1釋放到細胞外，促進IL-6、IL-1β、TNF-α和IL-8等促炎因子的表達，其中并不包括IL-10[22]。同時HMGB1具有激活NF-κB的作用，促進炎癥發(fā)生[23]。MIF是多功能效應(yīng)蛋白分子，參與多種炎癥疾病的免疫調(diào)節(jié)，在炎癥反應(yīng)中高表達[24]。本文研究結(jié)果顯示，人參皂苷Rb2處理模型小鼠后，HMGB1和MIF的表達顯著下調(diào)。實驗結(jié)果表明，人參皂苷Rb2能抑制LPS誘導(dǎo)急性肺損傷新生小鼠炎癥反應(yīng)。

脂多糖是位于革蘭氏陰性菌細胞壁最外層的較厚的脂質(zhì)多糖復(fù)合物，由類脂A、核心多糖和O-抗原組成，其中脂質(zhì)A是內(nèi)毒素活性中心[25]。當(dāng) LPS進入機體后,首先與LPS結(jié)合蛋白結(jié)合,并被運送到免疫細胞膜表面,促進LPS與膜表面蛋白CD14相結(jié)合[26]。隨后CD14將LPS轉(zhuǎn)運到Toll樣受體4上面，促發(fā)一連串生物反應(yīng)，最終活化轉(zhuǎn)錄因子NF-κB[27,28]。NF-κB入核，促進一系列的炎癥因子的表達，如IL-6、IL-1β、TNF-α等，另外NF-κB的激活能促進細胞凋亡[29]。本研究結(jié)果顯示人參皂苷Rb2能顯著抑制LPS誘導(dǎo)的NF-κB p65磷酸化水平升高。

綜上所述，人參皂苷Rb2通過抑制NF-κB的激活，抑制LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷新生小鼠肺組織細胞凋亡和炎癥反應(yīng)，調(diào)節(jié)模型小鼠的免疫功能。本研究下一步將探究人參皂苷對LPS作用下體外培養(yǎng)細胞的凋亡和氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響。