岳運霞 劉文彬 王松琪 閆海山 姬穎華

(鶴壁市人民醫(yī)院放療科,鶴壁458030)

黑色素瘤是目前惡性程度較高的一類皮膚腫瘤，常稱惡性黑色素瘤(Malignant melanoma，MM)，它在全球范圍內(nèi)發(fā)病率一直較高，類型多見于皮膚腫瘤，也見于軟腦膜和脈絡(luò)膜，大約占所有皮膚腫瘤的12%，但是黑色素瘤確診后的死亡率高達85%，且近年來發(fā)病率有不斷上升的趨勢[1,2]。黑素瘤患者的預(yù)后較差的原因主要是由于早期診斷困難，晚期治療效果不佳，對多種化療藥物反應(yīng)不佳[3]。黑色素瘤的主要治療方式包括手術(shù)和放化療，但是手術(shù)針對局部黑色素瘤的治療效果較好，而多部位黑色素瘤的治療主要依靠放療[4,5]。目前隨著研究不斷進展，關(guān)于黑色素瘤的生物治療，免疫治療和分子治療不斷發(fā)展成熟，但是探討黑色素瘤細胞的放療敏感性仍然是目前研究的熱門方向。

芍藥苷(Paeoniflorin，PF)是中藥芍藥的主要有效成分，是一類單萜類糖苷化合物[6]。近年來研究發(fā)現(xiàn)芍藥苷具有一定的抗自由基損傷和抗神經(jīng)毒性等活性，體內(nèi)實驗表明其有擴張血管、改善微循環(huán)、抗氧化等多種生物學(xué)效應(yīng)，并且對身體的毒副作用小[7]。

在此研究基礎(chǔ)上，本實驗檢測中藥芍藥苷對黑色素瘤細胞中MSH2和MLH1表達水平的調(diào)控，以及適宜濃度的芍藥苷對黑色素瘤細胞放療敏感性的影響，為黑色素瘤的放射治療方案提供新的改良策略以改善黑色素瘤患者的治療效果。

1 材料與方法

1.1細胞株和實驗試劑 人黑色素瘤細胞株M14由復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院獲得。RPIM1640培養(yǎng)基購于美國賽默飛公司，胎牛血清購于杭州四季青生物工程材料有限公司。MLH1和MH2抗體均購自美國abcam公司(ab92312，ab52266)。脂質(zhì)體Lipofectamine 2000、miR-214-mimic、miR-NC購自(Gnenpharma Co,Shanghai,China)，CCK-8試劑購自美國Sigma公司，Trizol購自Ambion(Ambion Inc,Austin,TX,USA)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(FSQ-101)購自日本TOYOBO公司(TOYOBO,FSQ-101,Japan)，PCR試劑盒購于美國Sigma公司(KapaBiosystems Inc,Boston,US)。

1.2方法

1.2.1實驗分組 本實驗分為兩組，陰性對照組(NC組)和實驗組(芍藥苷組)。陰性對照組使用PBS處理，實驗組使用250 μg/ml濃度的芍藥苷進行處理細胞。

1.2.2MTT細胞增殖測定 細胞增殖實驗檢測不同濃度的芍藥苷對黑色素瘤細胞活力的抑制作用。通過MTT測定。M14細胞以初始密度為3×104個細胞/孔接種到96孔板中。 24 h后，用不同濃度的(25、50、100、250、500 μg/ml)芍藥苷處理細胞，24 h或48 h后，孵育4 h，然后離心。除去上清液，然后加入二甲基亞砜(DMSO)(150 μl)。在37℃測量每個孔的吸光度(Abs)。使用CompuSyn軟件計算組合指數(shù)(CI)計算MTT值。

1.2.3Western blot檢測MLH1和MSH2蛋白的表達 M14-RR細胞使用合適濃度的芍藥苷處理48 h后提取總蛋白，用BCA蛋白測定試劑盒測定蛋白濃度，上樣60 μg總蛋白，在4%～12% 的SDS聚丙烯酰胺凝膠中電泳，用濕轉(zhuǎn)的方式將蛋白轉(zhuǎn)到膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，一抗(MLH1 1∶1 000，MSH2 1∶2 000)4℃搖床孵育過夜，使用TBST洗膜3次，每次10 min，二抗室溫孵育2 h，使用TBST洗膜3次，每次10 min，使用超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒顯影，使用GAPDH作為內(nèi)參蛋白。

1.2.4γ-H2AX 免疫熒光染色實驗 芍藥苷處理過的M14-RR細胞，鋪板于直徑為35 mm的細胞爬片的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)24 h后接受10 Gy的放射線照射，照射后均再培養(yǎng)2 h，使用預(yù)冷的4%的多聚甲醛在4℃冰箱中固定20 min，使用0.2%的TritonX-100破膜20 min，使用2%BSA 室溫封閉1 h，加入50 μl的2%BSA稀釋的抗γ-H2AX小鼠單克隆抗體后，放置于4℃冰箱過夜，加入50 μl羊抗鼠FITC二抗，室溫孵育1 h。載玻片上加30 μl含DAPI的染色液的抗熒光淬滅封片液，室溫避光30 min。然后通過熒光正置顯微鏡下觀測每個細胞核內(nèi)DNA雙鏈斷裂形成的熒光焦點數(shù)量，計算每組細胞中的平均熒光焦點數(shù)進行統(tǒng)計分析。實驗重復(fù)3次。

1.2.5流式細胞法檢測細胞凋亡及周期分布 將黑色素瘤細胞接種于6 孔板內(nèi)，2 ml/孔，實驗分為對照組和芍藥苷組，每組均設(shè)3個復(fù)孔，藥物作用48 h后消化細胞，裝于1.5 ml EP管內(nèi)，在4℃以2 000 r/min 轉(zhuǎn)速離心15 min，棄去上清液，使用PBS輕柔混勻后等速離心，重復(fù)洗滌3次。檢測細胞周期時予每管加細胞固定液(含70%預(yù)冷乙醇，5%FBS，25%PBS)200 μl固定1 h后等速離心，棄去上清液，繼用PBS 洗滌2次，方法同前，棄上清，避光條件下，每管加100 μl PI，靜置30 min，加300 μl PBS混勻，上流式細胞儀檢測。檢測細胞凋亡則用400 μl Bidding Buffer 懸浮細胞，加入5 μl Annexin V-FITC輕輕混勻后于2～8℃避光條件下孵育15 min，后加入10 μl PI同等條件下孵育5 min，1 h 內(nèi)上流式細胞儀檢測。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理 所有的統(tǒng)計分析均采用SPSS 16.0軟件包(SPSS，Chicago，IL)進行。組間比較采用方差分析；應(yīng)用GraphPad Prism5軟件進行統(tǒng)計圖形制作。P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1人黑色素瘤M14放療抵抗細胞株的建立 體外培養(yǎng)人黑色素瘤細胞株M14，待細胞融合度為60%～70%，且細胞處于對數(shù)生長期時分別給予2、4、6、8、10 Gy的X-ray照射2次，照射后繼續(xù)于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，密切觀察細胞狀態(tài)。待細胞狀態(tài)恢復(fù)良好后，再進行下一次的照射，重復(fù)以上步驟，并逐漸加大每次照射的劑量，直到建立具有穩(wěn)定耐受放療能力的黑色素瘤細胞株M14，此時我們命名篩選出的細胞為M14-RR(M14 radiation resistance)，后續(xù)實驗使用5～10代之間的細胞。

2.2Western blot檢測M14和M14-RR細胞中蛋白的表達水平 Western blot檢測M14和M14-RR兩組細胞中MLH1和MSH2蛋白的表達情況。如圖1所示，在M14-RR組細胞中MLH1和MSH2的表達水平比M14組細胞的明顯升高[(88.02±9.21) vs (37.15±5.62)，P<0.05；(73.25±5.81) vs (28.61±3.07)，P<0.05]，兩組蛋白差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果表明在放療抵抗性細胞株中，MLH1和MSH2蛋白表達水平相應(yīng)上調(diào)，所以，MLH1和MSH2的表達可能對M14黑色素瘤細胞株的放療敏感性有一定的抵抗作用。

2.3不同濃度的芍藥苷對黑色素瘤細胞抑制情況 通過MTT檢測不同濃度的芍藥苷對黑色素瘤M14細胞的抑制情況，確定芍藥苷最適的藥物作用濃度。實驗結(jié)果顯示：M14細胞生長呈不同程度的抑制，抑制率隨芍藥苷濃度的增加而增高，并在一定范圍內(nèi)呈濃度依賴性(表1)，芍藥苷藥物對M14細胞最佳抑制率為(63.61±3.65)%，故以250 μg/ml濃度的芍藥苷藥物作為最適濃度。

2.4Western blot檢測芍藥苷對黑色素瘤細胞中MLH1和MSH2蛋白水平的影響 Western blot檢測芍藥苷對黑色素瘤細胞中MLH1和MSH2蛋白的表達情況。如圖2所示，在芍藥苷組黑色素瘤細胞中MLH1和MSH2的表達水平比對照組細胞的明顯降低[(38.26±3.16)vs(85.31±5.16)，P<0.05；(29.62±3.57)vs(74.15±6.08)，P<0.05]，兩組蛋白差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果表明芍藥苷處理過后，黑色素瘤細胞MLH1和MSH2蛋白表達水平相應(yīng)下調(diào)，芍藥苷在一定程度上可以增強黑色素瘤細胞的放療敏感性。

圖1 Western blot檢測MLH1和MSH2蛋白在黑色素瘤細胞株中的表達情況Fig.1 Western blot detection of MLH1 and MSH2 protein expression in melanoma cell linesNote: *.P<0.05 vs the M14-RR group.

2.5芍藥苷處理后黑色素瘤細胞對放療敏感性的變化 為進一步觀察在電離輻射處理后細胞變化，通過免疫熒光檢測γ-H2AX聚集點不同處理的M14-RR細胞株中的表達水平。實驗結(jié)果顯示，γ-H2AX在對照組中的表達較弱，在芍藥苷組中的表達明顯增強，電離輻射明顯促進了γ-H2AX聚集點的形成，在芍藥苷處理過后，γ-H2AX聚集點的表達明顯增多，DNA損傷較多(圖3)。

2.6放療強度處理后不同組黑色素瘤細胞凋亡率的變化 通過CCK-8細胞實驗檢測不同組的黑色素瘤細胞在接受放療前后細胞活力的情況(表2)。結(jié)果顯示，未接受放療時，相比對照組，芍藥苷組細胞活力變化輕度降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。在接受10 Gy放射線之后，芍藥苷組的細胞活力相比NC組降低升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。表明芍藥苷處理后可以有效增加細胞凋亡，對放射損傷有一定的增敏性。

表1 不同濃度的芍藥苷對黑色素瘤細胞抑制率比較

Tab.1 Comparison of different concentrations of paeoniflorin on inhibition of melanoma cells

Paeoniflorin mass concentration(μg/ml) Cell inhibition rate(%)2511.62±1.385019.15±2.8610034.07±4.8525063.61±3.6550038.69±2.18

圖2 Western blot檢測芍藥苷對黑色素瘤細胞MLH1和MSH2蛋白的表達Fig.2 Western blot detection of paeoniflorin on melanoma cells MLH1 and MSH2 protein expressionNote: *.P<0.05 vs the control group.

表3 放射線照射對各組黑色素瘤細胞周期的影響

Tab.3 Effect of radiation on cell cycle of melanoma in each group

GroupsG2/M phaseBefore radiationAfter radiationG1/G0 phaseBefore radiationAfter radiationS phaseBefore radiationAfter radiationControl group3.94±2.508.62±3.5683.25±5.8365.24±2.2613.74±2.7625.61±3.26Paeoniflorin group6.39±1.1017.62±2.5077.62±8.1548.36±1.9616.52±3.0537.61±5.56P value0.0290.0190.043

圖3 免疫熒光技術(shù)檢測γ-H2AX聚焦點在電離輻射之后的變化情況Fig.3 Immunofluorescence technique to detect changes in gamma-H2AX focal point after ionizing radiation

表2 放射線照射對各組黑色素瘤細胞凋亡率的影響

Tab.2 Effect of radiation exposure on apoptotic rate of melanoma cells in each group

RadiationdoseSampleControlgroupPaeonifloringroupP value0 Gy51.000±0.0001.256±0.0320.05810 Gy50.256±0.0082.862±0.3240.008

2.7放療強度處理后不同組黑色素瘤細胞周期的變化 通過流式細胞術(shù)檢測放射線照射前后的細胞周期情況(表3)。對照組和芍藥苷組黑色素瘤細胞照射后，G2/M期和S期細胞均比照射前增加；而G1/G0期黑色素瘤細胞則比照射前減少；相比對照組，芍藥苷組細胞的差異更明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；表明芍藥苷處理過后，在一定程度上可以提高黑色素瘤細胞在G1、S期的分布率，干擾細胞增殖的進程。

3 討論

黑色素瘤是一類皮膚惡性腫瘤，其主要特征是對放療和化療效果較差，預(yù)后效果較差[8]，雖然目前放射治療被廣泛應(yīng)用于黑色素瘤患者的治療方案中，但是放射治療的有效性取決于許多因素，包括臨床患者的腫瘤類型，腫瘤細胞內(nèi)的氧化水平和體內(nèi)微環(huán)境[9]。最近有研究顯示，很多體內(nèi)生物因子影響癌細胞的放療敏感性，如細胞凋亡因子，細胞增殖因子[10]。Ma等[11]學(xué)者研究指出，c-myc是一類廣泛的致癌基因，在腫瘤細胞的增殖、分化和凋亡過程中扮演調(diào)控角色。特別是c-myc癌蛋白對人黑色素瘤的藥物及放療敏感性有不同的干擾作用，包括與各類化療藥物的聯(lián)合應(yīng)用都有一定的調(diào)控影響[12]。

放射治療是黑色素瘤最常用的治療方法，常規(guī)放射治療理論是通過腫瘤細胞重新氧合、細胞周期重新分布、照射后期細胞再增殖貫穿于放射治療的全過程，再放射治療的過程中部分腫瘤細胞具備一定的放療抵抗性，繼續(xù)進一步克隆增殖后產(chǎn)生放療耐受細胞[13,14]。在本研究中，我們研究了c-myc中MLH1和MSH2蛋白的表達對人惡性黑色素瘤細胞放療敏感性的研究。先構(gòu)建黑色素瘤M14的放療敏感細胞株，然后用芍藥苷處理，研究芍藥苷對黑色素瘤M14放療敏感性的影響。研究結(jié)果顯示了MLH1和MSH2蛋白水平降低使黑色素瘤細胞對放射治療的敏感性更強，芍藥苷處理后可以有效增強黑色素瘤細胞對放療的敏感性。

最近有關(guān)于c-myc蛋白的研究表明，增加c-myc基因表達后可以干擾黑色素瘤細胞的轉(zhuǎn)移潛能并影響免疫缺陷小鼠腫瘤轉(zhuǎn)移[15]。此外，Shain等[16]學(xué)者研究顯示c-myc的表達與黑色素瘤患者的臨床預(yù)后有相關(guān)關(guān)系。這些預(yù)后研究表明c-myc在黑色素瘤發(fā)病中起關(guān)鍵作用。而c-myc蛋白與錯配修復(fù)蛋白MLH1和MSH2之間有直接調(diào)控關(guān)系[17]。有研究指出MSH2和MLH1在糾正DNA錯配中起核心作用，可以干擾腫瘤細胞的DNA復(fù)制過程，對基因組的完整性進行保護[18]。此外，MSH2和MLH1的表達失活也參與了遺傳性非息肉性結(jié)腸腫瘤的發(fā)生過程[19]。曾有研究支持c-myc蛋白可以提高人黑色素瘤細胞的應(yīng)急敏感性，包括放射治療的敏感性，為發(fā)展新型的治療方式提供有效干預(yù)措施[20]。

Harkness等[21]學(xué)者報道指出，MLH1和MSH2蛋白的表達上調(diào)可以影響乳腺MCF-7細胞對放療療效的敏感性。根據(jù)之前的研究結(jié)果，MLH1和MSH2蛋白表達可以影響細胞周期的循環(huán)，在低輻射劑量的射線刺激下，G2/S細胞周期相對縮短，阻礙細胞周期的進展，且此過程不可被逆轉(zhuǎn)，加速細胞的凋亡[22]。所以調(diào)控MLH1和MSH2蛋白的表達在一定程度上可以干擾細胞的有絲分裂和細胞周期進展。本實驗利用中藥提取物芍藥苷刺激MLH1和MSH2蛋白在細胞G2期激活DNA損傷誘導(dǎo)的細胞凋亡，進而影響黑色素瘤細胞對放射治療的敏感性。之前關(guān)于大鼠骨髓細胞的其他研究系顯示MLH1和MSH2表達本身沒有調(diào)控作用，但是在接受放射治療之后顯示，MLH1和MSH2表達水平的降低可以增強骨髓瘤細胞對順鉑藥物治療的敏感性[23]。

本實驗首先構(gòu)建了黑色素瘤細胞的放療抗性細胞株M14-RR，然后檢測M14-RR細胞株中的MLH1和MSH2蛋白的表達水平，然后檢測中藥提取物芍藥苷對黑色素瘤細胞的抑制情況及對MLH1和MSH2蛋白表達的影響。實驗研究分析顯示，使用適宜濃度的芍藥苷處理黑色素瘤細胞后，γ-H2AX的聚集點顯著增多，表明DNA損傷相對增多，芍藥苷處理過后可以一定程度上產(chǎn)生放療增敏作用，增加黑色素瘤細胞株的放療敏感性。本實驗又通過細胞凋亡實驗檢測芍藥苷對黑色素瘤細胞的凋亡情況及細胞周期的影響，結(jié)果顯示，芍藥苷處理過后，在一定程度上可以提高黑色素瘤細胞在G1、S期的分布率，干擾細胞增殖的進程。而目前廣泛的研究證實，中藥提取物可以通過電離輻射和部分藥物誘導(dǎo)激活一系列的信號分子和通路，諸如細胞周期蛋白、DNA損傷與修復(fù)、細胞凋亡、細胞代謝等等，可以導(dǎo)致腫瘤細胞黏附性及腫瘤血管生成減少，一定程度上抑制腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移，提高腫瘤細胞的放療敏感性[24,25]。

綜上所述，本研究通過研究適宜濃度的芍藥苷對黑色素瘤細胞中MLH1和MSH2蛋白表達水平的影響，探討芍藥苷對黑色素瘤細胞放療敏感性的調(diào)控情況，通過調(diào)控MLH1和MSH2蛋白的表達使其放療后發(fā)生細胞周期的阻滯抑制細胞的增殖，具有一定的輻射增敏作用，為黑色素瘤的放療效果預(yù)測或放療增敏提供了新的思路。