劉金娟 楊宏發(fā) 李勇堅(jiān) 陳艷明

(南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院皮膚性病科,衡陽421001)

自然老化和光老化是皮膚發(fā)生老化的原因，當(dāng)人的皮膚長期暴露在陽光下就會(huì)造成皮膚損傷導(dǎo)致光照老化。光照老化是一個(gè)損傷積累的過程，更容易導(dǎo)致癌前病變，而來自日光的紫外線照射是引起皮膚老化的主要自然因素，因此光老化是日光損傷造成的皮膚老化[1-3]。

紫外線波長一般為200～400 nm，根據(jù)波長的不同，可分為：長波紫外線(UVA)，中波紫外線(UVB)和短波紫外線(UVC)，波長范圍分別為315～400 nm、280～315 nm、280～200 nm[4]。不同的紫外線對(duì)人體皮膚的滲透程度不同，UVC對(duì)生物危害最大，不過它能被臭氧層全部吸收，不對(duì)人體產(chǎn)生損害；UVB能被皮膚表皮吸收極大部分，對(duì)人體皮膚有一定的生理作用，但這種生理作用不能滲入皮膚內(nèi)部；而UVA可達(dá)到真皮深處并可長期積累，對(duì)人體皮膚和衣物產(chǎn)生穿透作用，且比中波紫外線強(qiáng)，能夠?qū)е缕つw損害和嚴(yán)重老化[5-7]。因此，經(jīng)紫外線照射后，人皮膚成纖維細(xì)胞(Human skin fibroblasts,HSF)的生長、分化和功能等方面會(huì)發(fā)生明顯的改變,實(shí)驗(yàn)以HSF為研究對(duì)象，采用UVA誘導(dǎo)HSF光老化，不同強(qiáng)度紫外線干預(yù)后檢測細(xì)胞c-fos、c-Jun、Sirt1基因表達(dá)，觀察紫外線對(duì)HSF光老化的影響，探討其作用機(jī)制，本研究有利于光損傷類疾病的臨床防治。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1試劑與儀器 DMEM培養(yǎng)基、細(xì)胞培養(yǎng)用青霉素、細(xì)胞培養(yǎng)用鏈霉素、胰酶(Gibco BRL公司)； 胎牛血清(杭州四季青公司)；二甲基亞砜DMSO(上海浩洋生物科技有限公司)；四甲基偶氮哇鹽MTT(美國Sigma公司)；超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione peroxidase activity,GSH-Px)ELISA檢測試劑盒，均購自南京建成生物工程研究所；金屬基質(zhì)蛋白酶-1(Matrix metalloproteinase,MMP-1)ELISA試劑盒購自北京博奧森科技有限公司;兔抗人c-fos蛋白、兔抗人c-jun蛋白多克隆抗體(Santa公司)；DNA ladder Marker、DAB顯色試劑盒(武漢博士德)；細(xì)胞衰老β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)染色試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所)；TRIzol(Invitrogen公司)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Fermentas公司)；DEPC(北京國科昌盛生物工程公司)；引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成；酶標(biāo)儀(美國BioTek ELX800)；UVA型紫外輻照計(jì)(北京師范大學(xué)光電儀器)；倒置顯微鏡(日本Olympus公司)

1.1.2皮膚取材 選用的皮膚為兒童包皮環(huán)切術(shù)后的包皮皮膚組織，經(jīng)麻醉后，所切除的用于研究的包皮組織部分不能再注入任何其他藥物，包皮組織從切除至轉(zhuǎn)移到實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行細(xì)胞組織塊培養(yǎng)的整個(gè)離體時(shí)間不超過1 h，此用于研究的標(biāo)本共2塊，由本醫(yī)院泌尿外科提供。用于本研究的標(biāo)本已按程序申報(bào)并通過本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，在收集標(biāo)本時(shí)已告知患者及家屬此皮膚標(biāo)本的研究用途,獲得患者及家屬同意并已簽知情同意書。

1.2方法

1.2.1培養(yǎng)原代細(xì)胞HSF 將標(biāo)本修剪為1 mm3大小的組織塊，然后將組織塊均勻平鋪于25 cm2細(xì)胞瓶內(nèi)，倒置培養(yǎng)3 h后翻瓶，加入少量DMEM培養(yǎng)液(含10%FBS、100 U/ml青霉素和100 U/ml鏈霉素)，放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱，每3 d換一次液，每天置倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況，用第5代HSF做實(shí)驗(yàn)對(duì)象。

1.2.2原代細(xì)胞生長曲線 第5代HSF消化后，將細(xì)胞接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，細(xì)胞密度為1×104ml-1，每孔加入1 ml細(xì)胞懸液，每隔24 h，消化3孔細(xì)胞并進(jìn)行計(jì)數(shù)，取3孔平均值，記錄，連續(xù)計(jì)數(shù)7 d后繪制生長曲線。

1.2.3不同UVA強(qiáng)度作用相同時(shí)間、中等UVA強(qiáng)度作用不同時(shí)間對(duì)HSF的影響 取第5代HSF，將細(xì)胞密度調(diào)整為1×104ml-1，接種于4塊96孔板，每孔加入1 ml細(xì)胞懸液，在5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)4 h后每孔加0.5 ml培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，采用不同劑量的UVA(5 J/cm2、10 J/cm2、20 J/cm2)實(shí)驗(yàn)組均照射48 h HSF，不照射的96孔板作為對(duì)照組，用MTT法檢測各孔490 nm吸光值，檢測不同劑量的UVA干擾后細(xì)胞的增殖情況，同法用10 J/cm2UVA照射HSF 0、24、48、72、96 h后，用MTT法檢測各孔490 nm 吸光值，與對(duì)照組比較，測定細(xì)胞的增殖情況。

1.2.4細(xì)胞衰老SA-β-Gal染色 第5代HSF經(jīng)10 J/cm2UVA照射72 h后，吸除6孔板中細(xì)胞培養(yǎng)液，用PBS洗滌，加入1 ml SA-β-Gal染色固定液，室溫固定15 min；吸除細(xì)胞固定液，用PBS洗滌，吸除PBS，每孔加1 ml染色工作液，用保鮮膜封住防蒸發(fā)，37℃孵育過夜，倒置顯微鏡下觀察染色結(jié)果，衰老細(xì)胞顯示深藍(lán)著染。

1.2.5c-fos、c-jun免疫組化法檢測結(jié)果 將第五代不同強(qiáng)度UVA照射后的HSF成1×104ml-1密度接種于96孔培養(yǎng)板中,每孔200 μl，置37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜，用 PBS沖洗，4%多聚甲醛液固定，漂洗，然后3%H2O2避光室溫孵育，漂洗，加入5%羊血清37℃封閉，漂洗后加入2%羊血清稀釋的抗體，4℃反應(yīng)過夜。第二天取出，漂洗，滴加一抗,覆蓋所有細(xì)胞，37℃孵育30 min，漂洗，滴加二抗，用 DAB顯色，鏡下觀察，并拍攝照片。

1.2.6RT-PCR法測定不同強(qiáng)度UVA照射72 h的c-fos、c-jun、Sirt1的 mRNA表達(dá)水平 取第5代HSF傳入24孔板中，按細(xì)胞生長曲線，細(xì)胞正常培養(yǎng)3 d后，用不同強(qiáng)度UVA照射72 h后，應(yīng)用Trizol提取照射第3天后各組細(xì)胞總RNA，RT-PCR檢測c-fos、c-jun、Sirt1的表達(dá)變化。引物按下列序列設(shè)計(jì)：c-fos引物：上游5′-CTTCAGGTCCGACTTCC-3′，下游：5′-CCAGCGCTCATC-CTGATC-3′，長度132 bp；c-jun引物：上游5′-CCAAGAACTCGGACCTCC-3′，下游5′-GAAGCCCTCCT-GCTCATC-3′，長度167 bp；Sirt1引物：上游5′-TCCATACCTGGAATCACT-3′，下游5′-CAGGCCATCTTGATCACC-3′，長度365 bp；GAPDH引物：上游5′-GTTACCGATCTTCGAACTGC-3′，下游：5′-ACGGTCGATCTTGACCGTAT-3′，長度為420 bp。實(shí)驗(yàn)操作按產(chǎn)品說明書進(jìn)行。

1.2.7Western blot 檢測c-fos、c-jun、Sirt1蛋白表達(dá) 取不同強(qiáng)度UVA干預(yù)3 d后的各組細(xì)胞，倒掉培養(yǎng)液，加PBS洗滌細(xì)胞3次，把培養(yǎng)板置于冰上，每孔細(xì)胞加含PMSF的裂解液。裂解完全后，離心，提取總蛋白，檢測蛋白濃度，根據(jù)所測蛋白分子量，配12%分離膠和5%濃縮膠，按30 μg/孔蛋白量上樣，進(jìn)行電泳，濃縮膠電壓60 V，至分離膠電壓調(diào)至100 V,至溴酚藍(lán)剛跑出終止電泳，然后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，將膜從封閉液中分別轉(zhuǎn)入一抗中，4℃孵育過夜，洗膜，加入二抗，室溫孵育1 h，再次用TBS漂洗，1 h后顯影，晾干，觀察結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1原代HSF培養(yǎng) 組織塊培養(yǎng)3 d換一次液，待培養(yǎng)第6天，發(fā)現(xiàn)在瓶底有細(xì)胞游離出來，并在組織塊周圍形成放射狀遷出，換液，繼續(xù)培養(yǎng)7 d后，顯微鏡下發(fā)現(xiàn)細(xì)胞達(dá)融合狀態(tài),細(xì)胞為長梭形，單層，此時(shí)可以進(jìn)行消化傳代，結(jié)果見圖1。

2.2HSF生長曲線繪制 在一段時(shí)間內(nèi)，HSF細(xì)胞數(shù)量隨著培養(yǎng)時(shí)間而增加，與時(shí)間成正相關(guān)。通過繪制生長曲線發(fā)現(xiàn)細(xì)胞生長有三個(gè)時(shí)期，其中0～3 d 為潛伏期，3～6 d為對(duì)數(shù)生長期，6～7 d為平臺(tái)期，結(jié)果見圖2。

2.3不同強(qiáng)度UVA照射HSF后的細(xì)胞增殖情況 從MTT檢測結(jié)果可見，實(shí)驗(yàn)組不同強(qiáng)度的UVA照射HSF后，細(xì)胞的增殖均受抑制，且隨著UVA強(qiáng)度的增加，增殖能力減弱得更明顯，中、高強(qiáng)度的UVA實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較細(xì)胞的增殖差異均具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，結(jié)果見表1及圖3。而用中等強(qiáng)度10 J/cm2的UVA對(duì)HSF照射不同時(shí)間，可以看到隨著照射時(shí)間的延長，細(xì)胞增殖能力越來越弱，當(dāng)照射時(shí)間長于48 h后，細(xì)胞增殖減弱明顯，特別是照射72 h后對(duì)細(xì)胞增殖的影響更為明顯，這些改變與對(duì)照組比較差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，結(jié)果詳見表2和圖4。研究表明HSF細(xì)胞增殖能力與UVA強(qiáng)度和照射時(shí)間密切相關(guān)。

圖1 原代HSF(×100)Fig.1 Primary HSF(×100)

2.4SA-β-Gal染色鑒定細(xì)胞衰老 10 J/cm2UVA照射HSF 72 h后，經(jīng)SA-β-Gal染色，置倒置顯微鏡下觀察，大部分細(xì)胞質(zhì)被染成藍(lán)色，而對(duì)照組SA-β-Gal染色為陰性。說明經(jīng)UVA照射后，HSF普遍被誘導(dǎo)成衰老狀態(tài)。結(jié)果見圖5和圖6。

圖2 第5代HSF的生長曲線 Fig.2 Growth curve of 5th generation HSF

表1 不同強(qiáng)度UVA照射后HSF的OD值

Tab.1 OD value of HSF after UVA irradiation of different intensities

GroupsnOD valueControl320.599±0.025UVA 5 J/cm2320.531±0.025UVA 10 J/cm2320.496±0.0281)UVA 20 J/cm2320.240±0.0191)

Note：Compared with the control group,1)P<0.05.

圖3 不同強(qiáng)度UVA照射對(duì)HSF增殖的影響Fig.3 Effect of HSF proliferation after UVA exposure with different intensities

2.5ELISA檢測不同強(qiáng)度UVA照射72 h后HSF中SOD、GSH-Px活性及MMP-1含量 實(shí)驗(yàn)證明，不同強(qiáng)度UVA照射能明顯降低細(xì)胞內(nèi)SOD、GSH-Px活性，顯著提高M(jìn)MP-1的含量，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，結(jié)果見表3。

2.6免疫組化法鑒定不同強(qiáng)度UVA照射72 h后HSF中c-fos、c-jun的表達(dá) 隨著UVA照射強(qiáng)度的增加，細(xì)胞經(jīng)免疫組化染色c-fos、c-jun蛋白表達(dá)均呈陽性，結(jié)果見圖7和圖8。

2.7HSF經(jīng)不同強(qiáng)度UVA照射72 h后c-fos、c-jun、Sirt1的mRNA表達(dá)水平 HSF經(jīng)不同強(qiáng)度UVA照射后，細(xì)胞呈衰老狀態(tài)，對(duì)照組c-fos和c-jun提取的mRNA水平均較低且兩者的mRNA水平值接近，經(jīng)不同UVA照射后，c-fos mRNA表達(dá)增加速度高于c-jun mRNA表達(dá)增加速度，在光老化中c-fos的敏感度高于c-jun，結(jié)果表明，隨著UVA照射劑量的增加，成纖維細(xì)胞損傷加劇，c-fos蛋白被激活。在紫外線的刺激下，抗衰老因子Sirt1的表達(dá)也明顯增加，與對(duì)照組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，結(jié)果見表4。

表2 10 J/cm2UVA照射HSF不同時(shí)間的OD值

Tab.2 OD values of HSF exposure to 10 J/cm2UVA at different times

TimenOD value0 h320.599±0.02524 h320.520±0.02448 h320.497±0.0241)72 h320.245±0.0201)96 h320.178±0.0121)

Note：Compared with the control group,1)P<0.05.

圖4 10 J/cm2 UVA照射不同時(shí)間后對(duì)HSF增殖的影響Fig.4 Effect of 10 J/cm2 UVA irradiation on HSF proliferation at different times

圖5 正常HSF 陰性染色結(jié)果(×100)Fig.5 Negative staining of normal HSF(×100)

圖6 UVA照射HSF 72 h后陽性染色結(jié)果(×100)Fig.6 Positive staining after HSF exposure to 72 by UVA(×100)

表3 不同強(qiáng)度UVA照射后對(duì)HSF中SOD、GSH-Px活性及MMP-1含量的影響

Tab.3 Effects of UVA irradiation on activity of SOD,GSH-Px and expression of MMP-1 in HSF

GroupsSOD(U/ml)GSH-Px (μmol/g)MMP-1(ng/ml)Control18.431±0.49125.438±2.7294.592±3.891UVA 5 J/cm212.963±0.8731)11.921±0.4121)7.533±6.0351)UVA 10 J/cm29.885±0.8471)8.010±0.1411)10.299±5.5161)UVA 20 J/cm24.361±0.2441)4.121±0.3321)15.062±2.2881)

Note：Compared with the control group,1)P<0.05.

圖7 HSF中c-fos表達(dá)Fig.7 c-fos expression in HSFNote: A.Control group;B.5 J/cm2 UVA group;C.10 J/cm2 UVA group;D.20 J/cm2 UVA group.

圖8 HSF中c-jun表達(dá)Fig.8 c-jun expression in HSFNote: A.Control group;B.5 J/cm2 UVA group;C.10 J/cm2 UVA group;D.20 J/cm2 UVA group.

表4 HSF經(jīng)不同強(qiáng)度UVA照射72 h后c-fos、c-jun、Sirt1的 mRNA 水平相對(duì)定量表達(dá)

Tab.4 Relative expression of mRNA levels of c-fos,c-jun and Sirt1 in HSF after exposure to 72 h by UVA at different intensities

Groupsc-fosc-junSirt1Control0.433±0.0460.432±0.0470.519±0.054UVA 5 J/cm20.679±0.0391)0.523±0.0311)0.712±0.0191)UVA 10 J/cm20.791±0.0511)0.579±0.0491)0.879±0.0451)UVA 20 J/cm20.899±0.0441)0.624±0.0501)0.932±0.0321)

Note：Compared with the control group,1)P<0.05.

圖9 HSF經(jīng)不同強(qiáng)度UVA照射72 h后c-fos、c-jun、Sirt1的蛋白表達(dá)Fig.9 Protein expression of c-fos,c-jun and Sirt1 after exposure to 72 h by UVA at different intensitiesNote: 1,2,3,4 represent control,UVA 5 J/cm2,UVA 10 J/cm2,UVA 20 J/cm2 respectively.

2.8Western blot檢測結(jié)果 HSF經(jīng)不同強(qiáng)度UVA照射HSF 72 h后，c-fos、c-jun、Sirt1的蛋白表達(dá)與紫外線強(qiáng)度呈正相關(guān)，隨著強(qiáng)度增大，表達(dá)增強(qiáng)，結(jié)果見圖9。

3 討論

皮膚是人體最大的器官，由表皮和真皮組成，在皮膚真皮層中HSF是主要細(xì)胞，因此HSF在人體最容易獲得。HSF也是主要修復(fù)細(xì)胞，對(duì)皮膚衰老和細(xì)胞受損具有修復(fù)作用，是紫外線輻射的重要靶位，在抗皮膚衰老和損傷中起著重要的作用。它具有重要的結(jié)構(gòu)功能，能釋放一些前炎癥介質(zhì)，從而激發(fā)急、慢性炎癥反應(yīng)并使之延續(xù)。細(xì)胞隨著年齡的增長，其生理功能和結(jié)構(gòu)發(fā)生退行性變化，這種變化就是細(xì)胞衰老又稱細(xì)胞老化。皮膚衰老和受損后的修復(fù)是一個(gè)復(fù)雜的生物學(xué)過程，而HSF是重要的修復(fù)細(xì)胞之一，小面積皮膚就可獲得較多的原代HSF，通過傳代能得到純度高的HSF，HSF對(duì)皮膚衰老及創(chuàng)傷的修復(fù)起著決定的作用，在一定時(shí)間內(nèi)，HSF的增殖能力與細(xì)胞的增殖能力呈正相關(guān)，這樣的增殖能力及HSF的再增殖能力恢復(fù)是體細(xì)胞基因治療的研究方向。本研究中通過對(duì)人包皮組織進(jìn)行組織貼塊法培養(yǎng)原代HSF，對(duì)HSF進(jìn)行傳代，從細(xì)胞生長曲線可以看到，在一定時(shí)間內(nèi)細(xì)胞數(shù)量隨時(shí)間增長而增加，到第7天后，細(xì)胞達(dá)融合狀態(tài)，形狀為長梭形，呈單層，此時(shí)可進(jìn)行傳代，通過對(duì)生長曲線的繪制可以發(fā)現(xiàn)HSF有潛伏期、對(duì)數(shù)生長期、平臺(tái)期三個(gè)時(shí)期。

我們已知Fos蛋白有四種形式(c-fos、Fos B、Fra-1及 Fra-2)，它與c-jun參與構(gòu)成轉(zhuǎn)錄激活因子(Activator protein 1，Ap-1)，AP-1蛋白表達(dá)在光老化的研究中具有重要作用，其表達(dá)產(chǎn)物也位于細(xì)胞核內(nèi)，另外c-fos 二聚體形式的Ap-1生物學(xué)活性最強(qiáng)[8,9]。耿春杰等[10]發(fā)表癌基因c-fos、c-myc在皮膚鱗狀細(xì)胞癌皮損中的表達(dá)及意義，認(rèn)為c-fos僅在細(xì)胞周期早期發(fā)揮作用，腫瘤細(xì)胞形成后，癌組織內(nèi)c-fos表達(dá)下降。因此與研究中皮膚光老化c-fos表達(dá)增加相一致。隨著UVA的照射增強(qiáng)，c-Jun蛋白和mRNA表達(dá)均有升高，并隨著照射強(qiáng)度增加而升高越明顯。不同強(qiáng)度UVA照射能明顯降低細(xì)胞內(nèi)SOD及GSH-Px活性，抗損傷能力明顯減弱，而MMP-1的含量顯著提高，說明UVA對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生光損傷作用。通過免疫組化研究，發(fā)現(xiàn)隨著UVA照射強(qiáng)度的增加，c-fos、c-jun蛋白均呈陽性表達(dá)，細(xì)胞漿和細(xì)胞核內(nèi)染色均為棕黃色。在UVA照射下，HSF細(xì)胞中的c-Fos和c-Jun 形成異二聚體的量增加[11-13]，使細(xì)胞產(chǎn)生過度增殖，從而使皮膚的外觀和組織均發(fā)生改變。在RT-PCR結(jié)果中，c-fos mRNA表達(dá)增加速度高于c-jun mRNA表達(dá)增加速度，說明c-fos的敏感度在光老化中高于c-jun，在Western blot結(jié)果中也可以看到細(xì)胞內(nèi)c-fos蛋白被激活，且c-fos、c-jun蛋白表達(dá)與紫外線強(qiáng)度呈正相關(guān)，這一結(jié)果與RT-PCR結(jié)果相一致。

Sirt1(Sirtuin type 1)也被稱為NAD-依賴性組蛋白去乙酰化酶，為Sirtuins家族成員之一，與細(xì)胞增殖、分化、衰老、凋亡和代謝密切相關(guān)[14-16]。楊婕等[17]證實(shí)Sirt1在細(xì)胞衰老過程中發(fā)揮著重要的作用，而且許多miRNAs對(duì)衰老相關(guān)分子Sirt1都具有調(diào)控作用。任朋亮等[18]也進(jìn)一步證實(shí)Sirt1能維持細(xì)胞基因組的穩(wěn)定性，進(jìn)而減緩細(xì)胞的衰老。本研究發(fā)現(xiàn)在紫外線的刺激下，抗衰老因子Sirt1 mRNA的表達(dá)也明顯增加，Sirt1的蛋白表達(dá)與紫外線強(qiáng)度亦呈正相關(guān)，這些結(jié)果均與上述研究者的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。

上述結(jié)果表明，HSF細(xì)胞可被UVA誘導(dǎo)進(jìn)入一種應(yīng)激老化狀態(tài)，其衰老與機(jī)體內(nèi)髙水平的抗氧化能力密切相關(guān)，這種由UVA照射引起的光老化，會(huì)使HSF增殖活性下降，細(xì)胞形狀發(fā)生改變，同時(shí)使細(xì)胞內(nèi)AP-1蛋白 (c-fos,c-jun)被激活、抗衰老因子Sirt1高表達(dá)，而在光老化關(guān)鍵信號(hào)路徑中AP-1蛋白的高表達(dá)，是否是直接引起抗衰老因子Sirt1表達(dá)增高的原因，有待進(jìn)一步研究論證，是后續(xù)實(shí)驗(yàn)的研究方向。