付俁蕭 黃 旭 呂 童 李丹妮 曹雅明 馮 輝

(中國(guó)醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室，沈陽(yáng)110122)

瘧疾是主要的全球衛(wèi)生問(wèn)題之一，宿主免疫應(yīng)答在瘧疾感染的發(fā)病、嚴(yán)重程度和預(yù)后中起重要作用。這促進(jìn)了以改善瘧疾臨床癥狀為目的的免疫調(diào)節(jié)性輔助治療方案的推進(jìn)[1]。阿托伐他汀(Atorvastatin，AVA)是肝臟3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A(3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A,HMG-CoA)還原酶抑制劑，是目前有效的他汀類降脂藥。阿托伐他汀不僅具有重要的調(diào)脂作用，還可改善內(nèi)皮祖細(xì)胞功能、發(fā)揮抗氧化和抗炎作用[2-4]。

體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在多種他汀類藥物中AVA對(duì)惡性瘧原蟲(chóng)增殖的抑制作用最明顯，它對(duì)22株不同藥敏譜的惡性瘧原蟲(chóng)均具有體外抑制作用[5，6]。體外交叉耐藥實(shí)驗(yàn)顯示，AVA治療與氯喹等喹啉類抗瘧藥相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因突變無(wú)關(guān)[6]。AVA與甲氟喹或雙氫青蒿素聯(lián)合用藥，可明顯緩解伯氏瘧原蟲(chóng)(Plasmodiumberghei，P.b)ANKA株感染的腦瘧癥狀和原蟲(chóng)血癥，并推遲小鼠死亡時(shí)間[7,8]。由此提示，AVA是他汀類藥物中與抗瘧藥物聯(lián)合使用后效果良好的候選藥物。

肝臟是瘧原蟲(chóng)紅前期發(fā)育所必需的場(chǎng)所。研究顯示，瘧原蟲(chóng)紅內(nèi)期累及肝臟導(dǎo)致肝功能異常的現(xiàn)象也較常見(jiàn)。P.bNK65株感染可引起小鼠肝臟過(guò)度氧化應(yīng)激；夏氏瘧原蟲(chóng)(PlasmodiumchabaudiAS，P.cAS)感染導(dǎo)致小鼠肝臟產(chǎn)生大量細(xì)胞因子引起肝臟炎癥[9]。一項(xiàng)134例瘧疾患者(單純惡性瘧、間日瘧和混合感染)前瞻性研究發(fā)現(xiàn)，高膽紅素血癥發(fā)生率為41.04%，血清谷草轉(zhuǎn)氨酶升高3倍以上占17.16%。肝功異常比瘧疾肝病更為常見(jiàn)[10]。因此，瘧疾感染肝臟的病理學(xué)研究對(duì)指導(dǎo)臨床診斷和治療具有重要意義。

AVA經(jīng)肝首過(guò)代謝，口服吸收良好。為此，本研究采用口服AVA單藥或與青蒿琥酯(Artesunate，AS)聯(lián)合用藥，觀察AVA在致死型約氏瘧原蟲(chóng)(Plasmodiumyoelii17XL，P.y17XL)感染中的治療效果，評(píng)估AVA單藥在瘧疾感染肝臟的病理?yè)p傷中的作用，為闡明AVA在瘧疾輔助治療中的作用及免疫調(diào)節(jié)機(jī)制提供基礎(chǔ)研究數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料 健康SPF級(jí)別雌性BALB/c小鼠，8～10周齡(50只)，購(gòu)自北京維通利華公司。P.y17XL由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)免疫學(xué)教研室實(shí)驗(yàn)室液氮保種。阿托伐他汀鈣購(gòu)自上海Macklin，青蒿琥酯購(gòu)自桂林南藥股份有限公司，Percoll購(gòu)自美國(guó)GE healthcare，無(wú)水乙醇、二甲苯、鹽酸、氨水、中性樹(shù)膠購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，蘇木素染液、伊紅染液、EDTA抗原修復(fù)液、HRP山羊抗兔二抗以及DAB顯色劑購(gòu)自中國(guó)Servicebio。流式抗體BV421-anti-CD3、FITC-anti-CD8a、PE-Cy5-anti-CD8a、PE-anti-CXCR6、PE-Cy7-anti-CD4、APC-anti-CD49b和FITC-anti-CD314購(gòu)自美國(guó)Biolegend、BD公司及天津三箭公司，組化抗體兔抗小鼠CD4和CD8抗體購(gòu)自北京Bioss。組織切片掃描儀(Pannoramic MIDI，3D Histech，匈牙利)；流式細(xì)胞儀(FACSCelesta，BD，美國(guó))。

1.2方法

1.2.1動(dòng)物模型的制備 液氮保種P.y17XL通過(guò)感染紅細(xì)胞復(fù)蘇后，腹腔感染BALB/c小鼠(0.1 ml/只，i.p.)。待原蟲(chóng)血癥達(dá)10%左右，小鼠麻醉狀態(tài)下EDTA抗凝心臟采血，取1×103P.y17XL 感染紅細(xì)胞尾靜脈感染BALB/c小鼠(0.1 ml/只，i.v.)。尾靜脈血涂片Giemsa染色，計(jì)數(shù)原蟲(chóng)血癥和觀察生存率。

1.2.2阿托伐他汀鈣劑的制備 美國(guó)心臟協(xié)會(huì)降膽固醇治療指南推薦的阿托伐他汀每日成人劑量為中效(10～20 mg/d)和強(qiáng)效劑量(40～80 mg/d)[11]。根據(jù)美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局發(fā)布的小鼠對(duì)人體劑量轉(zhuǎn)換指南[12]，本研究AVA灌胃劑量為3 mg/(kg·d)，折合成人體(60 kg)用量14.4 mg/d。AVA粉末加入雙蒸水中(0.1% DMSO)超聲溶解(75% 振幅，開(kāi)5 s，關(guān) 10 s，共5 min)。

1.2.3實(shí)驗(yàn)分組 AVA用藥效果觀察分4組，對(duì)照組(12只)：給予等量溶劑；AVA單藥組(12只)：從瘧原蟲(chóng)感染當(dāng)天開(kāi)始，AVA連續(xù)灌胃8 d(200 μl/只)；AS單藥組(12只)：感染第7天起，AS連續(xù)灌胃3 d；AVA+青蒿琥酯(AS)組(12只)：AVA給藥8 d，感染第7天起連續(xù)3 d給予AS[25 mg/(kg·d)，NaHCO3稀釋]灌胃。

1.2.4HE染色 4%多聚甲醛固定肝臟，制備石蠟切片。依次將切片放入二甲苯Ⅰ處理20 min，二甲苯Ⅱ處理20 min，無(wú)水乙醇Ⅰ處理5 min，無(wú)水乙醇Ⅱ處理5 min，75%乙醇處理5 min，自來(lái)水洗。經(jīng)蘇木素染色、伊紅染色，脫水封片。細(xì)胞核呈藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)呈紅色。

1.2.5免疫組化 石蠟切片脫蠟至水，抗原修復(fù)，阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，血清封閉，分別加入CD4或CD8抗體，4℃孵育過(guò)夜。加入HRP標(biāo)記的二抗，室溫孵育50 min，DAB顯色，復(fù)染細(xì)胞核，脫水封片。

1.2.6免疫組化結(jié)果分析 組化染色的組織切片經(jīng)組織切片掃描儀全片掃描。利用Quant center軟件分析組織切片的染色強(qiáng)度。判斷方法如下：深棕色為強(qiáng)陽(yáng)性，棕黃色為中度陽(yáng)性，淺黃色為弱陽(yáng)性，藍(lán)色細(xì)胞核為陰性。進(jìn)而對(duì)組織進(jìn)行識(shí)別分析出強(qiáng)陽(yáng)性、中度陽(yáng)性、弱陽(yáng)性、陰性的面積(單位：像素)和陽(yáng)性百分比，最后進(jìn)行組織化學(xué)評(píng)分(Histochemi-stry score，H-Score)[13]。

1.2.7小鼠肝臟單個(gè)核細(xì)胞制備 感染第7天時(shí)，麻醉狀態(tài)下頸椎脫位處死小鼠。打開(kāi)腹腔，下腔靜脈插管，灌注5～10 ml PBS，見(jiàn)肝臟膨脹后切斷門(mén)靜脈，排出殘血和灌流液。肝組織置于200目篩網(wǎng)研磨，取50 ml研磨液4℃靜置10 min，取35 ml上層細(xì)胞懸液，450～500 g離心10 min，棄上清。加入適量紅細(xì)胞裂解液，4℃作用5～7 min，450～500 g離心10 min，棄上清。用40% Percoll重懸細(xì)胞，重層于等體積70% Percoll上。22～24℃、1 500 g離心45 min，取灰白層細(xì)胞，PBS洗一次后定容于1 ml中，計(jì)數(shù)細(xì)胞濃度。

1.2.8流式細(xì)胞術(shù)染色 調(diào)整肝淋巴細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/100 μl，設(shè)陰性對(duì)照管和單標(biāo)管。每份樣品同時(shí)加入BV421-anti-CD3、FITC-anti-CD8a、PE-anti-CXCR6、PE-Cy7-anti-CD4或BV421-anti-CD3、FITC-anti-CD314、PE-anti-CXCR6、APC-anti-CD49b或BV4 21-anti-CD3、FITC-anti-CD314、PE-Cy5-anti-CD8a抗體，4℃孵育30 min。PBS洗細(xì)胞1次，棄上清，300 μl 定容，利用流式細(xì)胞儀獲取細(xì)胞，結(jié)果以點(diǎn)陣圖顯示。利用FlowJo 7.6.1分析流式結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1AVA治療控制原蟲(chóng)快速增殖并延緩P.y17XL疾病進(jìn)展 對(duì)照組在P.y17XL感染第4天，鏡下可見(jiàn)感染瘧原蟲(chóng)紅細(xì)胞，表明P.y17XL感染模型建立成功。感染后第6天感染率達(dá)20%左右，各組感染率無(wú)顯著差異。感染后第7天，對(duì)照組感染率迅速上升至61.8%，而AVA組感染率為41.2%，明顯低于對(duì)照組(P<0.05)。隨后，對(duì)照組小鼠出現(xiàn)死亡。AVA組的感染率峰值出現(xiàn)時(shí)間推遲，當(dāng)感染率達(dá)到峰值時(shí)小鼠出現(xiàn)死亡(P<0.05)。AS組和AVA+AS組在感染后第7天接受青蒿琥酯治療，感染率從第8天開(kāi)始降低，原蟲(chóng)血癥得到有效控制(見(jiàn)圖1)。

2.2AVA治療減輕P.y17XL瘧色素在肝臟沉積和對(duì)肝細(xì)胞的損傷 感染后第7天肝臟HE染色顯示，對(duì)照組肝細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)和肝竇內(nèi)多見(jiàn)棕褐色沉積物(瘧色素)，肝板結(jié)構(gòu)紊亂，肝細(xì)胞出現(xiàn)嗜酸性壞死。AVA組肝組織瘧色素沉積不明顯，肝細(xì)胞排列紊亂，胞質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)較多小的圓形空洞，出現(xiàn)微泡性脂肪變性但未見(jiàn)肝細(xì)胞壞死，見(jiàn)圖2。

圖1 P.y 17XL感染BALB/c小鼠感染率和生存率觀察Fig.1 Parasitemia and survival of BALB/c mice infected with P.y 17XLNote: *.P<0.05,AVA vs control group.

免疫組化顯示，AVA組肝臟CD4強(qiáng)陽(yáng)性細(xì)胞比例明顯增加，對(duì)照組偶見(jiàn)CD4+T細(xì)胞。與對(duì)照組H-Score評(píng)分結(jié)果相比，AVA組肝臟CD4+T細(xì)胞(310.73±24.80 vs 258.12±12.31，P<0.01)和CD8+T細(xì)胞(207.82±36.23 vs 165.15±22.04，P<0.05)細(xì)胞比例明顯增加，見(jiàn)圖3。

2.3AVA治療增加肝臟淋巴細(xì)胞數(shù)量 感染后第7天流式結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，AVA組總T細(xì)胞數(shù)量明顯增加(P<0.05)，其中以CD4+T細(xì)胞增加為主(P<0.05)，CD8+T細(xì)胞數(shù)量亦出現(xiàn)明顯升高(P<0.05)，見(jiàn)圖4。

2.4AVA治療趨化CXCR6+T細(xì)胞在肝臟募集 感染后第7天與對(duì)照組相比，AVA組表達(dá)CXCR6的CD4+T、CD8+T細(xì)胞數(shù)量明顯增加(P<0.05，P<0.01)。同時(shí)，CXCR6+NKT細(xì)胞數(shù)量明顯上升(P<0.05)，見(jiàn)圖5。

圖2 P.y 17XL感染BALB/c小鼠肝組織HE染色Fig.2 HE staining of liver tissue in BALB/c mice infected with P.y 17XLNote: Red circle indicates the location of malarial pigmentation,yellow arrow indicates necrotic hepatocytes.

圖3 P.y 17XL感染BALB/c小鼠肝組織組化染色Fig.3 Histochemical staining of liver tissue in BALB/c mice infected with P.y 17XLNote: IHC for CD4+T cell(A and C);IHC for CD8+T cells(B and D).

圖4 P.y 17XL感染BALB/c小鼠肝臟T淋巴細(xì)胞流式染色Fig.4 FACs analysis of liver T lymphocytes in BALB/c mice infected with P.y 17XLNote: Compared with control,*.P<0.05.

圖5 P.y 17XL感染BALB/c小鼠肝臟淋巴細(xì)胞CXCR6+T細(xì)胞流式染色Fig.5 Expression of CXCR6+T lymphocytes in BALB/c mice infected with P.y 17XLNote: Compared with control,*.P<0.05，**.P<0.01.

2.5AVA治療上調(diào)NKG2D在NKT細(xì)胞中的表達(dá) 感染后第7天流式結(jié)果顯示，與對(duì)照相比，AVA組NKG2D+CD8+T細(xì)胞和NKG2D+NKT細(xì)胞數(shù)量明顯增加(P<0.05)，見(jiàn)圖6。

圖6 P.y 17XL感染BALB/c小鼠淋巴細(xì)胞NKG2D表達(dá)Fig.6 Expression of NKG2D in T lymphocytes in BALB/c mice infected with P.y 17XLNote: Compared with control，*.P<0.05.

3 討論

瘧疾的免疫發(fā)病機(jī)制是復(fù)雜的過(guò)程，針對(duì)單一途徑治療可能不足以降低死亡率或改善臨床表現(xiàn)。研究顯示，普伐他汀、氟伐他汀、辛伐他汀和AVA分別以40 mg/kg劑量腹腔注射給藥，單藥對(duì)小鼠腦瘧的發(fā)生和存活率無(wú)明顯影響[14-16]。本研究采用等同成人口服AVA中等用藥劑量3 mg/(kg·d)灌胃小鼠，發(fā)現(xiàn)在感染早期AVA可有效控制P.y17XL瘧原蟲(chóng)快速增殖，推遲原蟲(chóng)血癥峰值出現(xiàn)。AVA是脂溶性藥物，經(jīng)肝臟代謝，口服用藥效果更佳。AVA腹腔注射劑量達(dá)40 mg/kg時(shí)，藥物會(huì)產(chǎn)生免疫抑制效應(yīng)[17]。由此，他汀類藥物的給藥方式和給藥劑量明顯影響抗瘧療效，結(jié)合本研究結(jié)果推薦采用低劑量口服給藥。

肝臟是紅細(xì)胞快速清除和鐵循環(huán)的主要場(chǎng)所，也被認(rèn)為是一種獨(dú)特的免疫器官[18，19]。瘧色素可誘導(dǎo)多種趨化因子表達(dá)，招募炎癥性細(xì)胞趨化至肝臟[20]。一項(xiàng)無(wú)并發(fā)癥惡性瘧患者肝損傷隊(duì)列研究顯示，低原蟲(chóng)負(fù)荷引起的肝損傷與抗瘧藥物肝毒性無(wú)關(guān)，誘導(dǎo)炎癥可能是肝損傷的主要驅(qū)動(dòng)因素[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，AVA單藥治療可降低瘧色素在肝臟沉積，肝臟病理?yè)p傷緩解可能與瘧色素沉積減少有關(guān)。常見(jiàn)抗瘧藥物氯喹或青蒿素尚未表現(xiàn)出肝臟保護(hù)效應(yīng)，AVA在改善瘧疾肝臟病理方面的作用，為其成為抗瘧輔助用藥提供了更好的應(yīng)用前景。

研究顯示，他汀類藥物在輔助瘧疾治療中的作用機(jī)制表現(xiàn)在：①減少腦部炎癥和微膠質(zhì)細(xì)胞活化并改善大腦微血管，預(yù)防腦瘧后認(rèn)知障礙[22]；②降低腦組織CXCL10表達(dá)以減少實(shí)驗(yàn)性腦瘧發(fā)生[7,23]；③保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞免受惡性瘧原蟲(chóng)引起的側(cè)支損傷、細(xì)胞凋亡和內(nèi)皮屏障的通透性[24]。CXCR6是新型趨化因子CXCL16的唯一受體，膜結(jié)合型CXCL16廣泛分布在肝血管內(nèi)皮和肝血竇內(nèi)皮細(xì)胞表面[25]，CXCR6可介導(dǎo)NKT和CD4+T細(xì)胞清除衰老肝細(xì)胞，防止肝癌發(fā)生[26]，對(duì)減毒子孢子免疫誘導(dǎo)的肝臟記憶CD8+T細(xì)胞發(fā)育和維持至關(guān)重要[27]。本研究發(fā)現(xiàn)，AVA單藥治療可增加肝臟CXCR6+T細(xì)胞數(shù)量，升高CD8+T細(xì)胞和NKT細(xì)胞活化性受體NKG2D表達(dá)。由此，AVA治療可能通過(guò)改善肝臟微環(huán)境促進(jìn)趨化因子表達(dá)，進(jìn)而募集CXCR6+T細(xì)胞向肝臟趨化，參與肝臟瘧原蟲(chóng)的清除。

瘧疾輔助治療的開(kāi)展將有助于更全面地理解瘧疾感染引起的生理和病理學(xué)改變?？汞懰幒洼o助用藥的聯(lián)合使用通過(guò)提高療效和減少并發(fā)癥使瘧疾感染的控制更為有效。深入探討藥物治療的生物靶標(biāo)可為抗瘧治療提供新的治療靶點(diǎn)。