范志茹 倪 欣 單莉婭 張愛(ài)梅 馬克濤

(石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，石河子大學(xué)第一附屬醫(yī)院心內(nèi)三科,石河子 832000)

肺動(dòng)脈高壓(Pulmonary arterial hypertension,PAH)是一組由各種機(jī)制引起的以肺血管阻力持續(xù)增加為特征的臨床綜合征,其主要的病理過(guò)程為肺血管持續(xù)收縮、血管壁重塑，進(jìn)而形成原位血栓，導(dǎo)致右心負(fù)荷增加、功能不全，最終嚴(yán)重影響患者生存質(zhì)量和預(yù)后[1,2]。研究發(fā)現(xiàn)免疫炎癥應(yīng)答在肺動(dòng)脈高壓的發(fā)病過(guò)程中具有重要作用[3-5]。在PAH患者及動(dòng)物模型中，重構(gòu)的肺動(dòng)脈周?chē)?、心臟及肺組織中都有明顯的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)[6,7]。T淋巴細(xì)胞作為主要反應(yīng)免疫系統(tǒng)功能的重要指標(biāo)，其亞群CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞發(fā)揮主要的作用[8]。在PAH大鼠的肺組織中，炎性浸潤(rùn)細(xì)胞主要涉及CD4+T細(xì)胞并且參與了肺血管的重塑，T細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥早于以肺動(dòng)脈為特征的血管重塑以及右心室的重構(gòu)[9]。

連接蛋白(Connexin,Cx)廣泛表達(dá)在免疫系統(tǒng)中，其中Cx40、Cx43表達(dá)在免疫細(xì)胞上[10]，由連接蛋白構(gòu)成的縫隙連接通道或半通道與免疫炎癥應(yīng)答密切相關(guān)[11]。在急性或慢性肺部炎癥疾病的免疫應(yīng)答過(guò)程中，免疫細(xì)胞的增殖、活化和成熟也需要依賴(lài)于連接蛋白的作用[12,13]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)在自發(fā)性高血壓大鼠外周血中CD4+T、CD8+T淋巴細(xì)胞上Cx40和Cx43表達(dá)顯著高于對(duì)照組，且與促炎因子IL-2和IL-6的表達(dá)呈正相關(guān)，應(yīng)用縫隙連接通道特異性阻斷劑Gap27干預(yù)后，以上兩種促炎細(xì)胞因子的表達(dá)顯著下調(diào)。然而，T淋巴細(xì)胞上連接蛋白在PAH誘導(dǎo)的炎癥應(yīng)答中扮演何種角色并不清楚。因此，本項(xiàng)目以SD大鼠為研究對(duì)象，制備PAH模型探討T淋巴細(xì)胞上連接蛋白是否參與了肺動(dòng)脈高壓的炎癥應(yīng)答。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 隨機(jī)選取12周齡SD大鼠12只，雄性，清潔級(jí)，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供[動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(京)2012-0001]，動(dòng)物房室內(nèi)溫度20～25 ℃，濕度為50%～55%。各組大鼠分籠喂養(yǎng)，給予標(biāo)準(zhǔn)詞料，自由進(jìn)食水，環(huán)境安靜。

1.1.2主要試劑和儀器 野百合堿(Monocrota-line,MCT,美國(guó)Sigma公司)；大鼠白細(xì)胞介素(Interleukin,IL)6、腫瘤壞死因子α(Tumor necrosis factor,TNF-α)試劑盒購(gòu)自杭州聯(lián)科生物技術(shù)有限公司；淋巴細(xì)胞分離液(天津?yàn)罂萍加邢薰?；FITC anti-rat CD3 抗體、APC anti-rat CD4 抗體、PE anti-rat CD8抗體(美國(guó)Biolegend 公司)；Anti-mouse-Connexin 43 抗體(美國(guó)Abcam 公司)；Connexin 43 FITC標(biāo)記二抗(北京聯(lián)科生物公司)；Anti-Goat-Connexin 40抗體(美國(guó)Santa Cruz公司)；Connexin 40 FITC標(biāo)記二抗(北京聯(lián)科生物公司)；固定劑緩沖液Fixation Diluent、固定液Fixation Concentrate、破膜緩沖液Permeabilization buffer(美國(guó)eBioscience 公司)；低速離心機(jī)(安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司)；流式細(xì)胞儀(深圳邁瑞公司)；光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司)；倒置相差顯微鏡(寧波舜宇儀器有限公司)。

1.2方法

1.2.1動(dòng)物分組 隨機(jī)取12只SD雄鼠分為PAH組(1%的野百合堿溶液腹腔一次性注射60 mg/kg，4周)和正常對(duì)照組(腹腔注射生理鹽水)，普通喂養(yǎng)，每組6只，每日觀察。

1.2.2記錄右心室肥大指數(shù) 取血后立即處死大鼠，剖開(kāi)胸腔取出心肺組織，小心剝離左、右心房和主動(dòng)脈、肺動(dòng)脈，分離右心室游離壁(Right ventricular,RV)與室間隔+左心室interventricular septum,IVS+left ventricular,LV),用冰的0.9%氯化鈉溶液洗去血液，用濾紙吸取表面水分稱(chēng)重，計(jì)算右心室肥大指數(shù)RVHI=RV/(IVS+LV)。

1.2.3大鼠肺臟病理學(xué)的觀察并計(jì)算肺中小動(dòng)脈WT%及WA% 各組大鼠麻醉后取左葉肺臟，進(jìn)行常規(guī)HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察肺臟病理學(xué)改變。為了評(píng)價(jià)肺血管重建，選擇管壁厚度占血管外徑的百分比(WT%)和肺動(dòng)脈管壁面積與管總面積的百分比(WA%)為指標(biāo)。每只大鼠選取肺中、小動(dòng)脈,使用Image J軟件進(jìn)行形態(tài)計(jì)量分析,由病理科兩位醫(yī)師盲法測(cè)量管壁厚度(WT)、血管外徑(ED)，平均血管總面積(TA)和血管腔面積(IA)，計(jì)算WT%和WA%，WT%=(2×WT/ED) ×100%，WA%=(TA-IA)/TA×100%。

1.2.4ELISA方法測(cè)定肺組織勻漿IL-6、TNF-α 取各組動(dòng)物冰凍肺組織的右肺下葉100 mg,加入1 ml 預(yù)冷勻漿緩沖液,用組織剪先將組織剪成小塊后用勻漿儀勻漿冰上操作,之后4℃孵育1 h。高速離心5 000 r/min，4℃離心20 min取上清，按酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)試劑盒說(shuō)明操作，分別檢測(cè)各組中IL-6、TNF-α蛋白水平。

1.2.5流式細(xì)胞染色及肺組織T淋巴細(xì)胞亞群表達(dá) 將對(duì)照組和PAH組肺臟剪碎、研磨；取懸液于15 ml離心管中,1 500 r/min離心10 min，棄上清,沉淀用5 ml PBS重懸；取一支15 ml 離心管，加入等體積淋巴細(xì)胞分離液，將重懸的組織液體緩慢加入淋巴細(xì)胞分離液上層，密度梯度離心法1 500 r/min離心30 min，取淋巴細(xì)胞層吸出至1.5 ml EP管內(nèi)，加入2 ml生理鹽水1 800 r/min離心6 min，洗滌2次，棄上清，沉淀即淋巴細(xì)胞。設(shè)立陰性對(duì)照和空白對(duì)照，用300 μl PBS重懸淋巴細(xì)胞，分別加入相應(yīng)流式抗體(CD3 FITC;CD4 APC;CD8 PE)。室溫孵育30 min，上機(jī)檢測(cè)。

1.2.6流式細(xì)胞儀檢測(cè)T淋巴細(xì)胞CD4Cx40和CD4Cx43的表達(dá) 收集肺組織淋巴細(xì)胞50 μl于離心管中，加入CD3-FITC、CD4-APC和CD8-PE表面抗體，4℃避光孵育30 min，加入500 μl PBS，1 800 r/min 離心6 min，棄上清；加入120 μl固定劑，4℃孵育20 min；加入300 μl 1×破膜劑，1 800 r/min離心6 min，棄上清，加入100 μl 破膜劑，37 ℃孵育20 min；測(cè)定管分別加1 μl Cx43/Cx40一抗混勻，室溫孵育30 min，再加入1 μl FITC 標(biāo)記二抗，室溫避光孵育30 min，加入500 μl PBS 洗滌細(xì)胞2次加入300 μl PBS重懸細(xì)胞，吹打混勻，上機(jī)流式檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1各組大鼠一般狀況及RVHI的變化 對(duì)照組大鼠進(jìn)食飲水正常，毛發(fā)光澤，體質(zhì)量隨時(shí)間逐漸增加；PAH組大鼠較對(duì)照組進(jìn)食飲水量減少，大鼠逐漸出現(xiàn)體毛暗淡、呼吸急促、行動(dòng)反應(yīng)遲鈍等表現(xiàn)，體質(zhì)量明顯減輕且活動(dòng)度明顯減低，實(shí)驗(yàn)結(jié)束前均無(wú)大鼠死亡。經(jīng)野百合堿干預(yù)4周后,與對(duì)照組比較，PAH組右心室重量與RVHI明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,表 1)，造模成功。

2.2肺組織病理學(xué)改變及大鼠肺中小型動(dòng)脈WT%和WA%的比較 肺組織HE染色于光鏡下顯示，觀察兩組大鼠肺中小型動(dòng)脈結(jié)構(gòu)差異:對(duì)照組大鼠肺中型動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的連續(xù)性好，細(xì)胞分布均勻，厚薄一致，血管周?chē)鸁o(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；PAH大鼠的肺中型動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞連續(xù)性破壞，呈現(xiàn)出立方形或柱狀突向血管腔，管壁厚度明顯增厚，管腔面積明顯縮小，伴有明顯的血管周?chē)装Y(圖1)。對(duì)照組的肺小型動(dòng)脈管壁薄，管腔面積大；PAH大鼠肺小型動(dòng)脈管壁明顯增厚,管腔狹窄,血管周?chē)忻黠@炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(圖2)。PAH組大鼠的肺中小型動(dòng)脈較對(duì)照組出現(xiàn)明顯的血管重構(gòu)和血管周?chē)仔约?xì)胞浸潤(rùn),與Control組比較，PAH組大鼠肺中型動(dòng)脈以及肺小型動(dòng)脈WT%和WA%均明顯增高，MCT誘導(dǎo)的PAH大鼠出現(xiàn)明顯的血管重構(gòu)(P<0.05,表2)。

GroupsControl groupPAH groupRV weight(g)0.15±0.010.32±0.031)IVS+LV weight(g)0.65±0.030.62±0.05RVHI(%)22.33±0.9451.62±2.961)

Note：Compared with control group，1)P<0.05,RVHI=RV/(IVS+LV).

2.3MCT誘導(dǎo)PAH大鼠肺組織勻漿中IL-6、TNF-α水平的影響 與Control組比較，PAH組大鼠肺組織勻漿中IL-6含量升高(P<0.05)；與Control組比較，PAH組大鼠的TNF-α含量升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05，表3)。

2.4MCT誘導(dǎo)PAH組大鼠肺組織勻漿中T淋巴細(xì)胞亞群表達(dá) 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)對(duì)照組大鼠和PAH組肺組織勻漿中CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD4+/CD8+的頻率，結(jié)果顯示：PAH組肺組織勻漿中CD3+表達(dá)比率高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；PAH組肺組織勻漿中CD3+CD4+表達(dá)比率高于對(duì)照組；PAH組肺組織勻漿中CD3+CD8+表達(dá)比率低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；PAH組肺組織勻漿中CD4+/CD8+表達(dá)比率高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,圖3)。

圖1 對(duì)照組和PAH組大鼠肺中型動(dòng)脈HE染色Fig.1 Hematoxylin and eosin staining of middle pulmonary artery between control and PAH ratsNote: A.Control group(×200);B.PAH group(×200);C.Control group(×400);D.PAH group(×400).

圖2 對(duì)照組和PAH組大鼠肺小型動(dòng)脈HE染色Fig.2 Hematoxylin and eosin staining of small pulmonary artery between control and PAH ratsNote: A.Control group(×200);B.PAH group(×200);C.Control group(×400);D.PAH group(×400).

GroupsMedium-sized pulmonary arteryWT%WA%Small-sized pulmonary arteryWT%WA%Control group11.20±3.6731.76±1.0416.86±1.4455.32±1.50PAH group62.40±3.841)87.04±2.101)57.83±2.691)93.23±0.571)

Note：Compared with control group，1)P<0.05.

GroupsIL-6TNF-αControl group82.90±2.1087.72±9.46PAH group102.20±2.301)127.20±2.701)

Note：Compared with control group,1)P<0.05.

圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)兩組大鼠肺組織T淋巴細(xì)胞亞群的表達(dá)比例Fig.3 Percentage of T lymphocyte subsets in lung of control and PAH rats were detected by flow cytometryNote: *.P<0.05.

2.5肺組織勻漿中CD4+T淋巴細(xì)胞Cx40、Cx43與細(xì)胞因子的相關(guān)性分析 肺組織勻漿中CD4+Cx40與細(xì)胞因子IL-6、TNF-α呈顯著正相關(guān)，肺組織勻漿中CD4+Cx43細(xì)胞因子IL-6、TNF-α同樣呈顯著正相關(guān)性(表4)。

表4 CD4+Cx40和CD4+Cx43與炎癥因子的相關(guān)性分析

Tab.4 Corelation analysis of CD4+Cx40/Cx43 and infla-mmatory cytokines

CytokinesCD4+Cx40+CD4+Cx43+IL-6r=0.881r=0.833P=0.004P=0.010TNF-αr=0.905r=0.952P=0.002P=0.001

圖4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)兩組大鼠肺組織CD4+ Cx40、CD4+Cx43的表達(dá)比例Fig.4 Percentage of CD4+Cx40 and CD4+Cx43 in lung of control and PAH rats were detected by flow cytometryNote: **.P<0.01.

2.6MCT誘導(dǎo)PAH組大鼠肺組織CD4+上Cx40、Cx43的表達(dá) 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)對(duì)照組大鼠和PAH組肺組織勻漿中CD4+Cx40、CD4+Cx43的表達(dá)比率，結(jié)果顯示：PAH組肺組織勻漿中CD4+Cx40表達(dá)比率為(45.02±5.00)%高于對(duì)照組(28.63±8.29)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；PAH組肺組織勻漿中CD4+Cx43表達(dá)比率為(47.88±4.53)%高于對(duì)照組(31.50±9.39)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，圖4)。

3 討論

肺動(dòng)脈高壓是多種生理途徑和細(xì)胞類(lèi)型引起的多因素的病理生理改變，包括肺血管收縮、增殖，血管阻塞性重構(gòu)，炎性浸潤(rùn)及原位血栓形成等機(jī)制。近年來(lái)，許多研究發(fā)現(xiàn)免疫炎癥應(yīng)答機(jī)制在肺動(dòng)脈高壓、原發(fā)性高血壓及動(dòng)脈粥樣硬化等心血管疾病發(fā)病過(guò)程中具有重要作用。Tamosiuniene等[14]提出在PAH大鼠模型中，炎癥的發(fā)生先于血管重塑，這顯示出炎癥是血管疾病的起因而不是結(jié)果。炎癥細(xì)胞釋放出大量的細(xì)胞因子、趨化因子和黏附分子，導(dǎo)致肺血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷和平滑肌細(xì)胞的增殖[15]。MCT是一種雙化咯類(lèi)生物堿，它可使肺血管內(nèi)皮產(chǎn)生不可逆性的損傷，進(jìn)而血管活性物質(zhì)、炎癥因子釋放增加，從而引發(fā)血管重構(gòu)、血管收縮、平滑肌細(xì)胞異常增生[16]。本研究通過(guò)注射MCT建立PAH模型，檢測(cè)肺動(dòng)脈高壓引起的肺臟炎性改變，發(fā)現(xiàn)PAH大鼠肺動(dòng)脈血管壁增厚，管腔狹窄，肺泡膜增厚，肺中小動(dòng)脈周?chē)忻黠@的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，肺組織勻漿中IL-6、TNF-α的水平顯著升高，這表明肺動(dòng)脈高壓與肺部炎性反應(yīng)密切相關(guān)。

CD4+T細(xì)胞刺激抗原提呈細(xì)胞和CD8+T淋巴細(xì)胞成熟活化，促進(jìn)細(xì)胞發(fā)揮免疫應(yīng)答反應(yīng)，在機(jī)體免疫反應(yīng)和自身免疫等方面發(fā)揮著重要的作用[17]。本研究發(fā)現(xiàn)肺動(dòng)脈高壓伴隨著肺部CD4+T細(xì)胞增高和CD8+T淋巴細(xì)胞降低，與Cuttica等發(fā)現(xiàn)PAH大鼠肺部CD4+T細(xì)胞數(shù)量增高結(jié)果相一致[9,18]。Edward等[19]研究顯示T細(xì)胞缺陷的老鼠更容易發(fā)展成為PAH，而注射內(nèi)皮祖細(xì)胞后疾病有所改善，同時(shí)也在PAH患者中發(fā)現(xiàn)CD4/CD8升高的現(xiàn)象。本研究主要對(duì)肺臟中T淋巴細(xì)胞亞群在肺動(dòng)脈高壓疾病狀態(tài)時(shí)的表達(dá)變化進(jìn)行探討。結(jié)果顯示，與相同周齡的對(duì)照組大鼠比較，PAH大鼠肺臟中CD3+T淋巴細(xì)胞比例增高，CD3+CD4+表達(dá)比例增高；CD4+/CD8+在PAH大鼠明顯升高，較對(duì)照組發(fā)生紊亂，此結(jié)果提示肺動(dòng)脈高壓大鼠體內(nèi)免疫平衡被打破，使淋巴細(xì)胞亞群表達(dá)發(fā)生異常改變。

已有研究表明，Cx40、Cx43在免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)和炎癥應(yīng)答具有重要作用[11]，但對(duì)于淋巴細(xì)胞上Cx40、Cx43的表達(dá)在炎癥參與的肺動(dòng)脈高壓過(guò)程中的變化尚不清楚。有研究證實(shí)Cx40、Cx43在肺組織中的表達(dá)有助于通過(guò)細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外的信號(hào)傳導(dǎo)來(lái)控制體內(nèi)的平衡[20]。炎癥是PAH的特征之一[21]，肺部炎癥過(guò)程中活化的T淋巴細(xì)胞中Cx43形成的縫隙連接通道參與IFN-γ的合成與分泌，進(jìn)而促進(jìn)Cx43的表達(dá)上調(diào)[2]。本研究顯示肺動(dòng)脈高壓大鼠CD4+T淋巴細(xì)胞中Cx43、Cx40表達(dá)顯著高于對(duì)照組，進(jìn)行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，大鼠肺組織勻漿中細(xì)胞因子IL-6、TNF-α與CD4+T淋巴細(xì)胞上Cx40和Cx43高表達(dá)呈顯著正相關(guān)，上述結(jié)果提示肺動(dòng)脈高壓的肺部炎癥與縫隙連接蛋白的表達(dá)及功能密切相關(guān)。然而，免疫系統(tǒng)中的連接蛋白在PAH的炎癥發(fā)生過(guò)程中如何發(fā)揮信息傳遞作用并不清楚，有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究主要發(fā)現(xiàn)肺動(dòng)脈高壓時(shí)伴隨炎癥反應(yīng)，CD4/CD8免疫平衡發(fā)生紊亂，Cx40、Cx43 在CD4+T淋巴細(xì)胞的表達(dá)升高，但具體機(jī)制尚不清楚，本研究有助于我們進(jìn)一步探討連接蛋白在肺動(dòng)脈高壓炎癥反應(yīng)中調(diào)控的機(jī)制，從而為肺動(dòng)脈高壓的免疫靶向治療奠定理論基礎(chǔ)。