莫燕月 唐浩元 何春玫

(廣西農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院,南寧 530007)

黃連(Coptis chinensis Franch.),毛茛科植物,別名味連、川連,具有抗菌消炎、抗病毒、抗腹瀉、解熱、降血糖血脂、抗氧化、影響心血管和血液系統(tǒng)、抗?jié)兊裙π1,2]。黃連主要含鹽酸小檗、黃連堿、巴馬汀等原小檗堿型生物堿[3],其中鹽酸小檗堿(Berberine hydrochloride)亦稱黃連素,是黃連抗菌的主要有效成分,含量可達(dá)11.3%[4]。

目前提取鹽酸小檗堿的傳統(tǒng)方法主要有回流法、索氏連續(xù)回流提取法、冷浸法和滲漉法等,這些方法都存在或提取時(shí)間太長(zhǎng)、或提取率較低、或溶劑使用量大等缺點(diǎn),近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的酶輔助、微波輔助和超聲波輔助等提取方法,在一定程度上彌補(bǔ)這些缺點(diǎn)[5]。其中超聲波提取技術(shù)是利用超聲波產(chǎn)生的強(qiáng)烈振動(dòng)、空化效應(yīng)、攪拌等作用以加速植物有效成分進(jìn)入溶劑,提高提取率、縮短提取時(shí)間、簡(jiǎn)化操作步驟、節(jié)約實(shí)驗(yàn)成本。故本研究擬采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化超聲波輔助提取黃連中鹽酸小檗堿工藝,為鹽酸小檗堿分離純化的規(guī)?；a(chǎn),進(jìn)一步開發(fā)利用黃連藥材提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

黃連購(gòu)自南寧市華泰中藥飲片有限責(zé)任公司,生產(chǎn)批號(hào)170201,產(chǎn)地四川;鹽酸小檗堿標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),生產(chǎn)批號(hào)43240010,上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司;乙醇,分析純;超純水(自制)。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)備

V-1800型分光光度計(jì);石英比色皿;KQ-300DB型數(shù)控親水性超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司產(chǎn));JP-1000B型高速多功能粉碎機(jī);EL204型電子天平;UPT-II-20T型優(yōu)普系列超純水機(jī)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 鹽酸小檗堿標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精確稱取鹽酸小檗堿0.02g,以適量80%乙醇溶解后定容于100mL容量瓶中,準(zhǔn)確吸取0、1、2、3、4、5、6mL上述標(biāo)準(zhǔn)液,稀釋并定容至25mL,所得鹽酸小檗堿系列工作液分別相當(dāng)于0、2、4、6、8、10、12g/mL鹽酸小檗堿標(biāo)準(zhǔn)溶液。在320～400nm波長(zhǎng)下對(duì)鹽酸小檗堿工作液進(jìn)行掃描,在348nm處出現(xiàn)最大吸收波長(zhǎng)。以純化水為參比,系列工作液吸光度A348為縱坐標(biāo)、鹽酸小檗堿含量C為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并擬合回歸方程(圖1所示)。

圖1 鹽酸小檗堿標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.3.2 鹽酸小檗堿的提取工藝和提取率的計(jì)算 將黃連藥材粉碎為粗粉。精密稱量一定質(zhì)量粗粉于小錐形瓶中,按料液比1∶30(g/mL)加入一定濃度的乙醇,密封后超聲處理提取一定時(shí)間,過(guò)濾,定容。將提取液適當(dāng)稀釋,用石英比色皿測(cè)定樣品溶液的吸光度A348。

式中：C—鹽酸小檗堿濃度(mg/mL);V—定容體積(mL);n—稀釋倍數(shù);m—黃連粗粉質(zhì)量(g)。

1.4 單因素實(shí)驗(yàn)

1.4.1 超聲時(shí)間對(duì)鹽酸小檗堿提取率的影響 按1.3.2,以料液比1∶30(g/mL)分別加入80%乙醇溶液,在40℃、210W超聲波功率下,分別超聲處理20、30、40、50min,過(guò)濾,定容,再適當(dāng)稀釋后,分別測(cè)定樣品溶液的吸光度A348,計(jì)算鹽酸小檗堿提取率。

1.4.2 提取溫度對(duì)鹽酸小檗堿提取率的影響 按1.3.2,以料液比1∶30(g/mL)分別加入80%乙醇溶液,在210W超聲波功率下,分別在30、40、50、60℃的溫度下超聲處理30min,過(guò)濾,定容,再適當(dāng)稀釋后,分別測(cè)定樣品溶液的吸光度A348,計(jì)算鹽酸小檗堿提取率。

1.4.3 超聲波功率對(duì)鹽酸小檗堿提取率的影響 按1.3.2,以料液比1∶30(g/mL)分別加入80%乙醇溶液,在40℃下以0、180、210、240、270、300W超聲處理30min,過(guò)濾,定容,再適當(dāng)稀釋后,分別測(cè)定樣品溶液的吸光度A348,計(jì)算鹽酸小檗堿提取率。

1.4.4 乙醇濃度對(duì)鹽酸小檗堿提取率的影響 按1.3.2,以料液比1∶30(g/mL)分別加入60、70、80、90%乙醇溶液,在40℃、210W超聲處理30min,過(guò)濾,定容,再適當(dāng)稀釋后,分別測(cè)定樣品溶液的吸光度A348,計(jì)算鹽酸小檗堿提取率。

1.5 響應(yīng)面分析

通過(guò)單因素試驗(yàn)考察超聲時(shí)間、超聲功率、提取溫度和乙醇濃度的影響水平,并篩選出影響鹽酸小檗堿提取率較顯著的三個(gè)因素,利用Design Expert 10.0.4軟件進(jìn)行Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)方案設(shè)計(jì),響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平表見(jiàn)表1。

表1 Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平表

1.6 驗(yàn)證優(yōu)化條件

將Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)方案模型擬合得到的最佳工藝條件,進(jìn)行3次重復(fù)性實(shí)驗(yàn),所得結(jié)果取均值后,與模型給出的理論數(shù)據(jù)進(jìn)行比較,驗(yàn)證模型的可靠性。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 超聲時(shí)間對(duì)鹽酸小檗堿提取率的影響 選擇乙醇濃度為80%,提取溫度為50℃,超聲功率240W,超聲時(shí)間為0、20、30、40、50min提取鹽酸小檗堿,計(jì)算鹽酸小檗堿提取率,結(jié)果如圖2所示。

圖2 超聲時(shí)間對(duì)鹽酸小檗堿提取率的影響

由圖2可見(jiàn),黃連中鹽酸小檗堿的提取隨時(shí)間的推移呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì),當(dāng)提取時(shí)間在0～30min時(shí),植物細(xì)胞壁破碎程度加大,更有利于細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的溶出。超聲40min后提取率呈現(xiàn)下降趨勢(shì),可能是因?yàn)殡S超聲時(shí)間的增長(zhǎng)細(xì)胞破壁程度更細(xì)碎,胞內(nèi)物質(zhì)析出更多,這些雜質(zhì)與鹽酸小檗堿競(jìng)爭(zhēng)溶解于乙醇,同時(shí)細(xì)碎的細(xì)胞對(duì)鹽酸小檗堿也有一定的吸附作用,從而導(dǎo)致鹽酸小檗堿提取率呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。因此,超聲時(shí)間初步確定為30min。

2.1.2 提取溫度對(duì)鹽酸小檗堿提取率的影響 選擇乙醇濃度為80%,超聲功率240W,超聲時(shí)間為30min,提取溫度為30、40、50、60℃提取鹽酸小檗堿,計(jì)算鹽酸小檗堿提取率,結(jié)果如圖3所示。

由圖3可見(jiàn),由30℃溫度稍低,分子運(yùn)動(dòng)速度略慢,有效成份的溶解速度略慢,因此提取率略低。溫度升高后,分子運(yùn)動(dòng)速度增快,提取率上升并達(dá)到最高值。在本實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,室溫在20±5℃,且30℃時(shí)提取率為最佳溫度40℃的92.0%,可見(jiàn),提取溫度的變化對(duì)鹽酸小檗堿的提取率影響不大且樣液經(jīng)超聲處理后溫度升高,因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)設(shè)置提取初溫度為40℃,且不對(duì)提取溫度因素進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。

圖3 提取溫度對(duì)鹽酸小檗堿提取率的影響

2.1.3 超聲功率對(duì)鹽酸小檗堿提取率的影響選擇乙醇濃度為80%,超聲時(shí)間為30min,提取溫度為40℃,超聲功率為0、180、210、240、270、300W提取鹽酸小檗堿,計(jì)算鹽酸小檗堿提取率,結(jié)果如圖4所示。

圖4 超聲功率對(duì)鹽酸小檗堿提取率的影響

由圖4可見(jiàn),在超聲功率為0～240W時(shí),隨著超聲功率增大,黃連粗粉細(xì)胞破碎率越大,鹽酸小檗堿提取率越大,240W時(shí)達(dá)到最大提取率,再增大超聲功率,提取率略有起伏,但變化不大。因此,超聲功率初步確定為240W。

2.1.4 乙醇濃度對(duì)鹽酸小檗堿提取率的影響 選擇超聲時(shí)間為30min,提取溫度為50℃,超聲功率為240W,乙醇濃度為60、70、80、90%,提取鹽酸小檗堿,計(jì)算鹽酸小檗堿提取率,結(jié)果如圖5所示。

由圖5可見(jiàn),乙醇濃度對(duì)鹽酸小檗堿的提取有影響,實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn),當(dāng)乙醇濃度低于60%時(shí),過(guò)濾速度很慢,當(dāng)乙醇濃度大于60%時(shí),提取率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì),80%時(shí)提取率最高,可能是因?yàn)辂}酸小檗堿極性與80%乙醇相近,溶解度最高。因此,乙醇濃度初步確定為80%。

圖5 乙醇濃度對(duì)鹽酸小檗堿提取率的影響

2.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),4個(gè)因素均對(duì)黃連中鹽酸小檗堿的提取有影響,其中提取溫度的較優(yōu)水平為40℃、超聲時(shí)間的較優(yōu)水平為30min、乙醇濃度的較優(yōu)水平為80%、超聲功率的較優(yōu)水平為240W。選擇超聲時(shí)間、乙醇濃度、超聲功率3個(gè)因素的3個(gè)較優(yōu)水平,以鹽酸小檗堿提取率為響應(yīng)值,通過(guò)Box-Behnken設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)方案。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在此條件下,乙醇濃度和超聲時(shí)間兩因素間的交互影響極顯著,最佳工藝條件為超聲功率210W,超聲時(shí)間40min,乙醇濃度78.2%,其中超聲功率和超聲時(shí)間均達(dá)到響應(yīng)面設(shè)計(jì)時(shí)因素水平的極端值,因此調(diào)整因素水平,重新設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)方案,響應(yīng)面試驗(yàn)方案與結(jié)果見(jiàn)表2。

對(duì)表2數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合,可得響應(yīng)變量A、B、C對(duì)提取率(Y)的回歸方程為：

Y(%)=8.93-0.26A+0.19B-1.05C+0.080AB+0.020AC-0.43BC-0.64A2-0.31B2-1.21C2

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

利用Design Expert8.0軟件對(duì)表2數(shù)據(jù)進(jìn)行ANOVA方差分析,結(jié)果如表3如示。

表3 ANOVA方差分析表

經(jīng)分析,回歸模型的R2=0.9842,=0.9639,P＜0.0001,說(shuō)明模型擬合度較好,模型可靠;失擬項(xiàng)P=0.8511,影響不顯著,說(shuō)明非試驗(yàn)因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響不大;變異系數(shù)C.V.%=2.67＜5,說(shuō)明該回歸模型可信度較高;精密度值=20.38＞4,說(shuō)明該模型合理,因此,可應(yīng)用該模型預(yù)測(cè)和分析黃連中小檗堿提取條件。各因素對(duì)黃連中鹽酸小檗堿提取率的大小影響順序?yàn)椋篊(乙醇濃度)＞A(超聲功率)＞B(超聲時(shí)間),其中乙醇濃度和提取功率的影響極顯著(P＜0.01),超聲時(shí)間的影響顯著(P＜0.05)。

2.3 各因素間交互作用分析

根據(jù)表3方差分析結(jié)果可見(jiàn),影響因素之間B(乙醇濃度)與C(溶液pH)的交互影響極顯著(P＜0.01),其他因素之間的交互作用不顯著。交互顯著項(xiàng)的響應(yīng)面圖和等高線圖如圖6所示。

圖6 兩因素交互作用的響應(yīng)面圖和等高線圖

由圖6可見(jiàn),B、C兩因素的等高線圖呈現(xiàn)橢圓形,響應(yīng)面圖呈現(xiàn)馬鞍形,表明兩者具有顯著的交互作用,與ANOVA方差分析結(jié)果一致。觀察圖中可見(jiàn),沿乙醇濃度方向的曲線密度較大,可見(jiàn)乙醇濃度的變化對(duì)鹽酸小檗堿的提取率有較大影響,符合ANOVA方差分析結(jié)果。

2.4 最優(yōu)工藝條件驗(yàn)證

經(jīng)采用Design-Expert10.0.4軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,黃連中鹽酸小檗堿提取的最優(yōu)工藝條件為超聲功率204.760W,超聲時(shí)間46.744min,乙醇濃度74.442%,預(yù)測(cè)提取率為9.308%。從實(shí)際操作條件出發(fā),調(diào)整最優(yōu)提取工藝為超聲功率210W,超聲時(shí)間47min,乙醇濃度75%,平行提取3次,測(cè)得鹽酸小檗堿提取率為9.10%,與預(yù)測(cè)值相對(duì)誤差為-2.23%,說(shuō)明該工藝條件用于提取黃連中鹽酸小檗堿較可靠。

3 結(jié)論

本研究以市售黃連為原料,采用超聲波輔助乙醇提取法,在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,通過(guò)Box-Behnken設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,各因素對(duì)黃連中鹽酸小檗堿提取率的大小影響順序?yàn)椋篊(乙醇濃度)＞A(超聲功率)＞B(超聲時(shí)間),得到鹽酸小檗堿提取的最優(yōu)工藝條件為超聲功率204.760W,超聲時(shí)間 46.744min,乙醇濃度74.442%,預(yù)測(cè)提取率為9.308%,為超聲波輔助提取黃連中鹽酸小檗堿工藝提供一定的科學(xué)依據(jù)。