魏優(yōu)蕾 郭曉彤

摘要：非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）患者進(jìn)行靶向治療前需要鑒定多種生物標(biāo)志物，包括EGFR、ALK、ROS-1和PD-L1，通常經(jīng)手術(shù)、穿刺等途徑獲取樣本。液體檢測是目前新興的腫瘤標(biāo)記物檢測方法，它可以從血漿中提取出循環(huán)系統(tǒng)中的腫瘤DNA（ctDNA），具有低風(fēng)險(xiǎn)、取樣簡單、術(shù)后不適感少等優(yōu)點(diǎn)。常用的液體活檢方法有定量聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）、數(shù)字PCR技術(shù)、新一代測序技術(shù)（NGS）。本文簡要地闡述了上述分析方法的研究進(jìn)展及未來應(yīng)用方向。

關(guān)鍵詞：肺癌;腫瘤標(biāo)志物;液體檢測

中圖分類號：R734.2? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2019.07.014

文章編號：1006-1959（2019）07-0039-05

Abstract：Non-small cell lung cancer （NSCLC） patients need to identify a variety of biomarkers， including EGFR， ALK， ROS-1 and PD-L1， before they are targeted. Usually， the samples are obtained by surgery， puncture and other means. Liquid detection is an emerging method for detecting tumor markers. It can extract tumor DNA （ctDNA） from the circulatory system from plasma， and has the advantages of low risk， simple sampling， and less postoperative discomfort. Commonly used liquid biopsy methods are quantitative polymerase chain reaction （PCR）， digital PCR technology， and next-generation sequencing technology （NGS）. This paper briefly describes the research progress and future application directions of the above analytical methods.

Key words：Lung cancer;Tumor markers;Liquid detection

目前個(gè)體化醫(yī)療模式已經(jīng)徹底改變了肺癌的診斷和治療方式。明確腫瘤病理類型，采取相應(yīng)最佳治療方案是肺癌治療的基本準(zhǔn)則。生物標(biāo)志物的檢測對于免疫、靶向等治療至關(guān)重要，其中包括目前比較熱門的EGFR、ALK和ROS -1等。雖然肺癌的診斷和治療方面已經(jīng)取得了重大進(jìn)展，但肺癌的延遲診斷問題日益凸顯[1]。晚期（ⅢB-Ⅳ）非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）患者在肺癌分期總?cè)巳褐姓加懈弑壤?。?xì)胞學(xué)標(biāo)本或組織是唯一可用于形態(tài)學(xué)診斷和分子評估的材料[2，3]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，高達(dá)30%的晚期NSCLC患者難以獲取有效活組織標(biāo)本[4]。在此條件下進(jìn)行標(biāo)志物檢測極具挑戰(zhàn)性而非侵入性“液體活檢”技術(shù)可以避免上述問題，并且具有應(yīng)用范圍廣、快速高效、低操作風(fēng)險(xiǎn)等優(yōu)勢[5]。血漿來源的循環(huán)腫瘤DNA（ctDNA）是目前許多研究用于非小細(xì)胞肺癌患者的主要樣本來源[6-11]，通過液體活檢技術(shù)對血漿ctDNA進(jìn)行EGFR檢測;應(yīng)用血漿ctDNA檢測外顯子20 EGFR點(diǎn)突變（p.T790M）的耐藥情況。上述實(shí)驗(yàn)表明液體活檢技術(shù)可以用于指導(dǎo)酪氨酸激酶抑制劑（TKI）用藥。主要缺點(diǎn)是血液樣本中ctDNA含量較低，僅占總細(xì)胞游離DNA的<0.5%[12]。因此需要提高靈敏度技術(shù)避免假陰性風(fēng)險(xiǎn)、詳細(xì)的臨床驗(yàn)證減少假陽性情況的發(fā)生。本綜述的目的是提供目前用于肺癌患者ctDNA分析臨床實(shí)踐方法的最新信息。

1 ctDNA的檢測方法

1.1 ctDNA的收集和提取? 液體活檢獲得數(shù)據(jù)質(zhì)量的高低取決于以下3個(gè)關(guān)鍵步驟：抽血、ctDNA離心和ctDNA提取。

抽血和血漿分離的間隔時(shí)間至關(guān)重要[13]，在同一實(shí)驗(yàn)室內(nèi)分析樣本有助于縮短抽血、ctDNA離心和ctDNA提取之間的周轉(zhuǎn)時(shí)間。采集管建議使用含EDTA的試管（Vacutainer，BD，Plymouth，UK）以避免凝血，采血量最多10 ml。在外部機(jī)構(gòu)中收集樣本時(shí)，建議使用具有不含甲醛的防腐劑、減少非腫瘤循環(huán)細(xì)胞釋放基因組DNA、抑制ctDNA降解、在室溫下儲存樣品等優(yōu)點(diǎn)的PAXgene Blood DNA管（Qiagen，Hilden，Germany）或Cell-Free DNA BCT管（Streck，La Vista，NE，USA）[14，15]。Toro PV等的研究所證明[14]，BCT管可以防止細(xì)胞在抽血后7 d內(nèi)溶解，效果較PAXgene管好。

采血后關(guān)鍵點(diǎn)在于收集后1 h內(nèi)離心血漿。ctDNA具有15 min的半衰期，快速離心能確保獲取的血漿和/或血清中具有足夠量的ctDNA，避免假陰性的風(fēng)險(xiǎn)。通常可進(jìn)行2次離心（2300 rpm，10 min）獲得1.2 ml血漿。也有關(guān)于3次離心的報(bào)道，如Page K等[16]進(jìn)行3次離心（條件依次為：1000 g，4℃ 10 min;1000 g或2000 g或10000 g，4℃，10 min;1000 g，室溫，5 min。有研究對11種提取ctDNA的方法進(jìn)行評估[17，18]，其推薦3種具有高準(zhǔn)確度和重復(fù)性的試劑盒：QIAamp循環(huán)核酸試劑盒（Qiagen）、Norgen血漿/血清循環(huán)DNA純化迷你試劑盒、Norgen lasma / Serum無細(xì)胞循環(huán)DNA純化迷你試劑盒（Norgen，Thorold，ON，Canada）。

1.2定量聚合酶鏈反應(yīng)? 實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）技術(shù)是檢測ctDNA常見方式。在此基礎(chǔ)上加以改進(jìn)，可提高ctDNA檢測的敏感性和特異性[19]。

改良PCR技術(shù)的擴(kuò)增阻礙突變系統(tǒng)（ARMS）。ARMS核心在于突變特異性探針，該探針由連接到3'和5'末端的熒光團(tuán)和猝滅劑組合而成。存在突變的時(shí)，探針與靶位點(diǎn)結(jié)合發(fā)生聚合酶反應(yīng)，促使熒光團(tuán)和猝滅劑分離，熒光含量增加后對其檢測和測量;反之，熒光標(biāo)記物難以測出[20]。在此基礎(chǔ)上可通過添加等位基因特異性Scorpion引物（ARMS/S）進(jìn)一步改進(jìn)PCR技術(shù)。這些Scorpion引物具有莖環(huán)部分，莖環(huán)上有熒光團(tuán)和猝滅劑。環(huán)序列與PCR產(chǎn)物互補(bǔ)，促使莖環(huán)的解折疊，在PCR擴(kuò)增的退火/延伸階段期間產(chǎn)生熒光[21]。例如：肽核酸（PNA）能夠選擇性聚集突變PCR產(chǎn)物，抑制野生型等位基因的擴(kuò)增[22]。

ARMS/S技術(shù)用于ctDNA中EGFR突變檢測的具有較高的特異性和較低的靈敏性。Kimura H等[23]將此項(xiàng)技術(shù)應(yīng)用于42例NSCLC患者的配對的腫瘤血清樣品中，僅發(fā)現(xiàn)3例不一致病例，證實(shí)ARMS/S技術(shù)的具有高度特異性;IPASS研究表明ARMS/S具有高特異性（100%，ctDNA無假陽性結(jié)果）而EGFR突變靈敏度較低（43.1%），可能由使用血清樣本替換血漿樣本造成的差異[24];Douillard JY等[25]分析了從NSCLC患者血漿樣本中提取的ctDNA，靈敏度為65.7%。因此以血漿代替血清為介質(zhì)可以減少假陰性結(jié)果，提高檢測的靈敏度。

此外，PNA改良的ARMS/S技術(shù)可顯著提高ctDNA檢測的靈敏性及特異性。Karachaliou N等[6]提出PNA介導(dǎo)的5'核酸酶實(shí)時(shí)PCR（TaqMan）具有78%的靈敏度和100%的特異性;Pasquale R等人采用的PNA鉗技術(shù)[26]，結(jié)果證實(shí)特異性為100%，靈敏度為65.4%;Thress KS等[27]實(shí)驗(yàn)報(bào)告了EGFR突變的高敏感性（82%～87%）和特異性（97%），同時(shí)也獲得了耐藥點(diǎn)突變p.T790M的較低靈敏度（73%）和特異性（67%）。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果印證ARMS/S技術(shù)能夠有效提高PCR檢驗(yàn)報(bào)告的質(zhì)量。

1.3數(shù)字PCR技術(shù)? 數(shù)字PCR（dPCR）是一種能夠在單分子水平上進(jìn)行鑒定和定量各種突變基因的新技術(shù)。該技術(shù)通過熒光探針對目標(biāo)序列進(jìn)行拷貝并實(shí)現(xiàn)量化[28]。到目前為止已經(jīng)研發(fā)了多種型號，包括數(shù)字液滴PCR（ddPCR）、數(shù)字固體PCR（dPCR）和微珠、乳液、擴(kuò)增和磁性（BEAMing）[29]。

dPCR在血漿檢測ctDNA相關(guān)標(biāo)記物特異性和敏感性的相關(guān)研究。Yung TK等[30]使用dPCR方法從EGFR外顯子19缺如以及外顯子21 p.L858R的血漿樣品中提取的ctDNA并進(jìn)行檢測。通過與組織樣本比較，血漿樣本能夠?qū)崿F(xiàn)92%的敏感性和100%的特異性。結(jié)果表明dPCR檢測血漿ctDNA具有一定的敏感性和特異性。

然而，Sacher AG等[31]從兩組患者的血漿樣本中提取ctDNA并行ddPCR檢測。其中一組為基線測試的患者，另一組為疾病進(jìn)展評估的患者。從基線組群中的組織進(jìn)行活檢，活檢分兩種情況：初始組織活檢和疾病進(jìn)展的組織再次活檢。最終獲得的結(jié)果與從ctDNA樣品獲得的結(jié)果進(jìn)行比較。對EGFR敏感和KRAS突變的特異性和陽性預(yù)測值高達(dá)100%，而敏感性為64%至86%。對于EGFR p.T790M突變的敏感性、特異性和陽性預(yù)測值分別為77%、63%、79%;Thress KS等采用BEAMing法[27]證實(shí)在變異試驗(yàn)中，EGFR外顯子19缺如的cobas EGFR與外顯子21 p.L858R的cobas? EGFR有相同的靈敏度和特異性。與cobas? EGFR變異試驗(yàn)相比，BEAMing對p.T790M突變的ctDNA檢測有更高的靈敏性（81%）和更低的特異性（58%）。因此dPCR在血漿檢測靈敏性和特異性與檢測相關(guān)標(biāo)記物不同而有所差異。

Oxnard GR等[32]應(yīng)用BEAMing法提取ctDNA樣本，對血漿基因分型和腫瘤中心組織分析結(jié)果比較，表明p.T790M的ctDNA檢測靈敏度為70%，特異性為69%。猜測組織腫瘤樣本中p.T790M突變的變異組織分布差異導(dǎo)致了檢測的低特異性[32，33]。隨后他們通過正交分析驗(yàn)證上述猜想：在18個(gè)不一致病例中78%的患者存在p.T790M突變（血漿陽性/組織陰性）。結(jié)果證實(shí)血漿ctDNA分析法具有低靈敏度和假陰性的可能性。因此，建議dPCR對血漿標(biāo)本pt790M陰性的患者進(jìn)行多次檢測以降低假陰性的發(fā)生率。

1.4下一代測序技術(shù)? 近年研究已經(jīng)將下一代測序技術(shù)（NGS）應(yīng)用于液體活檢領(lǐng)域。NGS 是一種高通量方法，能夠在一次運(yùn)行中同時(shí)對不同患者的不同基因靶點(diǎn)進(jìn)行快速測序[34，35]。NGS的基本工作流程按照DNA庫的生成、單個(gè)片段的克隆擴(kuò)增、大規(guī)模平行測序和數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析的順序進(jìn)行[36，37]。用NGS對血漿ctDNA檢測相關(guān)研究層出不窮，隨著研究深入，NGS技術(shù)在液體活檢領(lǐng)域逐步改良并趨于成熟。

用個(gè)體化基因組測序儀（PGM）從血漿樣品中提取的測序的ctDNA，并以腫瘤組織樣本中鑒定的DNA突變作為參考，得出結(jié)論：NGS的敏感性為58%，特異性為87%[38]。表明NGS在ctDNNA檢測中具有較低的靈敏度和較高的特異性。NReckamp KL等[39]用短足突變增加NGS聚集進(jìn)而改良NGS技術(shù)并取得更佳的檢測靈敏性和特異性（p.T790M、p.L858R和外顯子19缺如的靈敏度分別為93%、100%和87%）。由此改善了液體活檢分析的性能。

此外，NGS技術(shù)還有其特有優(yōu)勢。Paweletz CP等[40]進(jìn)行了定向NGS測定實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示定向NGS不僅能夠使目標(biāo)讀數(shù)最大化，還能使血漿來源的ctDNA中的偽影最小化;通過使用ddPCR和靶向NGS這兩種方法，對29例EGFR和KRAS已知突變狀態(tài)的患者的ctDNA血漿樣本（組織分析）進(jìn)行分析，結(jié)果顯示EGFR和KRAS的敏感性分別為86%和79%。值得注意的是，NGS測定法對兩種類型突變的特異性均高達(dá)100%;最后對48例病例含有62種目前已知的突變因子患者分析，結(jié)果顯示此方法的驅(qū)動突變敏感性為77%、耐藥突變的敏感性為100%。研究結(jié)果證實(shí)NGS檢測血漿ctDNA的靈敏度雖然欠佳，但在精確性、特異性較為可靠，尤其是在EGFR和KRAS相關(guān)突變的敏感性等方面具有良好的表現(xiàn)。Newman AM等[41]通過深度測序（CAPP-Seq）法分析在NSCLC的不同階段收集的血漿中的ctDNA結(jié)果表明Ⅰ期腫瘤的診斷敏感性為50%，Ⅱ-Ⅳ期腫瘤為100%，所有階段的總體敏感性為85%、特異性為96%。NGS技術(shù)可應(yīng)用于不同階段肺癌患者，結(jié)果比較可靠準(zhǔn)確。

上述研究證實(shí)了使用靶向NGS檢測肺癌中的ctDNA的可行性，尤其是在初始分子評估和監(jiān)測等方面表現(xiàn)出良好的敏感性和特異性，并且具有多樣本平行檢測、檢測速度快和適用范圍廣等特點(diǎn)。

2對ctDNA中的EGFR突變結(jié)果的分析

警惕ctDNA測定的低敏感性（組織陽性患者出現(xiàn)的假陰性結(jié)果）和特異性（組織陰性患者出現(xiàn)的假陽性結(jié)果）情況。在復(fù)發(fā)的腫瘤組織中，p.T790M突變的異質(zhì)性分布限制了ctDNA檢測的準(zhǔn)確性[42，43]。腫瘤異質(zhì)性分布影響檢測結(jié)果質(zhì)量;在AURA實(shí)驗(yàn)中，血漿來源的ctDNA中檢測為p.T790M陰性，而組織樣本中p.T790M陽性，但陽性結(jié)果組具有更高的客觀反應(yīng)率和更長的中位無進(jìn)展生存期[32，33]。血漿假陰性結(jié)果干擾ctDNA檢測的可靠性。

盡管存在上述問題，血漿檢測法在EGFR活化或耐藥性突變等方面的檢測還是非?？煽康摹Ｍㄟ^正交技術(shù)進(jìn)行重復(fù)檢測可輕易地避免假陰性結(jié)果的問題[42]。因此，在進(jìn)行液體活檢后，p.T790M ctDNA陽性的患者可以進(jìn)行第三代TKI（例如osimertinib）治療，而陰性結(jié)果的患者則應(yīng)進(jìn)行重復(fù)檢測，以排除假陰性結(jié)果的可能性。

3總結(jié)及展望

診斷延遲是當(dāng)今干擾肺癌治療重要問題之一，直接影響肺癌的早期治療措施的實(shí)施，進(jìn)而造成較差的預(yù)后;組織活檢法和細(xì)胞學(xué)活檢法在診斷晚期NSCLC方面具有極高的挑戰(zhàn)性。主要原因在于組織活檢不能取到有效的能夠反映疾病類型的組織樣本，細(xì)胞學(xué)活檢則通常情況下很難取到有意義的組織細(xì)胞。而ctDNA液體活檢法可以有效地解決上述問題。采用高靈敏度檢測技術(shù)能夠有效限制液體活檢法的假陰性和假陽性結(jié)果的產(chǎn)生。定量PCR（qPCR）是目前比較推崇的方法，并且近期的幾項(xiàng)臨床試驗(yàn)同樣證明了液體活檢在評估NSCLC患者EGFR突變中發(fā)揮了重要作用。盡管如此，由于血液中突變等位基因的含量低，該方法可能會因低敏感性而影響其結(jié)果可靠性。但是在未來，我們希望NGS這樣的尖端技術(shù)能夠消除這種限制，能夠在更多的患者中同時(shí)識別更多類型的基因突變（ALK、ROS-1、RET易位、BRAF突變、MET 外顯子14缺如）、融合和易位。使腫瘤學(xué)家夠以此鑒定腫瘤學(xué)標(biāo)志物，并為NSCLC患者定制個(gè)體化治療方案。

雖然本次綜述重點(diǎn)敘述了肺癌患者ctDNA的主要方法，并將無創(chuàng)檢測法應(yīng)用并擴(kuò)展到NSCLC患者的診斷、治療及管理的不同環(huán)境中（如治療效果、并發(fā)癥、復(fù)發(fā)情況的跟蹤監(jiān)測等）。但不能排除體液中其他診療相關(guān)的生物學(xué)靶點(diǎn)在肺癌治療中的作用，如循環(huán)中的腫瘤細(xì)胞、血小板相關(guān)核酸以及與腫瘤相關(guān)的其他成分（如尿液、痰液和體液）。

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收稿日期：2019-1-4;修回日期：2019-1-13

編輯/肖婷婷