段貴嬌，張健偉，張志彬，駱延平

(廣東環(huán)凱微生物科技有限公司，廣東 廣州，510663)

食品添加劑是為改善食品品質(zhì)和色、香、味,以及為防腐、保鮮和加工工藝的需要而加入食品中的物質(zhì)。我國(guó)基于相應(yīng)原則制定了關(guān)于食品添加劑的使用標(biāo)準(zhǔn)，規(guī)定食品添加劑的最大使用量及其最大殘留量[1]。盡管國(guó)家有相關(guān)規(guī)定，但濫用食品添加劑仍時(shí)有發(fā)生，引發(fā)人們對(duì)于食品安全的擔(dān)憂。

傳統(tǒng)檢測(cè)食品添加劑的方法包括高效液相色譜(HPLC)[2]、液質(zhì)聯(lián)用(LC-MS)[3]、氣相色譜(GC)[4]及氣質(zhì)聯(lián)用(GC-MS)[5]等。這些方法靈敏度高、重復(fù)性好，但操作復(fù)雜、檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)、易損傷樣品。隨著社會(huì)的發(fā)展，人們?cè)絹碓娇释芊奖恪⒖焖賹?duì)食品添加劑進(jìn)行檢測(cè)，近年來迅猛發(fā)展的表面增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)恰好滿足了這一需求。

20世紀(jì)初，印度科學(xué)家C.V.拉曼(Raman)發(fā)現(xiàn)了拉曼散射效應(yīng)，可根據(jù)其進(jìn)行物質(zhì)的分析，但拉曼散射效應(yīng)極其微弱，難以準(zhǔn)確捕捉到拉曼信號(hào)，因此限制了拉曼光譜的發(fā)展。經(jīng)過半個(gè)世紀(jì)的發(fā)展，1974年, FLEISCHMAN等[6]發(fā)現(xiàn)吸附在粗糙銀電極表面上的單分子層吡啶具有異常增強(qiáng)的拉曼信號(hào)。之后隨著技術(shù)的不斷發(fā)展，研究者們發(fā)現(xiàn)在納米貴金屬表面或者顆粒體系能夠使得拉曼信號(hào)得到顯著的增強(qiáng)，即表面增強(qiáng)拉曼效應(yīng)(surface enhanced raman scattering, SERS)，進(jìn)而大力促進(jìn)了拉曼光譜在化學(xué)分析中的應(yīng)用。由于其可提供目標(biāo)分子的指紋圖譜(高特異性)，具有操作簡(jiǎn)單、儀器易便攜化、用量少、不損壞樣品、靈敏度高等特點(diǎn)，在醫(yī)療衛(wèi)生、食品安全(如圖1)、案件偵查等領(lǐng)域有著非常廣闊的應(yīng)用前景。本文主要講述了表面增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)在檢測(cè)食品非法添加劑方面的應(yīng)用，綜合了幾年來熱點(diǎn)新聞報(bào)道的食品安全問題，將各種非法添加劑按照其化學(xué)及藥理性質(zhì)進(jìn)行分類，主要從豬肉、牛羊肉及肝臟中的β-受體激動(dòng)劑，豬肉、禽肉和動(dòng)物性水產(chǎn)品中的硝基呋喃類藥物，水產(chǎn)品中孔雀石綠，肉類產(chǎn)品中鎮(zhèn)定劑，乳制品中的三聚氰胺這五個(gè)方面進(jìn)行闡述。

圖1 表面增強(qiáng)拉曼光譜在食品添加劑檢測(cè)中的應(yīng)用Fig.1 The application for SERS in the detection of food additives

1 豬肉、牛羊肉及肝臟中的β-受體激動(dòng)劑

β-受體激動(dòng)劑一般都具有舒張氣管平滑肌的作用，在醫(yī)學(xué)上用來治療哮喘等氣管性疾病，當(dāng)此類藥物用于畜牧業(yè)時(shí)，有明顯的促進(jìn)生長(zhǎng)、提高瘦肉率及減少脂肪的作用，因此這類藥物常被當(dāng)做瘦肉精來使用。由于其適用范圍及安全性，目前國(guó)際上各國(guó)頒布的限制法令不盡相同，而我國(guó)已明確限制其在畜牧業(yè)中使用，本文主要詳述了鹽酸克侖特羅、苯乙醇胺A及萊克多巴胺3種非法添加劑的檢測(cè)。圖1是幾種常見β-受體激動(dòng)劑的分子結(jié)構(gòu)，由圖1可以看出，它們都均有苯環(huán)等具有較強(qiáng)拉曼信號(hào)的官能團(tuán)，因此可以利用SERS來對(duì)其進(jìn)行高特異性和高靈敏度的檢測(cè)。

圖2 幾種β-受體激動(dòng)劑的分子結(jié)構(gòu)Fig.2 The molecular structure of several β-receptor agonists

1.1 鹽酸克侖特羅

鹽酸克侖特羅俗稱瘦肉精，添加在飼料或飲用水中可明顯提升瘦肉率，而人食用這種肉后可能導(dǎo)致中毒。我國(guó)自2002年9月10日起禁止在飼料及動(dòng)物飲用水中使用該添加劑。李明心等[7]創(chuàng)建了以膠體Au納米顆粒和Au@Ag核殼納米顆粒為基礎(chǔ)的表面增強(qiáng)拉曼光譜免疫層析分析法(SERS-ICA)，并將其用于對(duì)鹽酸克倫特羅的高靈敏度檢測(cè)；其中鹽酸克倫特羅檢測(cè)的靈敏度為0.01 ng/mL，檢出限為6×10-5ng/mL。甘盛等[8]以納米銀(AgNPs)溶膠為SERS基底檢測(cè)鹽酸克倫特羅等β-受體激動(dòng)劑于給藥和停藥期間在豬尿液、毛發(fā)和組織中等的濃度；其中鹽酸克倫特羅等幾種瘦肉精在標(biāo)準(zhǔn)溶液中的檢出限0.05 μg/L，尿液、血液中為1 μg/mL， 糞便、毛發(fā)以及肌肉等組織為1 μg/kg；該檢測(cè)方法便捷靈敏，適用于研究β-受體激動(dòng)劑在生豬體內(nèi)的代謝。XIE等[9]以Au-MBA@Ag-Ab為探針，預(yù)處理時(shí)溶液中游離的鹽酸克侖特羅與預(yù)先涂布在ICA條帶上的鹽酸克侖特羅競(jìng)爭(zhēng)性地與抗原結(jié)合，隨后通過檢測(cè)測(cè)試線上SERS強(qiáng)度來檢測(cè)鹽酸克侖特羅含量；該實(shí)驗(yàn)檢測(cè)鹽酸克侖特羅的IC50和檢測(cè)限(LOD)值分別為0.02 ng/mL和0.24 pg/mL，且實(shí)驗(yàn)一般在15 min內(nèi)就可以完成，可以達(dá)到快速、靈敏的檢測(cè)效果。

1.2 苯乙醇胺A

苯乙醇胺A(PA)亦可被稱之為瘦肉精，在我國(guó)同樣禁止添加于動(dòng)物飼料及飲用水中。LI等[10]以Au-MBA@Ag-Ab 為探針，與苯乙醇胺A特異性結(jié)合后，通過SERS檢測(cè)到PA。這種新型的免疫層析法(ICA)的IC50及LOD值分別為0.06 ng/mL和0.32 pg/mL，能快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)尿液樣品中的PA，也可用于其他食品添加劑的檢測(cè)。

1.3 萊克多巴胺

萊克多巴胺作為一種新型人工合成的β-受體激動(dòng)劑，作用與鹽酸克侖特羅、苯乙醇胺A類似，也屬于瘦肉精的一種，我國(guó)自2011年12月5日起禁止生產(chǎn)、銷售該物質(zhì)。竇斌[11]以55 nm的納米金(AuNPs)溶膠作為SERS活性基底，檢測(cè)豬毛提取液中的萊克多巴胺；在堿性條件下,沙丁胺醇的檢測(cè)限達(dá)到50 ng/mL。翟福麗等[12]以AuNPs為SERS基底，檢測(cè)豬尿樣中的萊克多巴胺，得出標(biāo)準(zhǔn)溶液的最低檢測(cè)濃度為0.1 mg/mL， 分析時(shí)間小于30 min，基本滿足迅速、靈敏地檢測(cè)萊克多巴胺。YU等[13]以AuNPs為SERS活性基底，將其與鹽酸克倫特羅及萊克多巴胺兩種物質(zhì)的抗體結(jié)合，進(jìn)而檢測(cè)到游離的鹽酸克倫特羅和萊克多巴胺；在該實(shí)驗(yàn)中兩種檢測(cè)物競(jìng)爭(zhēng)性地與納米探針結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了多重抗體的SERS檢測(cè)；該方法的檢測(cè)限(LOD)為1.0 pg/mL，在食品添加劑檢測(cè)方面具有很大的應(yīng)用潛力。

表1 SERS檢測(cè)3種β受體激動(dòng)劑類藥物分子的比較Table 1 Comparison of three β-receptor agonist drugs

2 豬肉、禽肉和動(dòng)物性水產(chǎn)品中的硝基呋喃類藥物

硝基呋喃類藥物作為廣譜抗生素，對(duì)大多數(shù)細(xì)菌、真菌及病原體有強(qiáng)烈的殺滅作用。但該類藥物及其代謝產(chǎn)物對(duì)人體有致癌和致畸胎的副作用，因此我國(guó)于2010年將呋喃它酮、呋喃妥因、呋喃唑酮、呋喃西林4種硝基呋喃類藥物列為違法添加劑。XIE等[14]以50 nm的AuNPs為SERS活性基底，通過特征性SERS峰對(duì)呋喃丹寧和呋喃他酮進(jìn)行SERS定性分析；在1 420 cm-1和1 456 cm-1處的峰可以用來區(qū)分混合物中的兩種化合物；在最佳條件下，檢測(cè)限可達(dá)5 ppm。竺芯宇等[15]分別用Au溶膠和Fe3O4@Ag(Ag殼厚度為40 nm左右)為基底檢測(cè)4種硝基呋喃類藥物(N1呋喃唑酮，N2呋喃妥因，N3呋喃西林，N4呋喃他酮)；以Au溶膠為基底時(shí)N1、N2、N4的檢測(cè)限最低可至5 ppm，由于N3的結(jié)構(gòu)特殊性無法與Au結(jié)合，導(dǎo)致無法檢測(cè)出；以Fe3O4@Ag為基底時(shí)四種物質(zhì)檢測(cè)限最低可達(dá)0.1 ppm。呋喃他酮一般難以直接檢測(cè)，但是其代謝產(chǎn)物5-甲基嗎啉-3-氨基-2-惡唑烷基酮(AMOZ)能通過SERS進(jìn)行檢測(cè)，LI等[16]制備了針對(duì)AMOZ和4-巰基苯甲酸(MBA)雙重標(biāo)記的膠體GNP(如Ab-Au-MBA)的單克隆抗體(mAb)用作免疫探針，能快速測(cè)定AMOZ；該法的IC50值和檢測(cè)限(LOD)分別為0.04 ng/mL和0.28 pg/mL，該免疫探針與其他3種硝基呋喃類藥物沒有交叉反應(yīng)性。利用SERS對(duì)豬肉、禽肉和動(dòng)物性水產(chǎn)品中硝基呋喃類藥物進(jìn)行檢測(cè)，可以實(shí)現(xiàn)快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)，并且靈敏度高、特異性強(qiáng)，故可廣泛應(yīng)用于食品添加劑的檢測(cè)。

3 水產(chǎn)品中孔雀石綠

孔雀石綠是人工合成的有機(jī)化學(xué)物質(zhì)，對(duì)細(xì)菌、真菌以及病原體等有一定的殺滅作用，可用于水產(chǎn)養(yǎng)殖[17]。但孔雀石綠長(zhǎng)期超量的使用會(huì)對(duì)人體有致癌作用，故此我國(guó)明令禁止添加[18]。余婉松[19]以55 nm金溶膠為SERS活性基底，對(duì)7種不同魚肉(羅非魚，鯧魚、烏鱧、草魚、鯽魚、魚、花鰱)中孔雀石綠及其代謝物進(jìn)行檢測(cè)，靈敏度在2～10 ng/g，相比傳統(tǒng)的色譜法，具有快速，無需特殊樣品前處理等復(fù)雜步驟。顧振華等[20]利用孔雀石綠的拉曼光譜特征峰(432～437 cm-1、1 166～1 170 cm-1、1 613～1 617 cm-1)及其強(qiáng)度,快速對(duì)孔雀石綠進(jìn)行定性定量檢測(cè)，檢測(cè)限為5.0 μg/L，相比傳統(tǒng)的方法，具有特異性強(qiáng)，抗干擾能力好等優(yōu)點(diǎn)。SUN等[21]設(shè)計(jì)制備具有PMMA/Ag/石墨烯/Ag/石墨烯雜化結(jié)構(gòu)的高柔韌性且高靈敏度的SERS薄膜，可直接與待測(cè)樣品進(jìn)行吸附；試驗(yàn)中以其為SERS基底，檢測(cè)魚表皮的孔雀石綠的含量，5 min內(nèi)完成檢測(cè)，且靈敏度高達(dá)10-7mol/L，非常適用于食品添加劑的檢測(cè)，由于石墨烯的引入，穩(wěn)定了貴金屬納米銀的性質(zhì)，得到了更加穩(wěn)定的拉曼增強(qiáng)信號(hào)，在保證靈敏度的同時(shí)，大大增強(qiáng)了檢測(cè)的重現(xiàn)性。

4 肉類產(chǎn)品中鎮(zhèn)定劑

鎮(zhèn)定劑具有抗焦慮、鎮(zhèn)定、改善抑郁癥及改善睡眠質(zhì)量的功效，吩噻嗪類藥物作為其中一種，在我國(guó)動(dòng)物源性食品中禁止檢出，但因其能有效降低動(dòng)物運(yùn)輸過程中的死亡率且間接起到增肥作用，仍有不法商人使用，因此高效監(jiān)測(cè)肉類食品中鎮(zhèn)定劑變得愈加迫切。

目前，國(guó)內(nèi)外已有吩噻嗪類藥物及其代謝物的相關(guān)報(bào)道。如魏晉梅等[22]應(yīng)用高分辨率液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)測(cè)定牛肉中包括氯丙嗪、乙酰丙嗪及甲苯噻嗪在內(nèi)的24種鎮(zhèn)靜劑類獸藥殘留量，各藥物的LODs在0.2～2.5 μg/kg，定量限(LOQ)在0.5～5 μg/kg。孫雷等[23]利用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC-MS/MS)檢測(cè)豬肉和豬腎中殘留的10種鎮(zhèn)靜劑類藥物，檢出限為0.5 μg/kg。FLEISCHMANN等[6]應(yīng)用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)檢測(cè)豬組織中4種鎮(zhèn)定劑含量，檢出限在0.5～10 μg/kg。齊士林等[24]利用超高效液相色譜-電噴霧電離質(zhì)譜(UPLC-ESIMS/MS)對(duì)動(dòng)物源食品中氯丙嗪、異丙嗪及其代謝物做了測(cè)定，檢出限在0.3～1.5 μg/kg。此外，吳寧鵬等[25]利用超高效液相色譜-串聯(lián)四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜法(UPLC-QTOF)篩查飼料中11種鎮(zhèn)靜劑類藥物，飼料基質(zhì)中檢出限為0.1 mg/kg。盡管有檢測(cè)方法眾多，但靈敏度普遍不高，難以滿足肉類食品中添加劑的檢測(cè)需求。

而SERS技術(shù)靈敏度高、檢測(cè)快速且簡(jiǎn)便，將SERS技術(shù)應(yīng)用到肉類食品中鎮(zhèn)定劑的檢測(cè)將會(huì)極大地提升檢測(cè)的靈敏度和準(zhǔn)確性。目前，SERS技術(shù)用于肉類中鎮(zhèn)定劑的檢測(cè)報(bào)道很少，說明SERS在這方面的研究具有較大的潛力。

5 乳制品中的三聚氰胺

三聚氰胺，俗名蛋白精，因?qū)θ梭w有害，被限制用作食品添加劑。由于食品工業(yè)中蛋白質(zhì)含量的檢測(cè)存在一定缺陷，因此被不法商人用作提升蛋白質(zhì)含量的指標(biāo)，給人們的身心帶來極大的創(chuàng)傷[26-28]。三聚氰胺由于含有三嗪類含氮雜環(huán)結(jié)構(gòu)，SERS信號(hào)比較強(qiáng)，可直接進(jìn)行SERS檢測(cè)。楊欣等[29]為比較牛奶中三聚氰胺表面增強(qiáng)拉曼光譜法與國(guó)標(biāo)法(GB/T 22388—2008/第二法液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法)的差異，分別用表面增強(qiáng)拉曼光譜檢測(cè)法和國(guó)標(biāo)法檢測(cè)牛奶中的三聚氰胺，結(jié)果表明，兩種方法在陽性樣品的判定上結(jié)論一致；其中表面增強(qiáng)拉曼光譜法的平均回收率和精密度分別為117.3%和13.2%，在709 nm左右處出現(xiàn)三聚氰胺特征峰；該方法操作簡(jiǎn)單、方便快捷，可用于收購(gòu)原奶及市場(chǎng)監(jiān)督等環(huán)節(jié)的檢測(cè)。楊青青[30]以銀納米粒子膠體為SERS増強(qiáng)基底來檢測(cè)溶液中的三聚氰胺，以高濃度NaCl為聚沉劑，用NaOH將待測(cè)液pH調(diào)至堿性，實(shí)驗(yàn)中三聚氯胺的線性檢測(cè)量為0.01～4.80 mg/L，相關(guān)系數(shù)為0.998， 回收率為94.4%～102.8%，該方法適用于牛奶及奶粉中三聚氰胺的快速測(cè)定。GIOVANNOZZI等[31]以金納米顆粒為SERS活性基底，定量檢測(cè)液體奶中三聚氰胺的含量，檢測(cè)限為0.17 mg/L，實(shí)驗(yàn)提取程序較少，能有效用于檢測(cè)牛奶中的三聚氰胺。

6 展望

表面增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)雖起步較晚，但因其快速、操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、無損、可定性定量分析等優(yōu)點(diǎn)迅速應(yīng)用于諸多領(lǐng)域。盡管如此，表面增強(qiáng)拉曼色譜仍存在一些問題亟待解決。

就表面增強(qiáng)拉曼色譜發(fā)展歷程來看，從發(fā)現(xiàn)拉曼散射到應(yīng)用SERS技術(shù)經(jīng)歷了半個(gè)多世紀(jì)，直至21世紀(jì)才真正得以廣泛應(yīng)用。究其原因，無外乎兩點(diǎn)：儀器設(shè)備不夠先進(jìn)、SERS理論研究較落后。第一點(diǎn)現(xiàn)如今的科學(xué)技術(shù)已能應(yīng)用SERS技術(shù)進(jìn)行分析檢測(cè)，但發(fā)展空間還很大，比如向更便攜、低成本的方向努力。針對(duì)第二點(diǎn)，目前科學(xué)界提出幾種主要的觀點(diǎn)：基于分子金屬成鍵作用和光誘導(dǎo)電荷轉(zhuǎn)移作用的化學(xué)增強(qiáng)機(jī)制以及基于表面鏡像場(chǎng)、表面等離子體共振和避雷針效應(yīng)的電磁場(chǎng)物理增強(qiáng)機(jī)制，而這兩種觀點(diǎn)還只是理論模型，科學(xué)界尚未達(dá)成共識(shí)，有待后人繼續(xù)努力。而將SERS技術(shù)應(yīng)用于分析領(lǐng)域，關(guān)鍵是制備結(jié)構(gòu)均勻、性質(zhì)穩(wěn)定、增強(qiáng)能力強(qiáng)的基底。傳統(tǒng)的拉曼光譜雖然具有很好的定性能力，但是樣品分子的拉曼信號(hào)一般都很弱，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足樣品分子的痕量檢測(cè)。貴金屬納米粒如金、銀等周圍存在電磁場(chǎng)，當(dāng)樣品分子靠近這個(gè)電磁場(chǎng)的時(shí)候，拉曼信號(hào)被很大程度地增大，從而使極微量的樣品分子也能被檢測(cè)得到，這種現(xiàn)象就是表面增強(qiáng)拉曼現(xiàn)象。但是，由于貴金屬納米粒子周圍磁場(chǎng)分布是不均勻的，在一定程度上，距離納米粒子越近的地方，磁場(chǎng)越強(qiáng)，增強(qiáng)效果越好，而處于溶液狀態(tài)的樣品分子距離納米粒子的距離有大有小，造成了信號(hào)增強(qiáng)能力的差異，此外，納米粒子不同的團(tuán)聚程度，也會(huì)導(dǎo)致磁場(chǎng)分布不均，使檢測(cè)到的拉曼信號(hào)不穩(wěn)定?；谝陨蠁栴}，如果我們將貴金屬納米粒子制備成均勻性好、穩(wěn)定性強(qiáng)的SERS基底，所檢測(cè)到的拉曼信號(hào)將大大增強(qiáng)，同樣地，所制備的拉曼基底如果具有很好的局域表面等離子共振效應(yīng)，具有很強(qiáng)的電磁場(chǎng)，那么得到的檢測(cè)靈敏度也將大大提高。而在檢測(cè)食品添加劑時(shí)，由于SERS基底僅能捕捉到部分基團(tuán)(含有N、S等雜原子，硝基、氨基、羧基等基團(tuán)以及多芳環(huán)或雜環(huán)的大共軛體系)的信號(hào)，而對(duì)其他許多基團(tuán)沒有響應(yīng)，此時(shí)可能利用標(biāo)記拉曼信號(hào)分子的方法來進(jìn)行樣品的檢測(cè)[32-35]。

因此在將來，我們不僅需要克服以上缺點(diǎn)，還應(yīng)加大SERS理論研究，研發(fā)更加方便、快捷和穩(wěn)定的便攜式儀器。如果解決了以上缺點(diǎn)，拉曼由于具有特殊的指紋圖譜(定性好)、原位、無損、快速、靈敏等優(yōu)點(diǎn)，將很好地解決目前檢測(cè)手段中存在的問題，甚至是替代傳統(tǒng)的技術(shù)成為食品安全檢測(cè)中的強(qiáng)有力和主流的技術(shù)手段，如(1)利用便攜式拉曼光譜進(jìn)行食品安全的現(xiàn)場(chǎng)快速篩查；(2)通過光纖的靈活性和傳導(dǎo)性，進(jìn)行食品樣品的遠(yuǎn)程檢測(cè)；(3)進(jìn)行非法食品添加劑種類的快速鑒別；(4)進(jìn)行食品安全的基礎(chǔ)研究，如利用拉曼的原位檢測(cè)和物質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變后產(chǎn)生相應(yīng)的拉曼指紋圖譜的變化，進(jìn)行非法食品添加劑對(duì)人體產(chǎn)生危害的毒性機(jī)理的研究和證明；(5)進(jìn)行非法食品添加劑添加到食物后產(chǎn)生作用的機(jī)理，或者是非法添加劑添加到食品后產(chǎn)生有毒物質(zhì)的機(jī)理等進(jìn)行研究；(6)同時(shí)也可將SERS技術(shù)與其他技術(shù)聯(lián)用，如將SERS與色譜技術(shù)進(jìn)行結(jié)合，即可發(fā)揮SERS定性能力強(qiáng)，靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)，又可結(jié)合色譜的強(qiáng)大分離能力；再如將SERS技術(shù)與微流控芯片技術(shù)進(jìn)行結(jié)合，可實(shí)現(xiàn)檢測(cè)的高靈敏、高特異性、高通量、微型化檢測(cè)，這將使SERS技術(shù)在食品添加劑分析檢測(cè)領(lǐng)域發(fā)揮著越來越大的作用。