徐歡，鄭婭,2，余群力*，林梁，曹暉，韓明山

1(甘肅農(nóng)業(yè)大學 食品科學與工程學院，甘肅 蘭州，730070)2(甘肅省農(nóng)業(yè)科學院，甘肅 蘭州，730070) 3(甘肅祁連牧歌食品工業(yè)股份有限公司，甘肅 張掖，734000) 4(陜西秦寶牧業(yè)發(fā)展有限公司，陜西 寶雞，721000)5(內(nèi)蒙古科爾沁股份有限公司，內(nèi)蒙古 通遼，028000)

牛肝是牛體儲存養(yǎng)料的重要器官，含有豐富的活性物質(zhì)和人體所需的維生素和礦物質(zhì)[1]，不僅能增強人體免疫力，抑制腫瘤細胞的產(chǎn)生，同時還具有抗氧化及防衰老的作用[2]。我國牛肝的產(chǎn)量很大，但是其加工方式原始而且附加值不高[3]，將牛肝加工成臘制品不僅有利于保存還提高了其經(jīng)濟價值。

臘制品是我國特有的傳統(tǒng)發(fā)酵食品，因其色澤美觀、風味獨特、營養(yǎng)豐富、便于貯藏而具有廣闊的消費市場和消費群體[4]。對于腌臘干制品來講，風味是一項極其重要的品質(zhì)指標，備受研究者的廣泛關注。如尚永彪等[5]對川味臘肉各加工階段的揮發(fā)性風味物質(zhì)進行了比較，探究了川味臘肉風味形成的初步規(guī)律。粟桂蓉等[6]對傳統(tǒng)土家臘肉加工過程中的揮發(fā)性風味成分進行了分析，發(fā)現(xiàn)不同種類的物質(zhì)在加工過程中都發(fā)生了相應的變化。生肉幾乎沒有香味只是略帶血腥味[7]，但臘肉風味獨特，聞名于世，因為風味在其制作過程中經(jīng)歷了一個復雜的過程。郭兆斌等[8]對不同牛種肝臟的揮發(fā)性化合物含量進行了分析，發(fā)現(xiàn)醛類和烴類為其主體揮發(fā)性化合物。黨欣等[9]研究表明，牛肝中與脂肪氧化有關的揮發(fā)性化合物，犢牦牛的含量明顯高于成年牦牛。目前，針對新鮮牛肝揮發(fā)性風味物質(zhì)的研究較多，但臘牛肝在加工過程中揮發(fā)性物質(zhì)變化分析這方面的研究尚未報道。

本文采用固相微萃取(HS-SPME)與氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)聯(lián)用技術，分析臘牛肝在加工過程中揮發(fā)性風味物質(zhì)的組成及變化規(guī)律，并探討各階段的風味物質(zhì)種類及特點，以期為臘牛肝風味品質(zhì)評價、風味品質(zhì)控制與改進等技術奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

隨機選擇發(fā)育正常、健康無病的 6頭張掖地區(qū)肉牛(西門塔爾雜交牛，24 月齡)為試驗對象。宰后取肝，洗去表面血跡和污物，除去脂肪等物質(zhì)，于-18 ℃冰箱中冷凍保藏，待用；食鹽，中鹽榆林鹽化有限公司；白砂糖、味精、花椒粉、五香粉等，哈爾濱康源食品原料有限公司；NaNO2，食品級，成都金山化學試劑有限公司。

試劑：NaCl(分析純)，天津光復科技發(fā)展有限公司。

1.2 儀器與設備

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國Agilent公司(Agilent 6890 GC-5973MSD)；固相微萃取器(SPME)，美國SUPELCO公司(50/30 μm DVB/CAR/PDMS)；PB203-N電子天平，上海精密科學儀器有限公司；HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋，金壇市富華儀器有限公司；LHS-150SC恒溫恒濕培養(yǎng)箱，上海一恒科學儀器有限公司；DW-25W518冰箱，青島海爾電器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 臘牛肝加工流程[10]

原料預處理→修整切形→腌制→臘制→成品

1.3.2 臘牛肝操作要點

將分割好的牛肝平均分為3組，對其進行臘牛肝的加工，具體操作方法見表1。

表1 臘牛肝操作要點Table 1 cured bovine liver operation points

1.3.3 取樣

在加工過程中第0、1、2、3、4 d時每組分別取50 g 臘牛肝樣品，其中0 d的樣品為新鮮牛肝，1～2 d為腌制過程，3～4 d為臘制過程。將取好的樣品切成末，置于100 mL萃取瓶中，-80 ℃下凍藏，待用。

1.3.4 揮發(fā)性風味物質(zhì)的測定

肉樣解凍后在萃取瓶中加入20%的NaCl，并將萃取瓶在80 ℃水浴鍋中加熱40 min；采用頂空固相微萃取方式采集揮發(fā)性化合物，在40 ℃恒溫條件下，用手動SPME進樣器吸附30 min，之后進行GC-MS檢測。

色譜條件：TG-WAX色譜柱(60 m×0.25 mm×0.5 μm)；進樣口溫度220 ℃；升溫程序：初溫45 ℃保持5 min，以3 ℃/min升至180 ℃，保持 5 min；載氣：高純He；分流比30∶1；流速1.0 mL/min；不分流進樣。

質(zhì)譜條件：電子能量70 eV；四級桿溫度180 ℃；離子源溫度220 ℃；質(zhì)量掃描范圍50～450m/z。

1.3.5 數(shù)據(jù)分析

定性：化合物經(jīng)計算機檢索同時與NIST Library(107K compounds)和Wiley Library(320K compounds, version6.0)相匹配，僅報道匹配度和純度大于800(最大值1 000)的鑒定結果。半定量：相對百分含量按峰面積歸一化法計算。

對GC-MS定量分析結果用Excel 2016進行處理(計算平均值及標準差)和繪圖。采用SPSS 19.0 統(tǒng)計分析軟件對數(shù)據(jù)進行顯著性分析(Duncan法)及主成分分析。

2 結果與分析

2.1 不同成熟時間臘牛肝中揮發(fā)性風味物質(zhì)的變化

采用HS-SPME與GC-MS方法對臘牛肝加工過程中揮發(fā)性風味物質(zhì)進行分析，圖1為成品臘牛肝總離子流圖。

圖1 臘牛肝揮發(fā)性風味物質(zhì)總離子流圖Fig.1 Total ion flow diagram of volatile compounds in cured beef liver

臘牛肝在加工過程中0～4 d的揮發(fā)性風味物質(zhì)檢測結果見表2。在加工過程中，共分析篩選71種揮發(fā)性風味物質(zhì)，分為9類，其中醇類14種，醛類10種，酸類7種，烴類13種，酮類4種，酯類16種，芳香類2種，雜環(huán)化合物3種，及其他物質(zhì)2種。在加工第0，1，2，3，4天分別測定得到27，34，38，49，44種風味物質(zhì)，且風味物質(zhì)種類整體隨加工時間呈上升趨勢。

隨著加工時間的增加，原來的風味物質(zhì)出現(xiàn)了增加或減少的情況，同時也伴隨著舊物質(zhì)的減少和新物質(zhì)出現(xiàn)的情況。在0天的樣品中，主要成分為醇類和酸類物質(zhì)。在第4天的樣品中，主要成分為醇類、酯類和醛類物質(zhì)。

表2 臘牛肝加工過程中揮發(fā)性風味物質(zhì)相對含量Table 2 The relative content of volatile flavor components during processing of cured beef liver

續(xù)表2

序號保留時間/min化合物名稱英文名稱CAS號化學式相對含量/%0 d1 d2 d3 d4 d酮類(4)4520.77甲基庚烯酮methylheptenone110-93-0C8H14O0.54±0.01a——0.06±0.01b—4636.53胡椒酮p-menth-1-en-3-one89-81-6C10H16O——6.84±0.12a—3.64±0.07b4740.49香葉基丙酮geranylacetone689-67-8C13H22O—0.28±0.03a—0.21±0.02b—4843.55乙位紫羅蘭酮irisone14901-07-6C13H20O————0.11±0.02總計0.54±0.01c0.28±0.03d6.84±0.12a0.27±0.03d3.75±0.09b酯類(16)495.24乙酸乙酯ethyl acetate141-78-6C4H8O2———0.23±0.02—5019.76庚酸乙酯ethylheptanoate106-30-9C9H18O2—4.32±0.18a—0.21±0.02b0.25±0.02b5120.17正己酸乙烯酯hexanoic acid, ethenylester3050-69-9C8H14O21.67±0.15————5221.07乳酸乙酯ethyl lactate97-64-3C5H10O3——2.45±0.07a0.66±0.04c1.57±0.01b5322.37辛酸乙酯ethylcaprylate106-32-1C10H20O2—1.00±0.12a0.73±0.07b0.68±0.06b0.88±0.05a5428.37壬酸乙酯ethylnonanoate123-29-5C11H22O2—0.94±0.03a—0.34±0.03b0.35±0.01b5532.31癸酸乙酯ethylcaprate110-38-3C12H24O2—0.79±0.07b1.35±0.04a0.58±0.06b0.65±0.03b5634.49丁二酸二乙酯diethylsuccinate123-25-1C8H14O4——0.62±0.03a0.23±0.02b0.27±0.02b5739.68月桂酸乙酯ethyllaurate106-33-2C14H28O2—0.87±0.02c1.16±0.04c1.66±0.03b2.68±0.06a5844.87十四酸乙酯ethylmyristate124-06-1C16H32O2—1.32±0.03b0.66±0.03c3.31±0.07a3.36±0.08a5948.56十五酸乙酯pentadecanoic acid,ethyl ester41114-00-5C17H34O2—0.83±0.03 d2.62±0.07a1.92±0.07b1.46±0.05c6050.33硬脂酸乙酯ethyloctadecanoate111-61-5C20H40O2—4.60±0.08a0.45±0.03c1.22±0.03b0.99±0.06b6151.25棕櫚酸乙酯ethylpalmitate628-97-7C18H36O2—6.45±0.04b6.52±0.05a5.83±0.05c6.67±0.04a6251.58油酸乙酯ethyloleate111-62-6C20H38O2———0.61±0.020.77±0.056353.659-十六碳烯酸乙酯9-hexadecenoicacid,ethyl ester54546-22-4C18H34O2—0.90±0.05a0.34±0.03b0.59±0.02a0.64±0.03a6453.75亞油酸乙酯ethyl linoleate7619-08-1C20H36O21.04±0.04————總計2.71±0.19e22.02a±0.5116.90±0.19d17.84±0.36c20.54±0.36b芳香類(2)6546.22苯酚phenol108-95-2C6H6O0.85±0.01————6648.654-甲基苯酚p-cresol106-44-5C7H8O2.5±0.08————總計3.35±0.070.000.000.000.00雜環(huán)化合物類(3)6716.72鄰異丙基甲苯o-cymene527-84-4C10H14—0.14±0.03b—0.34±0.03b0.58±0.04a6817.15間異丙基甲苯m-cymene535-77-3C10H14———0.55±0.02—6917.174-異丙基甲苯4-isopropyltoluene99-87-6C10H14——0.74±0.03——總計0.000.14±0.03d0.74±0.03b0.89±0.01a0.58±0.04c其他(2)7026.434-乙基-5-甲基噻唑4-ethyl-5-methylthiazole52414-91-2C6H9NS———0.24±0.02—7140.074-烯丙基苯甲醚4-allylanisole140-67-0C10H12O————0.54±0.03總計0.000.000.000.24±0.02b0.54±0.03a

注：“—”表示未檢出，同一行數(shù)據(jù)肩標字母不同表示差異顯著(P<0.05)。

第4天與第0天相比，醇類與酸類物質(zhì)含量分別減少了20.66%、25.64%，說明臘牛肝的腥味和不愉快的味道減少；酯類和醛類物質(zhì)的含量分別增加了17.83%、9.07%， 酯類和醛類都是組成臘肉風味特征的重要物質(zhì)。酯類主要來源于臘肉中酸類和醇類化合物之間發(fā)生的酯化反應，具有香甜的果香味[11]。醛類賦予臘牛肝獨特的清香、油香、脂香風味，在臘牛肝中含量較高，這與周才瓊等[12]的研究相符。

2.2 不同種類風味物質(zhì)變化分析

在臘牛肝加工過程中檢測到的不同種類揮發(fā)性風味物質(zhì)的相對含量如圖1所示。

圖2 臘牛肝加工過程中各類揮發(fā)性風味物質(zhì)相對含量變化Fig.2 Relative content of various volatile flavor substances in the processing of cured beef liver

2.2.1 醛類物質(zhì)變化分析

研究表明，醛類物質(zhì)主要由脂肪的氧化和降解產(chǎn)生，其中顯著影響臘牛肝風味的高分子質(zhì)量飽和醛和不飽和醛是由多不飽和脂肪酸的過氧化物降解生成的[13]。由表2和圖1可知，從1～4 d的樣品中共檢測出15種醛類，除腌制第1天時相對含量減少外，其余天數(shù)都呈顯著上升趨勢(P<0.05)，這可能是因為在腌制第一天時醛類氧化產(chǎn)生了其他物質(zhì)。醛類化合物的閾值很低(0.2 μg/kg)，3～4個碳原子的醛具有強烈的刺激性氣味，5～9個碳原子的醛具有清香、油香、脂香風味，分子質(zhì)量較高的醛具有橘子皮似的風味[14]。在檢出的醛類中，己醛具有果香、柑橘香、生的油脂味等香味[15]；壬醛具有甜橙味、檸檬味和油脂味；2-辛烯醛具有脂肪香氣味；反式-2,4-癸二烯醛具有清香，脂肪香和油炸香味，由脂肪氧化產(chǎn)生[15]；苯甲醛具有櫻桃、苦杏仁及堅果香味，是苯丙氨酸的降解產(chǎn)物[16]。

2.2.2 醇類物質(zhì)變化分析

腌制1 d的樣品與未腌制的空白樣品相比，醇類的相對含量增加了12.85%，這可能是由于脂肪氧化產(chǎn)生醇類[17]，導致醇類種數(shù)和相對含量增加。在臘牛肝加工的1～4 d，醇類的種數(shù)和相對含量逐漸下降，SHAHIDI等[18]研究認為，這可能是由于醇類在加工過程中發(fā)生了酯化、氧化反應，也有可能是因為腌制能抑制脂肪氧化[17]。醇類因其獨特的香味，賦予了臘牛肝濃郁的醇香。直鏈飽和醇的香味閾值(500～20 000 μg/kg)相對其他羰基化合物較高，隨著碳鏈的增長可產(chǎn)生出清香、木香、脂肪香的特征[19]。在檢出的醇類中，乙醇、正己醇具有芳香氣味，1-辛烯-3-醇具有蘑菇香、泥土香味，α-松油醇具有丁香味，苯乙醇具有玫瑰香味[8]。

2.2.3 酸類和酮類物質(zhì)變化分析

在臘牛肝加工過程中檢出的酸類和酮類物質(zhì)的相對含量較少。酸類物質(zhì)由脂肪氧化、水解產(chǎn)生[20]，對臘牛肝的風味有著重要影響。近年來，酸價問題一直限制著傳統(tǒng)臘肉制品市場拓展，所以解決臘肉制品酸價問題迫在眉睫。通過分析結果發(fā)現(xiàn)，1～4 d共檢測出酸類物質(zhì)5種，乙酸含量最高，對臘牛肝風味影響不大。酮類物質(zhì)一般由美拉德反應生成，也可由醇類氧化、酯類分解得到[15]。臘牛肝中的蛋白類化合物能與酮類物質(zhì)發(fā)生反應，形成特征性的色澤，所以，酮類物質(zhì)對產(chǎn)品的色澤有一定影響。由于臘牛肝煙熏后顏色發(fā)黑，所以臘牛肝一般不煙熏，這可能是造成酮類物質(zhì)較少的原因。

2.2.4 烴類物質(zhì)變化分析

檢出的烴類物質(zhì)有烷烴和烯烴，研究發(fā)現(xiàn)脂肪氧化可產(chǎn)生直鏈烷烯烴，直鏈脂肪酸降解氧化可產(chǎn)生直鏈烷烴[21]。在檢出的烴類物質(zhì)中，月桂烯具有香脂香味，檸檬烯具有檸檬香氣，反式-β-羅勒烯具有青香、木香和蔬菜風味[8]，月桂烯、萜品油烯、反式-β-羅勒烯是組成臘味的一部分揮發(fā)性風味物質(zhì)。在臘牛肝加工過程中檢出的烴類物質(zhì)相對含量較大，是因為臘制溫度較高，提高了脂肪酶的活性，使脂肪水解出更多的烴類。烷烴類化合物的閾值較高，但它們有助于提高臘牛肝整體香味的效果。

2.2.5 酯類和其他物質(zhì)變化分析

酯類物質(zhì)是臘牛肝非常重要的物質(zhì)，影響著臘牛肝制品整體風味的形成。一般而言，除內(nèi)酯和硫酯以外的酯閾值較高，酯類會給予臘牛肝香甜的果香[18]。在臘牛肝加工過程中，由于受到各種因素的共同影響，脂肪不斷水解、氧化，產(chǎn)生游離脂肪酸，脂肪酸與醇類物質(zhì)反應產(chǎn)生酯類物質(zhì)[22]。1～4 d共檢出的酯類物質(zhì)有17種，其中最主要的酯類物質(zhì)是棕櫚酸乙酯。本實驗中檢出的其他物質(zhì)有雜環(huán)化合物、噻唑，他們是香味化合物的重要組成部分，主要來源于美拉德反應[23]。美拉德反應是臘牛肝中產(chǎn)生風味物質(zhì)的重要途徑。

2.3 因子分析

各主成分因子的特征值及其方差貢獻率計算結果見表3。由表3可以看出，前3個成分的累計方差貢獻率已達89.057%，能夠反映臘牛肝原始數(shù)據(jù)的大部分信息，因此本研究選擇前3個成分為主成分因子。

表3 主成份因子的特征值及其方差貢獻率Table 3 Eigenvalues, contribution and cumulative contribution of principal components

旋轉后主成分因子的成份矩陣見表4。

由表4可知，與PC1高度相關的物質(zhì)有反式-2,4-癸二烯醛、甲基庚烯酮、棕櫚酸乙酯、1-辛烯-3-醇、2-甲基戊酸、己酸、正辛醛等，主要來自于脂肪氧化。脂肪氧化對臘牛肝風味的形成具有決定性的作用。

表4 旋轉后主成分因子的成份矩陣Table 4 otating principal components loading matrix

TOLDRA等[24]研究發(fā)現(xiàn)，干腌火腿中的揮發(fā)性成分有567種，大部分由脂質(zhì)的自動氧化形成。脂質(zhì)氧化主要包括兩個方面：一是含雙鍵的脂肪酸易氧化生成過氧化物，進一步分解為香閾值很低的酮、醛、酸等揮發(fā)性羰基化合物；二是含羥基的脂肪酸水解后生成羥基酸，經(jīng)過加熱脫水、環(huán)化生成具有肉香味的內(nèi)酯化合物[17]。

與PC2高度相關的揮發(fā)性風味物質(zhì)有壬醛、丁二酸二乙酯、胡椒酮、乳酸乙酯、苯乙醇、癸酸、環(huán)己醇等，主要來源于前體物質(zhì)的降解。腌臘肉制品風味的前體物質(zhì)主要分為兩大類：水溶性成分和脂質(zhì)。水溶性風味前體物質(zhì)主要有：糖類、游離氨基酸、肽、核苷酸和其他的含氮組分等。脂溶性前體物質(zhì)主要有：甘油三酯、游離脂肪酸、磷脂和羰基化合物等[9]。

與PC3高度相關的有2-苯基巴豆醛、正十五碳醛、3-蒈烯、間異丙基甲苯、4-乙基-5-甲基噻唑、乙酸乙酯、b-崖柏烯等物質(zhì)，主要來自于美拉德反應。美拉德反應利用氨基酸和還原糖之間的反應，可以產(chǎn)生多種肉類揮發(fā)性風味化合物，如吡嗪類、噻吩類、噻唑等[25]。不同的α-氨基酸和還原糖的反應，能按Strecker降解生成一些揮發(fā)性的醛、酮等物質(zhì)，給臘牛肝帶來悅人的色澤和風味[25]。

2.4 臘牛肝與傳統(tǒng)臘肉特征性風味物質(zhì)的對比

傳統(tǒng)臘肉的特征揮發(fā)性風味物質(zhì)主要為酚類、醛類和酮類[13]，而臘牛肝的特征揮發(fā)性風味物質(zhì)為醇類、醛類、和酯類，這是因為加工原料和加工工藝的不同。醇類和酯類是牛肝本身所具有的特征風味物質(zhì)[2]，賦予牛肝獨特的清香味；酮類和酚類物質(zhì)主要在煙熏過程產(chǎn)生，臘牛肝煙熏后色澤發(fā)黑，一般不進行煙熏工藝，這是臘牛肝酮類和酚類物質(zhì)較少的原因。二者共同的特征性風味物質(zhì)是醛類，醛類一般由脂肪氧化產(chǎn)生，具有清香、油香、脂香，是組成臘味的重要物質(zhì)。

3 結論

(1)在臘牛肝加工過程中共檢測出71種揮發(fā)性風味物質(zhì)，主要為醇類、醛類、烴類和酯類。第4天與第0天的樣品相比，呈現(xiàn)腥味和不愉快氣味的酸類物質(zhì)含量顯著減少，呈現(xiàn)清香、油香和脂香味的酯類和醛類物質(zhì)含量顯著增加，其他物質(zhì)含量變化不明顯，說明將牛肝加工成臘牛肝可以去腥增香。

(2)主成分分析將臘牛肝加工過程中的風味物質(zhì)共分為三類，分別是脂肪氧化產(chǎn)物、前體物質(zhì)降解產(chǎn)物、美拉德反應產(chǎn)物。

(3)臘牛肝的特征性風味物質(zhì)是醇類、醛類和酯類，其中己醛、壬醛、反式-2,4-癸二烯醛、1-辛烯-3-醇、乙醇、正己醇、棕櫚酸乙酯等是組成臘牛肝風味的重要物質(zhì)。