張偉建，范文來(lái)*，徐巖，張貴選，趙軍，唐麗云

1(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，教育部工業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫，214122) 2(山東沂蒙老區(qū)酒業(yè)有限公司，山東 臨沂，276700)

白酒香型因地域位置不同而不同，而同一香型由于地理環(huán)境不同也具有不同的風(fēng)格特征[1]。沂蒙老區(qū)濃香型白酒產(chǎn)于山東沂蒙地區(qū)，以高粱、大米、糯米、小麥、玉米為原料，中高溫大曲為糖化發(fā)酵劑，采用傳統(tǒng)“老五甑”工藝，泥窖發(fā)酵，長(zhǎng)期陳釀而成，具有“窖香淡雅、醇和綿甜、順柔爽凈”的魯酒風(fēng)格[2]。

僅占2%左右的微量成分是決定白酒香氣、口感和風(fēng)格的關(guān)鍵[3]。自從濃香型白酒的關(guān)鍵香氣己酸乙酯[4]確認(rèn)以后，濃香型白酒特征風(fēng)味得到廣泛的研究。酯類(lèi)，尤其是乙酯類(lèi)被認(rèn)為是對(duì)濃香型白酒風(fēng)味貢獻(xiàn)最大的一類(lèi)化合物[5-6]。由于香氣化合物種類(lèi)與含量不同，所以，濃香型白酒產(chǎn)地不同，風(fēng)格也不盡相同。目前，幾種比較有名的濃香型白酒，如五糧液[6-7]、洋河大曲[5, 8]、瀘州老窖[9-10]、劍南春[6]和古井貢[11]的香氣成分研究已有報(bào)道。然而，沂蒙老區(qū)白酒作為當(dāng)?shù)赜刑厣臐庀阈途浦皇窃?006年探討了其低度白酒酒體質(zhì)量[12]，未見(jiàn)文獻(xiàn)從風(fēng)味角度對(duì)沂蒙老區(qū)白酒進(jìn)行深層次剖析。

到目前為止，沂蒙老區(qū)濃香型白酒的重要風(fēng)味物質(zhì)尚不明確，更不清楚與其他典型濃香型白酒的風(fēng)味差異，制約了沂蒙老區(qū)白酒的發(fā)展與品質(zhì)提升。為提升品質(zhì)，保持特色，明確沂蒙老區(qū)白酒特征風(fēng)味物質(zhì)及其與典型濃香型白酒間的風(fēng)味差異至關(guān)重要。近些年來(lái)，氣相色譜-聞香法(gas chromatography-olfactometry, GC-O)結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)技術(shù)廣泛應(yīng)用于飲料酒和水果風(fēng)味成分分析，如白酒[8, 13-14]，黃酒[15-16]，葡萄酒[17-18]，果酒[19-20]，葡萄[21]，桑葚[22]等。因此，本研究采用液液萃取的方法，將酒樣分為酸-水溶性組分和中-堿性組分，使復(fù)雜的香氣化合物得到充分地分離，結(jié)合GC-O、GC-MS技術(shù)對(duì)風(fēng)味化合物的貢獻(xiàn)進(jìn)行全面剖析，進(jìn)而確定沂蒙老區(qū)濃香型白酒重要的風(fēng)味物質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

沂蒙老區(qū)濃香型原酒：沂蒙老區(qū)新酒、沂蒙老區(qū)老酒(5年)由山東沂蒙老區(qū)酒業(yè)有限公司提供。

無(wú)水乙醚、無(wú)水NaCl、無(wú)水Na2SO4、NaHCO3、H2SO4(分析純)，購(gòu)于中國(guó)醫(yī)藥(集團(tuán))上?；瘜W(xué)試劑公司；戊烷、無(wú)水乙醇(色譜純)，購(gòu)于Sigma-Aldrich(上海)公司。

標(biāo)準(zhǔn)品：表1、表2鑒定依據(jù)中標(biāo)有RI的化合物標(biāo)準(zhǔn)品(色譜純)，購(gòu)于Sigma-Aldrich(上海)公司。

1.2 儀器與設(shè)備

GC 6890N-MSD 5975型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國(guó)Agilent公司；Gerstel ODP2聞香裝置，德國(guó)Gerstel公司；N-EVAP111型氮吹儀，美國(guó)Organomation公司；Mili-Q超純水系統(tǒng)，美國(guó)Millipore公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 液液萃取方法

參考FAN[8]報(bào)道的香氣物質(zhì)提取方法，100 mL原酒酒樣用煮沸過(guò)的超純水(煮沸5 min，自然冷卻到室溫)稀釋至酒精度10%vol，加無(wú)水NaCl飽和，用210 mL溶劑(V(戊烷)∶V(重蒸乙醚)=1∶1)在分液漏斗中萃取3次(每次70 mL)，合并有機(jī)相，緩慢氮吹至50 mL，記為“萃取相Ⅰ”。為了樣品中復(fù)雜組分得到更好的分離，“萃取相Ⅰ”又分為中-堿性組分和酸-水溶性組分：

“萃取相Ⅰ”加入煮沸過(guò)的超純水50 mL，加無(wú)水NaCl飽和，將水相用10%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))NaHCO3調(diào)pH至9.0，靜置分層，有機(jī)相用20 mL煮沸過(guò)的超純水水洗2次(每次10 mL)，水洗相與水相合并，記為“萃取相Ⅱ”，有機(jī)相記為“萃取相Ⅲ”?！拜腿∠啖蟆敝屑訜o(wú)水Na2SO4置于-20 ℃中干燥過(guò)夜，緩慢氮吹至250 μL，即為中-堿性組分，用于GC-O分析和GC-MS定性。

“萃取相Ⅱ”加NaCl飽和，用1 mol/L H2SO4溶液調(diào)pH至2.0，用40 mL重蒸乙醚萃取2次(每次20 mL)，合并有機(jī)相，記為“萃取相Ⅳ”?！拜腿∠啖簟敝屑訜o(wú)水Na2SO4置于-20 ℃中干燥過(guò)夜，緩慢氮吹至250 μL， 即為中-堿性組分，用于GC-O分析和GC-MS定性。

1.3.2 GC-O分析

采用6點(diǎn)值(0、1、2、3、4、5)聞香法對(duì)樣品進(jìn)行分析，0表示沒(méi)有聞到香氣，1表示氣味微弱，2表示氣味較弱，3表示氣味中等，4表示氣味較強(qiáng)，5表示氣味最強(qiáng)。兩名經(jīng)過(guò)半年聞香訓(xùn)練的碩士生進(jìn)行聞香，一男一女，平均年齡24歲。每個(gè)樣品每人聞3次，同時(shí)記錄保留時(shí)間、香氣特征及強(qiáng)度。所有香氣化合物的強(qiáng)度均為兩個(gè)人6次聞香強(qiáng)度的平均值。

1.3.3 GC-MS分析

樣品通過(guò)DB-FFAP(60 m×0. 25 mm×0. 25 μm)色譜柱進(jìn)行分離。色譜條件為：進(jìn)樣口溫度250 ℃，載氣為He氣，流速2 mL/min，不分流進(jìn)樣，進(jìn)樣量為1 μL，樣品隨載氣一半進(jìn)入檢測(cè)器，一半進(jìn)入聞香裝置。升溫程序?yàn)椋?0 ℃保持2 min，然后以6 ℃/min速率升溫至230 ℃，并保持15 min。質(zhì)譜條件：EI電離源；電子能量：70 eV；離子源溫度：230 ℃；掃描范圍：35～350 amu。

1.3.4 物質(zhì)定性分析

未知香氣化合物質(zhì)譜與NIST 05a.L數(shù)據(jù)庫(kù)(Agilent Technologies Inc.)中標(biāo)準(zhǔn)譜圖比對(duì)，計(jì)算Kovats保留指數(shù)(RI)，定性通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)樣品的質(zhì)譜、RI和香氣比對(duì)；無(wú)標(biāo)準(zhǔn)品的物質(zhì)通過(guò)質(zhì)譜圖比對(duì)、查閱文獻(xiàn)中已報(bào)道過(guò)的相應(yīng)物質(zhì)的RI和香氣描述進(jìn)行定性。

2 結(jié)果與分析

應(yīng)用GC-O技術(shù)，在沂蒙老區(qū)兩種原酒中共鑒定出56種香氣化合物，包括酯類(lèi)21種、酸類(lèi)12種、醇類(lèi)9種、芳香族類(lèi)6種、酚類(lèi)5種、縮醛類(lèi)2種、呋喃類(lèi)1種。

2.1 酸-水溶性組分中的香氣成分

在沂蒙老區(qū)白酒的酸-水溶性組分中共檢測(cè)到25種香氣化合物(表1)，主要是揮發(fā)性脂肪酸類(lèi)和醇類(lèi),除此之外，還有少量的酚類(lèi)、呋喃類(lèi)和芳香族化合物。

表1 沂蒙老區(qū)白酒酸-水溶性組分香氣化合物聞香結(jié)果Table 1 Aroma-active compounds of Yimeng liquor in acidic-water soluble fraction

續(xù)表1

RIaFFAPRILa化合物名稱(chēng)鑒定依據(jù)b香氣描述香氣強(qiáng)度cagedyoung1 728 1 727[6]戊酸(pentanoic acid)MS,aroma,RI奶酪、腐臭2.82.41 801 1 820[6]4-甲基戊酸(4-methylpentanoic acid)MS,aroma,RI汗臭、腐臭1.51.91 857 1 846[6]己酸(hexanoic acid)MS,aroma,RI奶酪、汗臭4.74.81 931 1 906[6]2-苯乙醇(2-phenylethanol)MS,aroma,RI玫瑰花香3.03.11 963 1 955[6]庚酸(heptanoic acid)MS,aroma,RI甜香2.82.72 017 2 007[6]苯酚(phenol)MS,aroma,RI藥片2.01.72 072 2 060[6]辛酸(octanoic acid)MS,aroma,RI甜香,奶酪2.62.02 102 2 080[6]4-甲基苯酚(4-methylphenol)MS,aroma,RI動(dòng)物臭3.33.02 184 2 168[6]壬酸(nonanoic acid)MS,aroma,RI脂肪臭1.51.02 323 2 282[6]癸酸(decanoic acid)MS,aroma,RI脂肪臭1.31.2

注：a：RIFFAP，化合物在極性柱FFAP上的保留指數(shù)；RIL，文獻(xiàn)中報(bào)道的保留指數(shù)；b：MS，化合物通過(guò)質(zhì)譜比對(duì)；RI，標(biāo)準(zhǔn)品的保留指數(shù)；aroma，化合物通過(guò)香氣確定；c：aged，沂蒙老區(qū)老酒(5年)；young，沂蒙老區(qū)新酒。下表同。

脂肪酸在沂蒙老區(qū)白酒中扮演著重要的角色，在兩種原酒中，己酸和丁酸(香氣強(qiáng)度≥4.0)香氣貢獻(xiàn)非常大，是沂蒙老區(qū)白酒中最重要的脂肪酸，貢獻(xiàn)了奶酪、腐臭、汗臭氣味。其次為乙酸、3-甲基丁酸(>3.0)是沂蒙老區(qū)白酒中重要的脂肪酸，貢獻(xiàn)了醋、酸臭、腐臭、奶酪氣味。脂肪酸在白酒中起到呈香、助香、減少刺激和緩沖平衡的作用[23]。在川派濃香型代表酒五糧液[6]、劍南春[6]、和江淮派濃香型代表酒洋河大曲[5]中脂肪酸貢獻(xiàn)大小順序?yàn)榧核帷⒍∷帷?-甲基丁酸、戊酸，而沂蒙老區(qū)濃香型白酒乙酸相對(duì)于戊酸(>2.0)對(duì)酒體的貢獻(xiàn)更大。

在酸-水溶性組分中一共檢測(cè)到9種醇類(lèi)物質(zhì)，香氣強(qiáng)度整體小于脂肪酸。在兩種原酒中按照香氣貢獻(xiàn)大小排序，3-甲基-1-丁醇(≥3.0)貢獻(xiàn)最大，是沂蒙老區(qū)重要的醇類(lèi)化合物，其次為1-己醇、1-辛醇、1-戊醇、2-甲基丙醇(>2.0),這些化合物在沂蒙老區(qū)老酒中香氣強(qiáng)度要高于新酒。在五糧液[6]和劍南春[6]中醇類(lèi)香氣貢獻(xiàn)大小順序?yàn)椋?-甲基-1-丁醇、1-戊醇、1-丁醇、1-己醇、2-戊醇。在洋河大曲[5]里香氣貢獻(xiàn)順序?yàn)椋?-甲基-1-丁醇、1-己醇、2-戊醇、1-辛醇、1-戊醇，由此可以看出沂蒙老區(qū)白酒醇類(lèi)化合物香氣貢獻(xiàn)順序與洋河大曲[5]基本一致。另外，3-甲基-1-丁醇、1-戊醇為五糧液[6]、劍南春[6]重要的香氣化合物，3-甲基-1-丁醇、1-己醇為洋河大曲[5]重要的香氣化合物，而在沂蒙老區(qū)白酒中，1-戊醇和1-己醇并不是重要的香氣物質(zhì)。

此外，在兩種原酒中還檢測(cè)到2種酚類(lèi)化合物、1種芳香族化合物。其中，4-甲基苯酚(≥ 3.0)和2-苯乙醇(≥ 3.0)是沂蒙老區(qū)白酒重要的香氣化合物。4-甲基苯酚已被證實(shí)是產(chǎn)生窖泥臭的化合物[24]，貢獻(xiàn)了窖泥臭、動(dòng)物臭；2-苯乙醇貢獻(xiàn)了玫瑰花香。但是，4-甲基苯酚在五糧液[6]、劍南春[6]和洋河大曲[5]中香氣貢獻(xiàn)均不大，并不是重要的香氣化合物。2-苯乙醇雖然在五糧液[6]、劍南春[6]和洋河大曲[5]中有一定的香氣貢獻(xiàn)，但也不是重要的香氣化合物。

在沂蒙老區(qū)兩種原酒中僅檢測(cè)到1種雜環(huán)類(lèi)化合物即糠醛(>2.0)，主要貢獻(xiàn)了甜香，對(duì)酒體有一定貢獻(xiàn)。在洋河大曲[5]中鑒定出2種雜環(huán)化合物，1種呋喃類(lèi)化合物和1種噻唑類(lèi)化合物。而在五糧液[6]、劍南春[6]中共檢測(cè)出19種雜環(huán)類(lèi)化合物，包括11種呋喃類(lèi)、7種吡嗪類(lèi)和1種吡咯類(lèi)化合物。川派濃香型白酒中雜環(huán)類(lèi)化合物種類(lèi)遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于江淮派濃香型白酒中的雜環(huán)類(lèi)化合物。從香氣化合物角度來(lái)說(shuō)，這可能是川派與江淮派濃香型白酒劃分的重要依據(jù)。由此推測(cè)，沂蒙老區(qū)濃香型白酒可能與江淮派濃香型白酒更為相似。

2.2 中-堿性組分中的香氣成分

沂蒙老區(qū)濃香型白酒的中-堿性組分的香氣成分種類(lèi)繁多，在兩種原酒的中-堿性組分中共檢測(cè)到35種香氣化合物(表2)，有酯類(lèi)、醇類(lèi)、縮醛類(lèi)、芳香族化合物、酚類(lèi)等。

酯類(lèi)是沂蒙老區(qū)濃香型白酒中種類(lèi)最多、最重要的一類(lèi)風(fēng)味物質(zhì)，在沂蒙老區(qū)兩種原酒中共檢測(cè)到21種酯類(lèi)化合物，酯類(lèi)化合物主要呈現(xiàn)水果香、花香。其中，己酸乙酯(5.0)香氣貢獻(xiàn)最大，是沂蒙老區(qū)白酒最重要的香氣化合物。其次為丁酸乙酯、戊酸乙酯、辛酸乙酯、庚酸乙酯(≥3.0)，是沂蒙老區(qū)白酒重要的香氣物質(zhì)，與在五糧液[6]、劍南春[6]和洋河大曲[5]中香氣貢獻(xiàn)大小順序基本一致。不同之處在于沂蒙老區(qū)白酒中的2-羥基己酸乙酯、己酸戊酯(≥3.0)，是沂蒙老區(qū)白酒重要的香氣化合物，而在五糧液[6]、劍南春[6]和洋河大曲[5]中這些化合物香氣貢獻(xiàn)均較小，并不是其重要的香氣物質(zhì)。除此之外，己酸-3-甲基丁酯(3.2)也是沂蒙老區(qū)白酒重要的酯類(lèi)物質(zhì)，同時(shí)也是洋河大曲[5]中重要的香氣化合物，但是在五糧液[6]和劍南春[6]中并不重要。

表2沂蒙老區(qū)白酒中-堿性組分聞香結(jié)果Table 2 Arma-active compounds of Yimeng liquor in neutaal-basic soluble fraction

注：ND表示未檢測(cè)到。

在沂蒙老區(qū)兩種原酒中共檢出6種芳香化合物，主要貢獻(xiàn)花香、水果香、甜香。乙酸-2-苯乙酯(>2.0)是沂蒙老區(qū)白酒中香氣貢獻(xiàn)最大的芳香族化合物，在老酒中的香氣強(qiáng)度大于新酒。而在五糧液[6]、劍南春[6]和洋河大曲[5]中香氣貢獻(xiàn)最大的芳香族化合物，分別為3-苯丙酸乙酯、2-苯乙酸乙酯和己酸-2-苯乙酯。

除此以外，在兩種原酒中還檢測(cè)到2種縮醛類(lèi)化合物，香氣特征是水果香，其中1,1-二乙氧基-2-苯乙烷(>2.0)香氣貢獻(xiàn)在沂蒙老區(qū)兩種原酒中均大于乙縮醛(≥2.0)，對(duì)整體風(fēng)味有一定貢獻(xiàn)；而在五糧液[6]、劍南春[6]中共檢測(cè)到8種縮醛類(lèi)化合物，乙縮醛香氣貢獻(xiàn)遠(yuǎn)大于1,1-二乙氧基-苯乙烷，在洋河大曲[5]中檢測(cè)到3種縮醛類(lèi)化合物，并未檢測(cè)到1,1-二乙氧基-2-苯乙烷，但乙縮醛對(duì)酒體香氣貢獻(xiàn)很大，是其重要的香氣化合物。

總結(jié)上述分析結(jié)果可以看出，沂蒙老區(qū)新酒和老酒的風(fēng)味相似，但是老酒中香氣化合物的香氣強(qiáng)度普遍高于新酒。從雜環(huán)化合物數(shù)量上來(lái)說(shuō)，沂蒙老區(qū)白酒可能與江淮派代表酒洋河大曲[5]更為相似。雖然沂蒙老區(qū)白酒中重要的香氣物質(zhì)以及酯類(lèi)、酸類(lèi)、醇類(lèi)化合物香氣貢獻(xiàn)順序與洋河大曲[5]基本相同，但是個(gè)別香氣化合物對(duì)酒體的貢獻(xiàn)及貢獻(xiàn)順序上存在一定的差異。其中，己酸戊酯、2-羥基己酸乙酯、4-甲基苯酚和2-苯乙醇是沂蒙老區(qū)白酒重要的香氣物質(zhì)，但在洋河大曲[5]中并不重要，而洋河大曲[5]中重要的己醇和乙縮醛在沂蒙老區(qū)白酒中貢獻(xiàn)并不大。另外，在沂蒙老區(qū)白酒中乙酸對(duì)酒體的貢獻(xiàn)要強(qiáng)于戊酸，2-甲基丙醇對(duì)酒體的貢獻(xiàn)要強(qiáng)于2-戊醇。這些可能是造成沂蒙老區(qū)白酒獨(dú)特風(fēng)格的重要原因。

3 結(jié)論

通過(guò)GC-O分析，在沂蒙老區(qū)白酒中共鑒定56種香氣化合物。其中己酸乙酯(5.0)是沂蒙老區(qū)濃香型白酒最重要的香氣物質(zhì)，其次，己酸、丁酸、乙酸(≥4.0)是沂蒙老區(qū)非常重要的香氣化合物，丁酸乙酯、戊酸乙酯、辛酸乙酯、3-甲基-1-丁醇、4-甲基苯酚、己酸-3-甲基丁酯、庚酸乙酯、2-羥基己酸乙酯、己酸戊酯、3-甲基丁酸和2-苯乙醇(≥3.0)是沂蒙老區(qū)重要的香氣化合物。沂蒙老區(qū)新酒和老酒的風(fēng)味相似，但是老酒中香氣化合物的香氣強(qiáng)度普遍高于新酒。沂蒙老區(qū)濃香型白酒相對(duì)于川派濃香型代表酒五糧液[6]、劍南春[6]和江淮派濃香型代表酒洋河大曲[5]來(lái)說(shuō)，其風(fēng)格更接近江淮派濃香型白酒，不同之處在于2-羥基己酸乙酯、己酸戊酯、4-甲基苯酚和2-苯乙醇對(duì)沂蒙老區(qū)白酒貢獻(xiàn)較大，是其重要的香氣化合物，而1-己醇和乙縮醛對(duì)沂蒙老區(qū)白酒整體風(fēng)味貢獻(xiàn)較小。沂蒙老區(qū)白酒形成這些特色與其獨(dú)特的地理位置、環(huán)境和釀造工藝息息相關(guān)，這些有待于進(jìn)一步深入研究。