梁家旗，陳江，王蘭英，趙靜*，李紹平

1(吉林大學(xué) 珠海學(xué)院 藥學(xué)與食品科學(xué)學(xué)院，廣東 珠海，519041) 2(中藥質(zhì)量研究國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(澳門大學(xué))，中國 澳門，999078)

樺褐孔菌是一種極具開發(fā)價(jià)值的藥食兩用的真菌[1]。樺褐孔菌野生資源十分有限,近年來價(jià)格逐漸升高，因此,人工培養(yǎng)樺褐孔菌非常必要,而采用液體發(fā)酵生產(chǎn)樺褐孔菌菌絲體是條有效的途徑,可以為研究和開發(fā)樺褐孔菌提供充足的原材料[2-3]。如何提高活性成分的產(chǎn)量、優(yōu)化培養(yǎng)技術(shù)依然是人工培養(yǎng)過程中的研究熱點(diǎn)。目前大部分研究著重于優(yōu)化培養(yǎng)條件與檢測活性成分[4]，而對幾大類活性成分在發(fā)酵過程中是如何累積變化的報(bào)道卻少見。本研究以樺褐孔菌為研究對象，進(jìn)行液體發(fā)酵，通過苯酚硫酸法及薄層色譜法分析樺褐孔菌中的活性成分，擬確定樺褐孔菌多糖、三萜、甾醇類等[5]活性成分在液體發(fā)酵過程中的含量變化情況，確定發(fā)酵培養(yǎng)活性物質(zhì)的最佳時(shí)間，通過與子實(shí)體比較，了解樺褐孔菌發(fā)酵培養(yǎng)物及子實(shí)體中的有效成分的差異，對進(jìn)一步研究和開發(fā)樺褐孔菌具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樺褐孔菌CFCC6584菌株購自中國林業(yè)微生物菌種保藏管理中心；苯酚、硫酸、甲醇均采用國產(chǎn)分析純；DPPH、茚三酮購自sigma公司；層析板購自德國默克；野生樺褐孔菌子實(shí)體保存于澳門大學(xué)中華醫(yī)藥研究院。

1.2 儀器與設(shè)備

Bsc-A2超凈工作臺(tái)，美國Thermo公司；HVE-50高壓滅菌鍋，美國HIRAYAMA公司；C75紫外分光光度計(jì)，Chromato-Vue公司；Centrifuge 5415D離心機(jī)，Eppendorf公司；11-06-MRC恒溫?fù)u床，MRC公司；FD-02凍干機(jī)，ilShinBioBase公司；El3002電子天平，天恒科技有限公司；DENSITOMERCD60薄層掃描儀，DESAGA公司。

1.3 菌株活化

PDA固體培養(yǎng)基(g/L)：馬鈴薯 200，葡萄糖 30，酵母粉10，MgSO41，KH2PO41，瓊脂 30。具體方法參考文獻(xiàn)[6]。取4 ℃保存的樺褐孔菌菌種，無菌操作取菌塊接種到PDA培養(yǎng)基中。

1.4 菌株發(fā)酵培養(yǎng)

1.5 多糖含量測定

1.5.1 樣品制備

收集凍干菌絲體，用多功能粉碎機(jī)粉碎后過篩，取0.1 g菌絲體按液料比300∶1加入甲醇回流80 ℃提取2 h[1,8-9]，轉(zhuǎn)移到50 mL離心管中，離心取25 mL 上清液，加入甲醇洗滌再次離心。殘?jiān)偌蛹状记逑?，重?fù)3次。取甲醇脫脂后的菌絲體，按100∶1(以原來重量為準(zhǔn))加入去離子水，恒溫水浴鍋內(nèi)浸提4.5 h、85 ℃， 提取液10 000 r/min離心10 min，取3 mL上清液，定容到50 mL容量瓶，用于多糖含量測定。

1.5.2 苯酚硫酸法檢測多糖含量[10]

取無水葡萄糖對照品5 mg，置于50 mL容量瓶中，取0、0.5、1、2、3、4、5、6 mL定容至10 mL，倒到離心管中，分別取其中1 mL至試管中，再取出5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))苯酚[11]0.5 mL搖勻，迅速加入2.5 mL濃H2SO4搖勻，靜置10 min后，于40 ℃水浴鍋中保溫15 min，冷卻至室溫，490 nm下檢測吸光度值并記錄，以濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，根據(jù)測定結(jié)果繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，取1 mL待測樣品按照上述方法分別加入苯酚與濃H2SO4，490 nm下檢測吸光度值，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到多糖含量。

1.6 TLC法檢測子實(shí)體與菌絲體三萜甾醇

1.6.1 樣品制備

取凍干后的菌絲體與子實(shí)體，利用1.5.1中相同方法進(jìn)行甲醇提取后，轉(zhuǎn)移到50 mL離心管中，離心取25 mL上清液轉(zhuǎn)移到合適容器中，用N2吹干后加入0.5 mL甲醇溶解。吸取復(fù)溶后的溶液，保存于2 mL 離心管中，用于HPTLC分析。

1.6.2 HPTLC法分析樣品中的三萜甾醇

取薄層板，將制備好的待檢測樣品于40 ℃點(diǎn)樣，設(shè)置點(diǎn)樣條件：長度為5 mm，間距5 mm，點(diǎn)樣量6.5 μL。按照V(二氯甲烷)∶V(乙酸乙酯)=5∶1配制層析液，預(yù)平衡20 min，層析完畢后采用硫酸香草醛顯色[12]。并分別在540 nm和365 nm下觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行拍照，同時(shí)使用薄層掃描儀進(jìn)行掃描。利用掃描得到的樣品總峰值計(jì)算菌絲體三萜甾醇相對含量，如公式(1)。

(1)

1.7 子實(shí)體與菌絲體抗氧化活性比較

取薄層板分開左右2個(gè)區(qū)域，將子實(shí)體、發(fā)酵4 d、 9 d菌絲體樣品于薄層板左右區(qū)域均進(jìn)行點(diǎn)樣，使用與1.6.2相同的方法進(jìn)行薄層層析，左邊區(qū)域利用硫酸香草醛顯色，右邊區(qū)域利用DPPH顯色，于白光下進(jìn)行拍攝并利用肉眼觀察分析[13]。根據(jù)相同RF值的斑點(diǎn)顯色結(jié)果對比樺褐孔菌子實(shí)體與菌絲體的抗氧化活性成分。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同發(fā)酵時(shí)間對樺褐孔菌菌絲體生長的影響[14]

如圖1所示，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，菌絲球由小變大，逐漸增多，菌絲密度在發(fā)酵過程中明顯增加，且發(fā)酵液顏色隨培養(yǎng)時(shí)間延長逐漸加深，培養(yǎng)至12 d之后培養(yǎng)液基本渾濁，菌球消失。

A-培養(yǎng)3 d的菌絲體；B-培養(yǎng)6 d的菌絲體；C-培養(yǎng)9 d的菌絲體；D-培養(yǎng)12 d的菌絲體圖1 不同發(fā)酵時(shí)間對樺褐孔菌發(fā)酵過程的影響Fig.1 Effects on mycelia changes of Inonotus obliquus in different fermentation times

2.2 生物量與多糖含量變化

如圖2所示，菌絲體中的多糖含量在發(fā)酵的前5 d變化較小。

圖2 不同發(fā)酵時(shí)間對樺褐孔菌的多糖含量與生物量的影響Fig.2 Effect of polysaccharide content and biomass of Inonotus obliquus in different culture days

培養(yǎng)至第6天，菌絲體中的多糖含量有明顯的升高，此時(shí)菌絲體處于對數(shù)生長期，其汲取營養(yǎng)增大生物量的同時(shí)，使得培養(yǎng)基中的還原糖逐步轉(zhuǎn)化為多糖，在第8天多糖總產(chǎn)量達(dá)到最大值，為0.31 g/L。8 d之后菌絲體中多糖含量處于相對平穩(wěn)下降狀態(tài)，培養(yǎng)液中營養(yǎng)缺乏，菌絲體開始自溶，其中的多糖含量逐漸降低，最后達(dá)到平衡并接近于子實(shí)體中的含量(29.05 mg/g)。

2.3 發(fā)酵過程成分變化

如圖3所示，隨發(fā)酵時(shí)間的延長，樺褐孔菌次級(jí)代謝產(chǎn)物不斷增加，并且發(fā)酵后的菌絲體與子實(shí)體的成分相似，而菌絲體提取物可觀察到子實(shí)體提取物中未檢測到的成分。

a-540 nm下拍攝，b-365 nm下拍攝圖3 樺褐孔菌培養(yǎng)第3～12天的薄層色譜圖Fig.3 TLC analysis results of Inonotus obliquus cultivation from 3 days to 12 days

采用ZHAO等已發(fā)表文獻(xiàn)中方法，利用薄層掃描分析對比子實(shí)體與發(fā)酵菌絲體中三萜甾醇的相對含量(圖4)[15]，根據(jù)顯色反應(yīng)并結(jié)合現(xiàn)有報(bào)道，推斷出樺褐孔菌主要成分A、B、C均為三萜或甾醇[16]。

圖4 培養(yǎng)第3～12天菌絲體三萜甾醇相對含量Fig.4 The relative content of triterpenes and sterols in mycelia cultivation from 3 days to 12 days

可見樺褐孔菌菌絲體的總?cè)歧薮己坑谂囵B(yǎng)第9天左右達(dá)到最高值，約為子實(shí)體的77%。之后，總含量開始下降，究其原因，可能與營養(yǎng)基質(zhì)消耗殆盡，菌絲生長受到抑制，菌絲自溶導(dǎo)致了相應(yīng)產(chǎn)物含量降低有關(guān)。由此，判斷樺褐孔菌菌絲體最佳發(fā)酵時(shí)間為9 d。

2.4 樺褐孔菌菌絲體提取物的抗氧化活性成分比較

樺褐孔菌提取物的抗氧化薄層顯色結(jié)果如圖5所示，發(fā)酵4、9 d后的樺褐孔菌菌絲體提取物通過DPPH顯色后能觀察到明顯的白色條帶，證明經(jīng)過發(fā)酵的樺褐孔菌菌絲體具有子實(shí)體不含有的抗氧化三萜成分[17]。該三萜于TLC香草醛顯色下條帶顏色較深，提示在其菌絲體中含量較高，原因可能是由于人工培養(yǎng)過程中，菌絲體得到充分的營養(yǎng)，從而產(chǎn)生較多此種代謝產(chǎn)物，而野生樺褐孔菌子實(shí)體由于生長環(huán)境等原因并未產(chǎn)出或較少產(chǎn)出此類成分。

A-子實(shí)體；B-培養(yǎng)4 d的菌絲體；C-培養(yǎng)9 d的菌絲體圖5 樺褐孔菌子實(shí)體與菌絲體抗氧化活性成分對比Fig.5 Comparison of antioxidant components between fruiting bodies and mycelia

3 討論

樺褐孔菌菌絲體與天然資源一樣具有調(diào)節(jié)人類免疫力的多種功能，在國外現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于食品與保健品行列，其中樺褐孔菌多糖、三萜、甾醇類等是它的主要活性成分[18]。如何在人工培養(yǎng)過程中提高生物活性成分的產(chǎn)率，開發(fā)更多活性成分，依然是人工樺褐孔菌培養(yǎng)工程中的核心內(nèi)容。近年來，國內(nèi)對樺褐孔菌菌絲體的研究主要集中在多糖方面[19]，針對樺褐孔菌菌絲體發(fā)酵條件的研究主要利用多糖含量作為發(fā)酵指標(biāo)進(jìn)行優(yōu)化，很少將三萜甾醇的含量作為考察對象。董愛榮等分析比較了菌絲體及子實(shí)體粗多糖含量分別為7.43、2.31 g/100 g，而本文測定的菌絲體及子實(shí)體中的多糖含量分別為5.14、2.95 g/100 g，與其測定結(jié)果相近。ZHAO等對樺褐孔菌進(jìn)行了研究，從中分離出了3種新的具有良好抗腫瘤活性的三萜[20]，可見樺褐孔菌中的三萜甾醇具有深遠(yuǎn)的研究價(jià)值。本文采用液體深層發(fā)酵法對樺褐孔菌進(jìn)行培養(yǎng)，每天收集菌絲體并檢測其中多糖、三萜、甾醇等主要活性成分的含量，發(fā)現(xiàn)隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，菌絲體的生物量逐漸增多，與以往報(bào)道一致[21]，培養(yǎng)至第9天時(shí)達(dá)到最大，且發(fā)酵液顏色逐漸加深，而樺褐孔菌多糖、三萜、甾醇含量先增加后減少，在第9天左右達(dá)到最大值。結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察，可能是由于隨著樺褐孔菌液體發(fā)酵時(shí)間延長，營養(yǎng)物質(zhì)利用完后，菌絲體出現(xiàn)自溶，導(dǎo)致活性成分含量下降。據(jù)此確定，培養(yǎng)至第9天即進(jìn)行發(fā)酵物的收集可以獲得最多的活性物質(zhì)。而本文首次利用HPTLC分析法，利用DPPH顯色法，確定樺褐孔菌菌絲體發(fā)酵過程中可以產(chǎn)生子實(shí)體不具有或含量極少的抗氧化三萜成分，具體原因有待于進(jìn)一步研究。本研究闡明了活性成分在發(fā)酵體系中的代謝變化，并確定了液體發(fā)酵的最佳收集時(shí)間，對人工培養(yǎng)樺褐孔菌菌絲體獲得較高活性物質(zhì)提供參考，對進(jìn)一步開發(fā)樺褐孔菌功能產(chǎn)品具有重要的意義。