王新然，劉瑤，張曉瑞，李林強

(陜西師范大學(xué) 食品工程與營養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，陜西 西安，710119)

核桃瓣膜是核桃果仁間的木質(zhì)隔膜，又稱分心木、胡桃衣、胡桃隔、核桃隔等，其質(zhì)薄而脆，一般呈淡黃色、棕黃色或棕黑色。核桃瓣膜具有補腎澀精的作用，在傳統(tǒng)中醫(yī)治療上，常用其治療遺精滑泄，尿頻遺尿，崩漏，帶下，泄瀉，痢疾[1]。因此，民間人們常用核桃瓣膜泡水或泡酒喝保健身體。

近年來，國內(nèi)外已開展對核桃次生代謝物的研究。國外的研究多為核桃仁和核桃葉酚類化合物組成及相關(guān)生理活性的評價[2]。REGUEIRO等[3]研究結(jié)果表明核桃中次生代謝物主要為酚類化合物，其抗氧化效果良好；SHIMODA等[4]研究結(jié)果表明核桃多酚類物質(zhì)也可抑制脂肪氧化和預(yù)防高血脂癥；SNCHEZ-GONZLEZ等[5]進一步研究報道核桃多酚具有抗腫瘤作用；SOUSA[6]還報道核桃葉中酚類物質(zhì)具有抗菌作用；甚至，VTRZECIAKIEWICZ等[7]和PATHAK等[8]認為核桃多酚可降血脂、調(diào)節(jié)血糖、調(diào)節(jié)腸道健康、促進骨骼發(fā)育以及保護神經(jīng)系統(tǒng)等。國內(nèi)已對核桃瓣膜提取物有一定程度的研究，主要分析了其組成、抗氧化和抗菌特性等[9-11]，但其組成研究結(jié)果存在較大差異，尚需進一步確認。

植物提取物在食品保鮮中的應(yīng)用一直是研究熱點[12]。FAN等[13]和LI等[14]報道茶多酚在魚肉儲藏過程保鮮效果良好；AHN[15]報道葡萄籽多酚對牛肉脂肪氧化具有抑制作用；張汆等[16]報道芡種殼多酚對豬肉腸脂肪氧化具有抑制作用；HE等[17]和HU等[18]均報道茶多酚能有效抑制羊肉中腐敗菌和病原菌生長，提高冷卻羊肉的安全性和貨架期。至于核桃瓣膜多酚對羊肉是否具有同樣的保鮮作用，需要進一步分析確認。

羊肉肉質(zhì)鮮嫩，營養(yǎng)物質(zhì)豐富，在儲藏過程中發(fā)生脂肪氧化和腐敗菌侵染，導(dǎo)致羊肉色澤、風(fēng)味、營養(yǎng)價值和安全性降低。因此，羊肉保鮮對提高其商品價值具有十分重要的意義。本文研究核桃瓣膜提取物組分及其抗氧化作用，并進行羊肉保鮮效果分析，以為核桃瓣膜的研究與應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

核桃，采自于陜西關(guān)中核桃種植林，取其木質(zhì)隔膜備用；FeSO4、酒石酸鉀鈉、Na2HPO4、多酚標(biāo)準(zhǔn)品(槲皮素、沒食子酸、兒茶素、表兒茶素、鞣花酸、綠原酸、蘆丁、原兒茶酸、原花青素、單寧酸、根皮苷、槲皮苷)，上海源葉生物科技有限公司；甲醇(Sigma-Aldrich，色譜純)、增強型ATP檢測試劑盒，碧云天生物技術(shù)有限公司；硼酸、K2CO3、阿拉伯膠粉、甲基紅、亞甲基藍、NaH2PO4、鐵氰化鉀、三氯乙酸、FeCl3、三羥甲基氨基甲烷、鄰苯三酚、DPPH，Sigma；黃曲霉毒素B1試劑盒，深圳芬德生物技術(shù)有限公司；未注明試劑，均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

722型可見分光光度計，上海光譜儀器有限公司；高效液相色譜儀(HPLC)，美國Waters公司；GSP-9080MBE隔水式恒溫培養(yǎng)箱，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；S·SW-CJ-2FD凈化工作臺，上海躍進醫(yī)療器械有限公司；RF-6000熒光分光光度計，島津；Multiskan Go全波長酶標(biāo)儀，美國熱電公司；NS800分光測色儀，深圳市三恩馳科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 核桃瓣膜乙醇浸提及其多酚含量測定

稱取約1 g核桃瓣膜，分別以體積分數(shù)為40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%的乙醇為溶劑，料液比為1∶6(g∶mL)，超聲處理3 min，2～4 ℃下放置12 h，過濾即得核桃瓣膜樣液。

核桃瓣膜中多酚含量測定采用酒石酸亞鐵法[19]：配制0.2 mg/mL的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別吸取沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.4、0.8、1.2、1.6、2 mL，相應(yīng)試管分別加入2、1.6、1.2、0.8、0.4、0 mL無水乙醇，依次加入Na2HPO4-NaOH緩沖液(pH=11)5 mL和酒石酸亞鐵溶液5 mL，可見分光光度計在540 nm處測量其吸光度值(y=1.799 3x-0.013 4，R2=0.975 4)。 取瓣膜樣品液0.4 mL按照上述方法測定其質(zhì)量濃度，并進一步計算不同濃度乙醇對瓣膜中多酚提取的百分率。以多酚濃度最大的核桃瓣膜樣液作為原液，用無水乙醇分別將原液稀釋2、3、4倍，配制為不同濃度核桃瓣膜多酚樣液。

1.3.2 核桃瓣膜提取物組分分析

采用高效液相色譜法[20-24]。流動相為甲醇(B)和體積濃度為0.1%的甲酸(D)。用以下梯度洗脫樣品：0～30 min:5% B液，95% D液；30～45 min：60% B液，40%D液；45～55 min：5% B液，95% D液，流速為1 mL/min，進樣體積為10 μL，柱溫保持在30 ℃，在280 nm下獲得色譜圖。以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)對11種標(biāo)準(zhǔn)品建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，代入樣品峰面積求得樣品中各成分質(zhì)量濃度，將質(zhì)量濃度換算成質(zhì)量分數(shù)。

1.2.3 核桃瓣膜多酚抗氧化能力測定

1.2.3.1 還原力測定

參考SOUSA[25]的方法，稍作改進。取1 mL不同濃度的核桃瓣膜樣液，2.5 mL 0.2 mol/L、pH 6.6磷酸鹽緩沖溶液和2.5 mL 1%鐵氰化鉀溶液，于試管中混勻，在50 ℃條件下水浴20 min，冰水冷卻后加入2.5 mL 10%三氯乙酸溶液，取混合液2.5 mL，加入2.5 mL蒸餾水和0.5 mL 0.1% FeCl3溶液，混勻，在700 nm波長處測定吸光度。

1.2.3.2 DPPH自由基清除能力測定

采用MOTAMED等[26]的方法并稍作修改。將0.1 mmol/L DPPH與80%甲醇混合，取上述DPPH溶液1 mL于試管中，并向其中逐漸加入不同濃度核桃瓣膜樣液，當(dāng)DPPH溶液顏色完全褪去時，用此時所加樣品量作為最大用量，再向前等差遞減4個樣品量。當(dāng)加樣量達到15 μL時DPPH溶液顏色褪去，因此取15、12、9、6 μL四個加樣量。取DPPH溶液1 mL 于試管中，加入樣品液xμL，再加入(2 000-x)μL 80%甲醇至溶液體積為3 mL，避光靜置30 min，在517 nm處測定其吸光度值A(chǔ)。取DPPH溶液1 mL和80%甲醇1 mL，充分混合，測定其吸光值A(chǔ)0。DPPH自由基清除能力可用式(1)表示：

(1)

式中：Y1，DPPH自由基清除率，%；A0，對照；A，不同加樣量的吸光度值。

1.2.3.3 羥自由基清除能力測定

采用水楊酸法[27]。取2 mL不同濃度核桃瓣膜樣液，依次加入2 mL 6 mmol/L FeSO4、2 mL 6 mmol/L水楊酸-乙醇溶液、2 mL 6 mmol/L H2O2溶液，37 ℃反應(yīng)30 min后，在波長510 nm處測定吸光度A，以60%乙醇代替樣品測其吸光度值A(chǔ)1，以60%乙醇代替樣品和過氧化氫測其吸光度值A(chǔ)0。按式(2)計算羥自由基清除率：

(2)

式中：Y2，羥自由基清除率，%；A，樣品吸光度值；A1，以60%乙醇代替樣品的對照吸光度值；A0，以60%乙醇代替樣品和H2O2的吸光度值。

1.2.4 羊肉理化指標(biāo)的測定

1.2.4.1 菌落總數(shù)測定

參考國標(biāo)《食品微生物學(xué)檢驗菌落總數(shù)測定》[28]。將羊肉剁碎成肉末，分別稱取約1 g于20支50 mL離心管中，再加入2 mL不同濃度核桃瓣膜樣液，25 ℃ 放置12 h，加入8 mL無菌生理鹽水，混勻，制成1∶10樣品勻液，按照十倍稀釋法將樣液稀釋為1∶100、 1∶1000、1∶10 000、1∶100 000四個梯度，篩選適宜的稀釋倍數(shù)，然后計數(shù)添加不同濃度瓣膜提取物羊肉中菌落總數(shù)。

1.2.4.2 羊肉氨氮化合物含量測定

采用納氏試劑分光光度法并稍作改進[29]。分別在8個50 mL容量瓶中加入0、0.5、1、2、4、6、8、10 mL 10 μg/mL的氯化銨，加水至標(biāo)線，加入1 mL 500 g/L的酒石酸鉀鈉溶液，再加入納氏試劑，搖勻，靜置10 min。 在420 nm下，以水作參比測量吸光度。以氨氮化合物濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得其截距(a=0.003 1)和斜率(b=0.003 5)。在20支50 mL離心管中分別加入約1 g羊肉肉末，再加入2 mL不同濃度核桃瓣膜樣液，25 ℃放置12 h， 過濾，測定樣液吸光度，按照式(3)計算羊肉中氨氮化合物質(zhì)量濃度。

(3)

式中：ρN，羊肉氨氮化合物質(zhì)量濃度，mg/L；As，肉樣吸光度；Ab，空白吸光度；a，標(biāo)準(zhǔn)曲線截距；b，標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率；V，肉樣濾液體積，mL。

1.2.4.3 羊肉揮發(fā)性鹽基氮含量測定

參照國標(biāo)《食品中揮發(fā)性鹽基氮的測定》中的微量擴散法[30]。稱取約1 g羊肉肉末20份，分別加入20支50 mL離心管中，并向其中加入2 mL不同濃度核桃瓣膜樣液，25 ℃放置12 h，加入10 mL去離子水，振蕩浸漬30 min，過濾。在擴散皿邊緣涂抹水溶性膠，中央加入1 mL 20 g/L硼酸溶液及甲基紅亞甲基藍混合指示劑，吸取1 mL濾液加入外室，蓋上磨砂玻璃蓋，在開口處加入1 mL飽和碳酸鉀，將磨砂蓋推平，輕輕搖晃擴散皿，37 ℃放置2 h，待其冷卻至室溫，使用0.01 mol/L鹽酸滴定直至紫紅色且15 s內(nèi)不變色，記錄所用鹽酸體積。按照式(4)計算樣品中揮發(fā)性鹽基氮的含量。

(4)

式中：X,樣品中揮發(fā)性鹽基氮質(zhì)量濃度， mg/L；V1,樣品消耗鹽酸的體積；V2，試劑空白消耗鹽酸的體積；c，鹽酸濃度為0.01 mol/L；14，滴定1 mL鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液相當(dāng)?shù)牡馁|(zhì)量,g/mol；m，試樣質(zhì)量或體積；V，使用的濾液體積；V0，樣液總體積；100，計算結(jié)果換算為mg/100 g的換算系數(shù)。

1.2.4.4 羊肉ATP含量測定

采用增強型ATP檢測試劑盒。將ATP標(biāo)準(zhǔn)液稀釋為0.01、0.03、0.1、0.3、1、3、10 μmol/L。分別稱取約1 g羊肉肉末于20支50 mL離心管中，向其中加入2 mL不同濃度核桃瓣膜樣液，25 ℃放置12 h，取經(jīng)過處理的肉樣20 mg，加入100 μL裂解液，勻漿，4 ℃ 下12 000×g離心5 min，取上清備用。取100 μL ATP檢測工作液于試管中，室溫放置3～5 min，再加入20 μL標(biāo)準(zhǔn)品或樣品，混勻，間隔2 s，使用熒光分光光度計測定標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的化學(xué)發(fā)光強度，以發(fā)光強度為縱坐標(biāo)，ATP濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(y=0.188x+0.102 5，R2= 0.991 7)，將樣品發(fā)光強度帶入標(biāo)準(zhǔn)方程得到其ATP濃度。

1.2.4.5 羊肉黃曲霉毒素含量測定

采用黃曲霉毒素B1試劑盒。分別在20支50 mL離心管中加入約1 g羊肉肉末，再加入2 mL不同濃度核桃瓣膜樣液，25 ℃放置12 h，分別加8 mL正己烷和10 mL 70%甲醇，振蕩5 min，室溫400 ×g離心10 min，棄上層液體，取下層液體0.5 mL加入去離子水0.5 mL，混勻，再取混勻液體0.5 mL，加入35%甲醇0.5 mL，振蕩30 s，將標(biāo)準(zhǔn)液和樣液加入酶標(biāo)板，全波長酶標(biāo)儀于450 nm下測定吸光度值,以標(biāo)準(zhǔn)液百分吸光度值為縱坐標(biāo)，對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)液濃度的對數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)液的半對數(shù)曲線圖(y=-0.218lnx- 0.050 7，R2=0.992 7)。將樣本的百分吸光度值帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到相應(yīng)的濃度，乘以對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣品黃曲霉毒素的實際濃度。按照式(5)計算百分吸光度值。

(5)

式中：A，吸光度值；A0，空白吸光度值。

1.2.4.6 羊肉色值測定

取20支50 mL離心管，分別加入約1 g羊肉肉末和2 mL不同濃度核桃瓣膜樣液，25 ℃放置12 h，過濾，取濾液，用黑板和白板矯正色差計后測定L*、a*值，比較不同處理下羊肉色度值變化。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

所有實驗平行重復(fù)5次，試驗數(shù)據(jù)均運用SPSS 19.0軟件進行單因素方差分析，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(±SD)”表示，采用LSD法5%水平檢驗組間差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同體積分數(shù)乙醇對核桃瓣膜多酚提取結(jié)果及組成分析

由圖1可知，體積分數(shù)為60%的乙醇對核桃瓣膜多酚提取率(0.52%)顯著高于其他體積分數(shù)(P<0.05)。 劉麗香[31]采用不同體積分數(shù)乙醇提取甘薯葉多酚，其最佳乙醇提取體積分數(shù)為70%，與本文結(jié)果類似。結(jié)果提示，核桃瓣膜多酚應(yīng)該有水溶性和有機溶劑溶解型兩類，該乙醇體積分數(shù)有利于二者溶出。

圖1 不同體積分數(shù)乙醇溶液對核桃瓣膜提取物提取率的影響Fig.1 The effect of different volume concentrations of ethanol on the extraction ratio of diaphragma juglandis注：不同小寫字母代表差異顯著(P<0.05)。

HPLC分析結(jié)果表明，核桃瓣膜提取物主要為多酚類物質(zhì)，依次為沒食子酸、原兒茶酸、兒茶素、綠原酸、蘆丁、鞣花酸(圖2-a)，其質(zhì)量分數(shù)分別為1.66、0.97、 9.72、3.01、0.68、0.93%。

a-核桃瓣膜多酚組分分析：1～6分別為沒食子酸、原兒茶酸、兒茶素、綠原酸、蘆丁、鞣花酸；b-茶多酚組分分析：1～4分別為沒食子酸、原兒茶酸、兒茶素、表兒茶素圖2 核桃瓣膜提取物組分分析Fig.2 Component analysis of diaphragma juglandis extract

經(jīng)與對照茶多酚組成成分(圖2-b)(沒食子酸、原兒茶酸、兒茶素、表兒茶素)比較，核桃瓣膜多酚種類多于茶多酚，且兒茶素含量高于茶多酚，研究報道兒茶素、綠原酸、鞣花酸均具有抗氧化和抑菌的作用[32-37]，結(jié)果提示核桃瓣膜多酚可能具有同茶多酚類似的生物活性。

2.2 核桃瓣膜提取物抗氧化效果

抗氧化劑可將鐵氰化鉀中的Fe3+還原為Fe2+，測定核桃瓣膜提取物對鐵氰化鉀還原能力，結(jié)果表明，吸光度值隨著提取物質(zhì)量濃度的增加顯著增大(P<0.05) (圖3-A)，可見核桃瓣膜提取物具有鐵氰化鉀還原能力；采用不同濃度的核桃瓣膜提取物處理，隨著提取物濃度的增加，DPPH自由基清除率顯著增大(P<0.05)，當(dāng)提取物濃度為0.52 mg/mL時，清除率達到89%(圖3-B)；提取物濃度在0.13、0.17 mg/mL時，羥基自由基清除率無顯著性差異(P<0.05)，濃度繼續(xù)增加時清除率才開始顯著增大(P<0.05)(圖3-C)。

A-還原鐵氰化鉀能力；B-DPPH自由基清除能力；C-羥自由基清除能力圖3 核桃瓣膜提取物的抗氧化效果Fig.3 Antioxidant effect of extract from diaphragma juglandis注：不同小寫字母代表差異顯著(P<0.05)。下同。

令狐晨等[38]研究表明，分心木還原能力、DPPH自由基及羥自由基清除能力與其濃度成劑量關(guān)系，與本文研究結(jié)果接近。結(jié)果顯示，核桃瓣膜提取物具有良好的抗氧化效果，這可能是由于核桃瓣膜提取物主要成分為酚類物質(zhì)，而多酚中的鄰位酚羥基極易被氧化，對自由基有較強的捕捉能力，所以具有良好的抗氧化效果[39-40]。

2.3 核桃瓣膜提取物對羊肉保鮮效果

菌落總數(shù)是反映肉品質(zhì)的重要指標(biāo)。由表1可見，隨著核桃瓣膜提取物濃度的增大羊肉菌落總數(shù)顯著減小(P<0.05)，這可能是因為提取物中的酚類物質(zhì)破壞微生物細胞膜抑制微生物生長[41]，也可能是由于多酚螯合肉制品中的金屬離子使微生物代謝受阻或阻礙微生物蛋白質(zhì)表達和酶活性來抑制其生長繁殖[42]。

采用不同濃度核桃瓣膜提取物處理羊肉，常溫過夜，分別測定其氨氮化合物、揮發(fā)性鹽基氮及ATP含量，其結(jié)果見圖4。

表1 核桃瓣膜提取物對羊肉中菌落總數(shù)的影響Table 1 Effects of diaphragma juglandis extract on the total colony number in mutton

注：不同小寫字母代表差異顯著(P<0.05)。

圖4 核桃瓣膜提取物對羊肉氨氮化合物及揮發(fā)性鹽基氮含量的抑制效果Fig.4 Inhibition effect of diaphragma juglandis extract on ammonia nitrogen compounds and volatile base nitrogen in mutton注：不同小寫字母代表差異顯著(P<0.05)。

隨著提取物濃度增大，羊肉氨氮化合物和揮發(fā)性鹽基氮含量顯著降低(P<0.05)，當(dāng)核桃瓣膜提取物質(zhì)量濃度達到0.17 mg/mL時對羊肉揮發(fā)性鹽基氮抑制作用即達到最大(圖4)；隨核桃瓣膜提取物濃度的增大羊肉中ATP含量顯著下降(P<0.05)(圖5)。ATP含量同微生物數(shù)量線性正相關(guān)[43]，核桃瓣膜提取物抑制微生物生長繁殖，因此其可抑制ATP產(chǎn)生，這也與氨氮化合物、揮發(fā)性鹽基氮測定結(jié)果相一致。

圖5 核桃瓣膜提取物對羊肉ATP含量的抑制效果Fig.5 Inhibition effect of diaphragma juglandis extract on ATP in mutton

2.4 核桃瓣膜提取物對羊肉黃曲霉毒素的抑制作用

黃曲霉毒素具有較高的肝毒性，可引發(fā)多種癌癥，是食品品質(zhì)檢測的重要指標(biāo)。由圖6可見，低濃度核桃瓣膜提取物對羊肉黃曲霉毒素產(chǎn)生無顯著抑制作用(P>0.05)，當(dāng)桃瓣膜提取物濃度達到0.26 mg/mL時，羊肉黃曲霉毒素含量隨濃度增加顯著降低(P<0.05) (圖6)。結(jié)果表明，核桃瓣膜提取物可抑制羊肉黃曲霉毒素產(chǎn)生。這可能是多酚類物質(zhì)與黃曲霉直接結(jié)合的緣故，也可能是其干擾了黃曲霉胞內(nèi)氧化反應(yīng)從而抑制黃曲霉毒素的合成[44-46]。

圖6 核桃瓣膜提取物對羊肉黃曲霉毒素的抑制作用Fig.6 Inhibition effect of diaphragma juglandis extract on aflatoxin in Mutton

2.5 核桃瓣膜提取物對羊肉的護色作用

采用不同濃度核桃瓣膜提取物處理羊肉后，測定其色值，結(jié)果表明，隨著其提取物濃度增加，羊肉紅值(a*)顯著增加(P<0.05)，同時其亮度值(L*)也顯著增大(P<0.05)(圖7)，說明核桃瓣膜提取物對羊肉具有良好的護色效果，這是可能是基于多酚類物質(zhì)具有抑制肌紅蛋白自動氧化和脂質(zhì)過氧化的作用[47-50]。

圖7 核桃瓣膜提取物對羊肉的護色作用Fig.7 Effect of diaphragma juglandis extract on mutton color

3 結(jié)論

核桃瓣膜常被用作藥食資源，關(guān)于其保鮮作用及機理的研究對促進人類健康和開發(fā)天然抗氧化劑、抑菌劑具有重要意義。本文分析核桃瓣膜提取物組分及其抗氧化作用，并進行羊肉保鮮效果分析，結(jié)果表明，60%乙醇對核桃瓣膜提取率(0.52%)最高，提取物主要組成成分為多酚類物質(zhì)(沒食子酸、原兒茶酸、兒茶素、綠原酸、蘆丁、鞣花酸)，其具有鐵氰化鉀還原能力、DPPH自由基和羥基自由基清除能力，對羊肉中菌落總數(shù)、ATP、揮發(fā)性鹽基氮、氨氮化合物及黃曲霉毒素的含量具有顯著抑制效果，同時對羊肉色澤也具有良好的保護作用。本研究為核桃瓣膜的開發(fā)和應(yīng)用提供了理論依據(jù)。