李曉毓，曹瑩瑩，耿雪晴，李昆，徐子豪，楊森，姚婷

1(黃山學(xué)院 生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，安徽 黃山，245041)2(蘭州理工大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州，730050) 3(黃山學(xué)院現(xiàn)代教育技術(shù)中心，安徽 黃山，245041)

脂肪是人體營養(yǎng)所必需的，但攝入過多可能帶來肥胖、脂肪肝、高血脂等危害[1-2]，低脂/無脂食品逐漸受到人們的喜愛。在肉制品生產(chǎn)中，低脂肉制品已成為一種發(fā)展趨勢。將脂肪替代品魔芋葡甘露聚糖(konjac glucomannan，KGM)應(yīng)用于低脂肉制品中具有與傳統(tǒng)肉制品相似的感官性狀，但在人體內(nèi)被消化釋放的能量又比天然油脂少或者不被消化，既降低了傳統(tǒng)肉制品的脂肪含量又彌補(bǔ)了口味的損失，同時預(yù)防了疾病的發(fā)生，有著廣闊的發(fā)展前景[3]。

KGM是一種天然、安全、營養(yǎng)、且具有減肥、降血脂等生理功能的食品添加劑，被認(rèn)為是天然的脂肪代替物，具有很好的改善肉制品品質(zhì)的作用。陳潔等[4]發(fā)現(xiàn)KGM的加入改善了重組火腿的物性，使其咀嚼性降低，彈性改善；倪學(xué)文等[5]在混合肉糜添加不同量KGM可明顯改善肉糜的質(zhì)構(gòu)特性和凝膠特性；劉虎成等[6]用復(fù)配魔芋膠部分代替肉制品中的脂肪可使其外觀、口感、持水性等各方面達(dá)到模擬高脂肉制品的要求；孫姣林等[7]用魔芋精粉-豬皮漿-淀粉制備混合凝膠50%替代肥肉丁生產(chǎn)中式香腸取得較好的效果；扶慶權(quán)等[8]將魔芋復(fù)配膠0.6%加入香腸類產(chǎn)品中，產(chǎn)品質(zhì)構(gòu)有明顯提升；CHIN等[9]利用魔芋粉-淀粉共混物作為脂肪替代品用于香腸中，香腸感官品質(zhì)無不良影響，脂肪含量從30%下降到2%。目前，關(guān)于KGM的研究多集中在物性學(xué)分析、感官評價方面[4-13]，深入探討KGM與蛋白質(zhì)作用機(jī)制、改變食品物性的機(jī)理等研究較少。

在肌肉與肌原纖維蛋白層面探討KGM與蛋白質(zhì)作用機(jī)制的研究常受限于其復(fù)雜的體系，因此針對單體蛋白的基礎(chǔ)研究非常必要。占肉總重15%～22%的肌肉蛋白主要有三類：肌漿蛋白(水溶性蛋白)、肌原纖維蛋白(鹽溶性蛋白)和基質(zhì)蛋白(不溶性蛋白)。肌球蛋白是肌肉中含量最高也是最重要的蛋白質(zhì)，約占肌原纖維蛋白質(zhì)的50%～55%，占肌肉總蛋白質(zhì)的1/3，具有很好的凝膠能力，在加熱或者高壓下發(fā)生變性聚集形成凝膠，從而影響到肉制品的質(zhì)構(gòu)、外觀和出品率，被認(rèn)為是在肉制品質(zhì)構(gòu)特性中起主要作用的蛋白質(zhì)[14-15]?；诖?，本文以KGM作為脂肪替代品應(yīng)用于中式香腸中，通過比較與普通肉制品在顏色、蒸煮損失、脂肪含量、蛋白質(zhì)含量、感官評價等方面的變化確定KGM最佳添加量；同時在此基礎(chǔ)上提取對肉糜類制品的質(zhì)構(gòu)特性起主要作用的肌球蛋白，將不同配比的KGM與肌球蛋白混合制成凝膠，利用紅外光譜、熒光分析、掃描電鏡等技術(shù)，從肌球蛋白分子結(jié)構(gòu)/構(gòu)象變化和各種化學(xué)作用力對凝膠形成貢獻(xiàn)的角度，探討KGM對中式香腸中肌球蛋白熱凝膠形成的具體作用，為低脂凝膠類肉制品的開發(fā)提供理論指導(dǎo)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

材料：新鮮豬肉，購于黃山市大潤發(fā)超市；KGM(食品級)，符合國家食品添加劑標(biāo)準(zhǔn)要求。

試劑：NaOH，K2HPO4，KH2PO4，KCl，乙二胺四乙酸(EDTA)，焦磷酸鈉，哌嗪-1,4-二乙磺酸(PIPES)，Na2HPO4，(NH4)2SO4，上海國藥集團(tuán)，所有試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

臺式高速離心機(jī)(TG16-WS型)，上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司；HH6-數(shù)顯恒溫水浴鍋，江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；電子分析天平(AUY220型)，日本島津；掃描電鏡(S-3400N型)，日本日立公司；熒光光譜儀(F-4500型)，日本日立公司；傅立葉紅外光譜儀(Nicolet 380型)，美國Nicolet公司。

1.3 方法

1.3.1 中式香腸的制備

試驗設(shè)6個處理組，均采用相同加工工藝，流程如下：稱取新鮮豬肉十斤，瘦肉與肥肉的質(zhì)量比為7∶3。 將瘦、肥肉分別切成小丁，肥肉切丁后用溫水洗凈濾干。將白酒(60°大曲酒100 g)、白砂糖(150 g)、食鹽(100 g)、生抽(100 g)等調(diào)料放入盆中，倒入肥肉丁攪拌均勻，腌制1～2h，再放入瘦肉一起攪拌均勻。最后放在絞肉機(jī)(孔徑：1～1.2 cm)內(nèi)絞碎。分別加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0%，0.5%，1.0%，1.5%，2.0%和2.5%的KGM與瘦肉和肥肉丁攪拌均勻；灌腸(豬腸衣)后置于日光下曝曬，烘烤，自然風(fēng)干。

1.3.2 蒸煮損失的測定

香腸經(jīng)過蒸煮過后，冷卻至室溫，稱重，每組測3個平行樣。香腸蒸煮損失的計算式如公式(1)：

(1)

式中：L為香腸蒸煮損失的質(zhì)量分?jǐn)?shù)；N0為蒸煮之前香腸的質(zhì)量,g；N1為蒸煮之后香腸的質(zhì)量，g。

1.3.3 蛋白質(zhì)及脂肪含量的測定

蛋白質(zhì)含量的測定參照GB 5009.5—2016《食品中蛋白質(zhì)的測定》方法一[16]。脂肪含量的測定參照GB 5009.6—2016 《食品中脂肪的測定》方法二[17]。

1.3.4 表征分析

采用2003年徐幸蓮[18]的方法提取豬肉糜中的肌球蛋白，將提取的肌球蛋白稀釋到20 mg/mL(溶于0.6 mol/L NaCl pH 6.5，20 mmol/L Na2HPO4/ NaH2PO4， 磷酸鹽緩沖液)。加入不同水平的KGM(0%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%)混合，在65 ℃ 條件下水浴加熱，使之呈現(xiàn)為凝膠狀態(tài)。將其倒置在干凈的托盤中，放在真空冷凍干燥機(jī)中冷凍干燥8～12 h后成粉末狀，待用。

1.3.4.1 紅外分析

采用KBr壓片法，分辨率為4 cm-1，對混合凝膠樣品在4 000～400 cm-1范圍進(jìn)行掃描。

1.3.4.2 熒光分析

激發(fā)波長463 nm，掃描范圍：300～800 nm，掃描速率：2 400 nm/min，λex為5.0 nm，λem為5.0 nm。

1.3.4.3 電鏡掃描

將樣品置于-38 ℃低溫冷凍24 h，凍干后的混合凝膠樣品經(jīng)真空離子噴金，在掃描電鏡下觀察內(nèi)部結(jié)構(gòu)。

1.3.5 香腸的感官評定

感官評定由8位有經(jīng)驗的學(xué)生組成的感官評定小組完成。隨機(jī)抽取等量的香腸樣品放入盤中，100 ℃下蒸15 min，切成均勻薄片進(jìn)行評定。感官評分標(biāo)準(zhǔn)列于表1。

表1 中式香腸感官評分標(biāo)準(zhǔn)表Table 1 Criteria of sensory evaluation on Chinese-style sausage

2 結(jié)果與分析

2.1 KGM添加量的優(yōu)化比較

2.1.1 KGM對香腸蒸煮損失的影響

蒸煮損失是肉制品加工中的一個重要指標(biāo)，蒸煮損失越少，其肉制品的質(zhì)量就越好，產(chǎn)品率就越高。圖1為KGM不同添加量對香腸蒸煮損失的影響，可以看出6種添加量均存在顯著差異(P<0.05)，KGM添加量為1.5%時蒸煮損失最小。表明KGM可以與水分子通過氫鍵、分子偶極、瞬時偶極等作用力聚集成龐大而難以自由運(yùn)動的大分子從而將水分子固定[19]，同時，與香腸中的蛋白質(zhì)形成絡(luò)合物，形成致密的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步將水分子固定[20]，有效減少了蒸煮過程中帶來的損失，使得香腸具有很好的彈性和保水性，提高肉制品質(zhì)量。

圖1 KGM添加對蒸煮損失的影響Fig.1 Effects of KGM on the cooking loss

2.1.2 KGM對香腸脂肪含量、蛋白質(zhì)含量的影響

對添加不同量KGM制成的中式香腸其蛋白質(zhì)含量進(jìn)行單因素方差分析可以看出，6種添加量均存在顯著差異(P<0.05)。由圖2可知，空白組樣品中脂肪提取量為38.44 g/100 g；添加KGM的樣品中，脂肪提取量均低于空白組，其中KGM添加量為1.5%的樣品中脂肪含量減少最多，減幅為36.6%。這與已報道的文獻(xiàn)結(jié)果相符[12-13,21]。

圖2 KGM添加對脂肪提取量的影響Fig.2 Effects of KGM on fat extraction

對添加不同量KGM制成的中式香腸其蛋白質(zhì)含量進(jìn)行單因素方差分析可以看出，6種添加量均存在顯著差異(P<0.05)。由圖3可知，添加KGM的香腸樣品蛋白質(zhì)提取量明顯高于空白樣品，KGM添加量增至1.5%的過程中，蛋白質(zhì)的提取量逐漸增加，由7.65%增至22.84%，一定程度上反映了添加KGM對中式香腸中蛋白質(zhì)的含量有影響。

圖3 KGM添加對蛋白質(zhì)含量的影響Fig.3 Effects of KGM on protein extraction

2.1.3 感官評定分析

感官評定主要根據(jù)評定小組人員食用香腸后對其視覺、觸覺、味覺以及整體接受度進(jìn)行評價分析。由香腸感官評定標(biāo)準(zhǔn)和結(jié)果(表1和2)可知，未添加KGM、KGM添加量為0.5%和1.0%的香腸顏色呈暗紅色，且普遍較硬；而隨著KGM的添加量由1.5%升至2.5% 時，部分香腸顏色由暗紅色轉(zhuǎn)成紅棕色，質(zhì)地由較硬變?yōu)樗绍?，評定人員對香腸的接受程度也隨著KGM添加量的增加而增加。這可能是由于KGM本身具有甜味，加入到香腸后，和香腸中蛋白質(zhì)結(jié)合形成具有彈性的凝膠，使得香腸變的松軟，從而產(chǎn)生獨特的咸甜風(fēng)味。因此，香腸中KGM添加量為1.5%和2.5%時口味最佳，接受程度最高。

表2 中式香腸感官評定Table 2 Results of sensory evaluation on Chinese-style sausage

綜上所述，添加KGM以及添加不同量的KGM對中式香腸的蒸煮損失、蛋白質(zhì)含量和脂肪含量均有影響。KGM添加量為1.5%時蒸煮損失最小，脂肪含量最少，蛋白質(zhì)含量最多，綜合感官評價，接受程度也高，最終確定KGM最佳添加量為1.5%。

2.2 KGM—肌球蛋白混合凝膠的表征分析

2.2.1 紅外分析

KGM標(biāo)準(zhǔn)樣品、肌球蛋白樣品以及混合凝膠樣品的紅外光譜圖如圖4所示。添加1.0%，1.5%，2.0% KGM的混合凝膠樣品、KGM標(biāo)準(zhǔn)品以及肌球蛋白樣品相同的羥基伸縮振動峰都為3 449 cm-1，但KGM標(biāo)準(zhǔn)品的羥基伸縮振動峰峰形較寬；添加1.0%，1.5%，2.0%KGM的混合凝膠樣品、KGM標(biāo)準(zhǔn)品以及肌球蛋白相同的-COCH3伸縮振動峰都在1 651 cm-1附近，與肌球蛋白標(biāo)準(zhǔn)品伸縮振動峰相比，加入KGM的混合凝膠樣品的-COCH3伸縮振動峰有所增強(qiáng)；肌球蛋白標(biāo)準(zhǔn)品在1 023 cm-1附近無明顯特征峰，而在加入KGM后各混合凝膠樣品分別出現(xiàn)了吸收峰，屬于C-O 伸縮振動峰，且KGM添加量為1.5%的峰形最寬；776 cm-1附近屬于C-H面的彎曲振動，在添加KGM之后的樣品相對強(qiáng)度較KGM標(biāo)準(zhǔn)品和肌球蛋白有所增加，其中KGM添加量為1.5%時樣品的相對強(qiáng)度增加最大。這是由于KGM分子與肌球蛋白分子2種分子間形成了新的較強(qiáng)的氫鍵，KGM分子中的-COCH3基團(tuán)和-OH基團(tuán)與肌球蛋白分子中的羥基相互作用并產(chǎn)生了良好穩(wěn)定性，這是多糖分子與蛋白質(zhì)分子相互作用的結(jié)果，KGM的加入使香腸的結(jié)構(gòu)更加緊密，穩(wěn)定性和韌性等都得到明顯改善[22]。

a-1.0% KGM；b-1.5% KGM；c-2.0% KGM；d-myosin；e-KGM。圖4 不同混合凝膠樣品紅外光譜圖Fig.4 Infrared spectrum of different myosin mixed gel

2.2.2 熒光分析

圖5列出了肌球蛋白標(biāo)準(zhǔn)品和混合凝膠樣品的熒光光譜圖。由圖5-A，5-B，5-C可知，1.0%，1.5%和2.0%混合凝膠樣品的發(fā)射峰在440～650 nm，主峰峰值分別為463、463和454 nm。

A-KGM添加量為1.0%；B-KGM添加量為1.5%；C-KGM添加量為2.0%；D-肌球蛋白圖5 不同混合凝膠樣品熒光光譜圖Fig.5 Fluorescent spectrograms of different mixed gel

與肌球蛋白(圖5-D)相比，1.0%混合凝膠的熒光強(qiáng)度比肌球蛋白的熒光強(qiáng)度略強(qiáng)，且隨著KGM含量增加，1.5%和2.0%混合凝膠的熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，其中2.0%的混合凝膠熒光強(qiáng)度達(dá)1.00 A.U。推測可能是KGM與肌球蛋白結(jié)合發(fā)生相互作用，使得肌球蛋白的熒光集團(tuán)的環(huán)境發(fā)生改變，熒光效應(yīng)增強(qiáng)。這與紅外分析結(jié)果趨勢相一致。

2.2.3 微觀結(jié)構(gòu)分析

圖6分別列出了肌球蛋白樣品，KGM標(biāo)準(zhǔn)品和混合凝膠樣品的顯微結(jié)構(gòu)圖。由圖6可知，肌球蛋白(圖6-D)表面光滑，呈片狀，結(jié)構(gòu)松散，有許多的小顆粒狀物質(zhì)分布，這使得肌球蛋白本身水分保持能力較差；添加KGM 1.0%(圖6-A)、1.5%(圖6-B)、2.0%(圖6-C)的混合凝膠樣品中蛋白質(zhì)與KGM相互連接，形成致密的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中的空隙有助于牢牢將水分子固定住，并能阻止水分及其營養(yǎng)物質(zhì)的流失[23-28]。

A-KGM添加量為1.0%；B-KGM添加量為1.5%；C-KGM添加量為2.0%；D-肌球蛋白；E-KGM標(biāo)準(zhǔn)品圖6 不同混合凝膠樣品掃描電鏡圖Fig.6 Scanning electron micrographs of different mixed gel

其中，1.5%的混合凝膠樣品(圖6-B)中蛋白質(zhì)與KGM的結(jié)構(gòu)尤其緊密，蛋白質(zhì)將KGM緊緊包裹住，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)之間的空隙更小，使得其產(chǎn)生更好的持水能力，保留脂肪等營養(yǎng)物質(zhì)的能力，與本文添加KGM對蒸煮損失、感官測定和營養(yǎng)物質(zhì)分析的結(jié)果一致。

3 結(jié)論

將KGM添加到肉制品中對其品質(zhì)及凝膠特性均有影響。添加KGM的香腸樣品蒸煮損失明顯減小，保水性增強(qiáng)，脂肪含量降低，蛋白質(zhì)含量增加，結(jié)合感官評定綜合得出，KGM最佳添加量(質(zhì)量分?jǐn)?shù))為1.5%；在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步提取對肉糜類制品的質(zhì)構(gòu)特性起主要作用的肌球蛋白，與不同比例的KGM制成混合凝膠，紅外、熒光以及電鏡分析表明，添加不同KGM對肌球蛋白凝膠形成影響顯著，KGM與肌球蛋白間形成了新的氫鍵，從而結(jié)合形成穩(wěn)定而致密的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，其中，KGM添加量(質(zhì)量分?jǐn)?shù))為1.5%時結(jié)構(gòu)最為致密。綜合感官評定及整體接受性得出，低脂香腸制備中KGM添加量(質(zhì)量分?jǐn)?shù))為1.5% 時，香腸蒸煮損失小，蛋白質(zhì)的含量增加及脂肪含量降低明顯，形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)穩(wěn)定致密，凝膠特性，持水能力、彈性、口感均較好。