李益烽，方芳*

1(工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室(江南大學(xué))，江蘇 無錫，214122) 2(食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室(江南大學(xué))，江蘇 無錫，214122)

葡萄糖醛酸(glucuronic acid，GlcUA)又稱葡糖醛酸、葡醛酸，分子式C6H10O7，分子質(zhì)量為194.14，能溶于水，微溶于乙醇。葡萄糖醛酸存在于多種動植物中，它是葡萄糖C-6位上的羥基被氧化而形成的羧酸[1]。在人體和動物中，葡萄糖醛酸以尿苷二磷酸葡萄糖醛酸(uridine diphosphate glucuronic acid，UDP-GlcUA)的活性供體形式存在。微生物可以通過肌醇氧化途徑氧化肌醇生成葡萄糖醛酸[2]，有些微生物則合成細(xì)胞外結(jié)合型葡萄糖醛酸，即胞外多糖[3-5]。葡萄糖醛酸可以與人體內(nèi)的多種毒素結(jié)合后排出體外，因而可以作為一種解毒劑[6]。此外，人體每天攝入適量的葡萄糖醛酸可以有效地預(yù)防多種退行性疾病[7]。D-葡萄糖醛酸也是構(gòu)成肝素、軟骨素，透明質(zhì)酸等功能營養(yǎng)化學(xué)品的單體之一[8]。因此，葡萄糖醛酸被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥，化妝品，保健食品等領(lǐng)域[7,9]。

目前工業(yè)化生產(chǎn)葡萄糖醛酸主要是采用濃硝酸氧化淀粉的化學(xué)合成法[9]。化學(xué)合成法成本低，但是反應(yīng)體系復(fù)雜，氧化選擇性較差且氧化程度無法有效控制，因此存在副反應(yīng)多、產(chǎn)物分離困難等問題[9]。根據(jù)上述缺點，研究者進(jìn)行了工藝和條件的改進(jìn)：林培喜等改用堿法水解減少污染[10]；郭耀基等從廢液中二次回收增加了產(chǎn)品的回收率[11]；房媛通過超聲波預(yù)處理，以芬頓試劑為氧化劑，并結(jié)合酶法清潔生產(chǎn)葡萄糖醛酸及內(nèi)酯[12]。但淀粉氧化法仍存在各種限制性因素，因此必須尋找更加綠色高效的方法。利用微生物法生產(chǎn)葡萄糖醛酸目前處于初步研究階段，用于合成葡萄糖醛酸的菌株有限，產(chǎn)量也較低。由于葡萄糖醛酸是葡萄糖二酸合成的前體，構(gòu)建大腸桿菌基因工程菌合成葡萄糖二酸的過程，也實現(xiàn)了葡萄糖醛酸的生物合成[2,13-14]。在大腸桿菌中通過構(gòu)建肌醇氧化途徑以及過量表達(dá)肌醇氧化酶(myo-inositol oxidase，MIOX)，使得葡萄糖醛酸產(chǎn)量達(dá)到3.94 g/L[13-23]。此外，也有研究者利用酶法降解微生物發(fā)酵產(chǎn)生的多糖或多糖醛酸獲得葡萄糖醛酸。但是由于酶的特異性問題和對多糖降解的不充分性，獲得的產(chǎn)物為不飽和葡萄糖醛酸單體、二聚體和三聚體，該方法仍處于研究階段[4]。

本研究旨在篩選一株具有合成葡萄糖醛酸潛力的菌株，并通過單因素發(fā)酵條件優(yōu)化，補料方法考察，初步提高發(fā)酵法合成葡萄糖醛酸的水平。

1 材料與方法

1.1 菌株、試劑和培養(yǎng)基

菌株：AspergillusoryzaeNRRL3448，購自中國微生物菌種保藏中心；其余菌株均為本研究室保藏，其中ZygosaccharomycesrouxiiZSR2，BacilluscereusH3，BacilluscereusH4，BacilluscereusH7均分離自紅茶菌，CandidaorthopsilosisY3分離自醬油醬醪。

葡萄糖、蔗糖、大豆蛋白胨、KH2PO4、檸檬酸銨均購自國藥集團(tuán)股份有限公司；蛋白胨和酵母提取物購自O(shè)xoid公司；葡萄糖醛酸標(biāo)樣購自Solarbio公司。

種子培養(yǎng)基(g/L)：酵母提取物5，蛋白胨20，葡萄糖20。固體培養(yǎng)基加入20瓊脂?；A(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖20，大豆蛋白胨10，KH2PO41.5。

1.2 儀器與設(shè)備

ZQZY-VAF振蕩培養(yǎng)箱，上海知楚儀器有限公司；HH-B11·420BS恒溫培養(yǎng)箱，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司；ICS-5000離子色譜儀，賽默飛世爾科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 培養(yǎng)方法

種子培養(yǎng)：挑取單菌落接種于含 50 mL種子培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，30 ℃、220 r/min培養(yǎng)10 h。搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)：將種子培養(yǎng)液按1%的接種量接種到含50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，30 ℃、220 r/min培養(yǎng)20 h。單因素優(yōu)化后以最佳條件培養(yǎng)。

1.3.2 菌株篩選方法

根據(jù)菌株肌醇氧化酶活性進(jìn)行篩選，挑選酶活力較高的菌株，驗證其產(chǎn)葡萄糖醛酸的能力，選擇合適菌株進(jìn)行后續(xù)研究。本方法中使用的培養(yǎng)基包括：真菌篩選培養(yǎng)基(g/L)：酵母提取物5，葡萄糖20，蛋白胨20；細(xì)菌篩選培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨10，牛肉膏3，NaCl 5。

1.3.3 肌醇氧化酶酶活測定

以肌醇為底物，通過酶轉(zhuǎn)化肌醇生成葡萄糖醛酸的方法測定MIOX的活性[2]。酶活定義：1 min內(nèi)生成1 μmol醛酸所需要的酶量為1個酶活力單位。酶催化反應(yīng)：向900 μL含有50 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)，2 mmol/LL-半胱氨酸，1 mmol/L Fe(NH4)2(SO4)2和10 g/L肌醇的反應(yīng)液中添加100 μL酶液，30 ℃反應(yīng)1 h，加入100 μL的 30%三氯乙酸終止反應(yīng)。取1 mL反應(yīng)液，加入2 mL苔黑素試劑(每10 mL 濃鹽酸中加入40 mg苔黑素，10 mg FeCl3)，沸水中反應(yīng)15 min，冷卻后測定670 nm處吸光度。酶活以每克干菌體表示，即U/ g (DCW)。菌體干重測定：取10 mL培養(yǎng)液離心收集菌體，用無菌水洗滌2次，烘干至恒重稱重并計算菌體凈重。

1.3.4 葡萄糖醛酸含量測定

葡萄糖醛酸含量的測定采用改良的離子色譜法[19,24]。發(fā)酵液用超純水稀釋100倍，用0.22 μm微孔濾膜過濾后用離子色譜測定。以質(zhì)量濃度為0.1 g/L 的葡萄糖醛酸為標(biāo)準(zhǔn)品。

色譜條件：分離柱為IonPacAS11-HC (4×250 mm)，保護(hù)柱使用IonPacAG11-HC (4×50 mm)。淋洗液發(fā)生器(淋洗梯度設(shè)置)：0～15 min，0.8 mmol/L；15～27 min，0.8～12 mmol/L；27.1～31 min，45 mmol/L；31.1～35 min，0.8 mmol/L；流速：1.00 mL/min；柱箱溫度：30 ℃；進(jìn)樣量為25 μL，檢測使用抑制型電導(dǎo)，AERS 5004 mm。

1.3.5 單因素優(yōu)化

培養(yǎng)基碳氮源優(yōu)化：本研究中用于培養(yǎng)基組成優(yōu)化的碳源包括葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、果糖、山梨醇和甘露醇；氮源包括蛋白胨、大豆蛋白胨、牛肉膏、酵母提取物、尿素、硫酸銨、檸檬酸銨。

碳氮源優(yōu)化使用的培養(yǎng)基如下：碳源種類優(yōu)化培養(yǎng)基(g/L)：大豆蛋白胨10，KH2PO41.5，碳源含量為20 g/L(以葡萄糖計，其他碳源以相同碳摩爾數(shù)計)；碳源濃度優(yōu)化培養(yǎng)基(g/L)：大豆蛋白胨10，KH2PO41.5，蔗糖20～120；氮源種類優(yōu)化培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖20，KH2PO41.5，氮源含量為10 g/L(以大豆蛋白胨計，其他氮源以相同氮摩爾數(shù)計)；氮源濃度優(yōu)化培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖20，KH2PO41.5，大豆蛋白胨質(zhì)量濃度10～40 g/L。

發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH、種齡和接種量優(yōu)化：本研究中的培養(yǎng)條件優(yōu)化包括培養(yǎng)基初始pH、種齡和接種量，其中初始pH分別為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0, 種齡分別為6、7、8、9、10 h，接種量分別為1%、3%、5%、7%、10%。

1.3.6 發(fā)酵液中蔗糖含量測定

蔗糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：取蔗糖標(biāo)準(zhǔn)溶液(稱取1 g蔗糖，超純水溶解，稀釋到100、200、300、400、500 mg/L) 0.9 mL，加入2 mol/L NaOH 0.1 mL，100 ℃沸水浴10 min， 立即冷卻。再加入間苯二酚試劑(稱取0.1 g 間苯二酚，用6 mol/L HCl溶解，定容至100 mL)1 mL，10 mol/L HCl 3 mL，混勻，80 ℃水浴8 min，冷卻至室溫。在500 nm波長下測吸光度。

樣品中蔗糖含量測定：取稀釋至適當(dāng)倍數(shù)發(fā)酵液0.9 mL，操作同上。以蒸餾水作為空白對照。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算出樣品中蔗糖含量。

1.3.7 發(fā)酵液中氮含量檢測

根據(jù)食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中蛋白質(zhì)的測定中凱氏定氮法檢測發(fā)酵液中氮的含量[25]。

1.3.8 補料方法考察

補料種類考察：魯氏接合酵母ZSR2發(fā)酵至對數(shù)中后期(14 h)，向培養(yǎng)基中補加大豆蛋白胨(10 g/L)，以等量無菌水作為對照。每隔2 h取樣，檢測發(fā)酵液中菌體濃度和葡萄糖醛酸含量。

補料濃度考察：魯氏接合酵母ZSR2發(fā)酵至對數(shù)中后期(14 h)，向培養(yǎng)基中補加大豆蛋白胨(5～30 g/L)，以等量無菌水作為對照。每隔2 h取樣，檢測發(fā)酵液中菌體濃度和葡萄糖醛酸含量。

復(fù)合氮源配比考察：魯氏接合酵母ZSR2發(fā)酵至對數(shù)中后期(14 h)，向培養(yǎng)基中補加不同配比復(fù)合氮源(以氮含量計，大豆蛋白胨氮含量為10%)，其中有機(jī)氮源使用大豆蛋白胨，無機(jī)氮源使用檸檬酸銨，以等量無菌水作為對照。每隔2 h取樣，檢測發(fā)酵液中菌體濃度和葡萄糖醛酸含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)葡萄糖醛酸菌株的篩選

微生物合成葡萄糖醛酸途徑的關(guān)鍵酶為肌醇氧化酶。根據(jù)菌株肌醇氧化酶活性的高低以及菌株產(chǎn)酸水平，可以初步選擇用于發(fā)酵法生產(chǎn)葡萄糖醛酸的菌株。本研究比較了來源于紅茶菌和醬醪及實驗室保藏的菌株，發(fā)現(xiàn)肌醇氧化酶酶活較高的菌株有蠟樣芽孢桿菌H4,蠟樣芽孢桿菌H7，魯氏接合酵母ZSR2，蠟樣芽孢桿菌H3，米曲霉NRRL3448，魯氏接合酵母ZQ01，假絲酵母Y3(圖1-A)。但由于菌株肌醇氧化酶活力高低和產(chǎn)葡萄糖醛酸能力高低不具有絕對相關(guān)性，產(chǎn)葡萄糖醛酸的能力可能還與肌醇氧化途徑其他酶酶活、菌株代謝利用葡萄糖醛酸能力等相關(guān)，因此還需要檢測菌株產(chǎn)葡萄糖醛酸能力。發(fā)酵液中葡萄糖醛酸產(chǎn)量最高的菌株是魯氏接合酵母ZSR2，其合成葡萄糖醛酸的水平為1.13 g/L (圖1-B)。由于魯氏接合酵母ZSR2在合成葡萄糖醛酸能力和關(guān)鍵合成酶水平方面具有相對優(yōu)勢，選擇它為生產(chǎn)菌株進(jìn)行葡萄糖醛酸發(fā)酵條件優(yōu)化研究。

A-菌株肌醇氧化酶酶活比較；B-菌株產(chǎn)葡萄糖醛酸能力比較圖1 菌株肌醇氧化酶酶活和葡萄糖醛酸產(chǎn)量比較Fig.1 The comparison of MIOX activity and glucuronic acid yield between strains

2.2 魯氏接合酵母發(fā)酵產(chǎn)葡萄糖醛酸單因素優(yōu)化

2.2.1 發(fā)酵培養(yǎng)基碳源優(yōu)化

對發(fā)酵培養(yǎng)基碳源進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果見圖2。在考察的7種碳源中，魯氏接合酵母ZSR2以蔗糖和甘露醇作為碳源，可以獲得較高產(chǎn)量的葡萄糖醛酸，分別為3.94 和4.06 g/L。但蔗糖與甘露醇相比具有價格優(yōu)勢，因此選擇蔗糖作為發(fā)酵用碳源。對蔗糖濃度研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)蔗糖質(zhì)量濃度為80 g/L時，魯氏接合酵母ZSR2產(chǎn)葡萄糖醛酸產(chǎn)量達(dá)到最高，為7.97 g/L。

A-碳源種類對魯氏接合酵母產(chǎn)GlcUA影響；B-蔗糖質(zhì)量濃度對魯氏接合酵母產(chǎn)GlcUA影響圖2 碳源對魯氏接合酵母ZSR2產(chǎn)GlcUA影響Fig.2 Effect of carbon sources on production of GlcUA by Z. rouxii ZSR2

2.2.2 發(fā)酵培養(yǎng)基氮源優(yōu)化

對發(fā)酵培養(yǎng)基的氮源種類研究顯示，魯氏接合酵母ZSR2發(fā)酵產(chǎn)葡萄糖醛酸的最佳氮源為大豆蛋白胨。并且，當(dāng)大豆蛋白胨質(zhì)量濃度為30 g/L時，產(chǎn)酸量最高，達(dá)到8.65 g/L (圖3)。

A-氮源種類對產(chǎn)GlcUA影響；B-大豆蛋白胨對產(chǎn)GlcUA影響圖3 氮源對魯氏接合酵母ZSR2產(chǎn)GlcUA影響Fig.3 Effect of nitrogen sources on production of GlcUA by Z. rouxii ZSR2

2.2.3 發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH優(yōu)化

魯氏接合酵母的最適生長pH在5.0～5.5[26]。對紅茶菌產(chǎn)葡萄糖醛酸的研究表明，弱酸環(huán)境可在一定程度上促進(jìn)葡萄糖醛酸的合成[21]。為尋找有利于葡萄糖醛的發(fā)酵條件，考察了發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH對魯氏接合酵母ZSR2產(chǎn)葡萄糖醛酸的影響。由圖4可以看出，當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH為5.0時，魯氏接合酵母ZSR2產(chǎn)葡萄糖醛酸產(chǎn)量最高，為11.68 g/L。發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH低于5.0時以及偏中性的培養(yǎng)條件均不利于產(chǎn)酸。

圖4 初始pH對魯氏接合酵母ZSR2產(chǎn)GlcUA影響Fig.4 Effect of initial pH on production of GlcUA by Z. rouxii ZSR2

2.2.4 最適接種量和種齡的確定

對魯氏接合酵母ZSR2產(chǎn)葡萄糖醛酸種齡和接種量的研究表明，接種量為3%，種齡為9 h時，ZSR2產(chǎn)葡萄糖醛酸產(chǎn)量達(dá)到最高(圖5)。通過優(yōu)化種齡和接種量，魯氏接合酵母ZSR2產(chǎn)葡萄糖醛酸水平提高到13.02 g/L。在此基礎(chǔ)上，通過監(jiān)測魯氏接合酵母ZSR2發(fā)酵產(chǎn)葡萄糖醛酸的過程發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)酸量最高為魯氏接合酵母ZSR2生長的穩(wěn)定期。此時，菌體濃度(OD600) 達(dá)到11.6，葡萄糖醛酸產(chǎn)量為14.68 g/L，是優(yōu)化前的3.8倍(圖6)。

A-接種量對產(chǎn)GlcUA的影響；B-種齡對產(chǎn)GlcUA的影響圖5 接種量和種齡對魯氏接合酵母ZSR2產(chǎn)GlcUA影響Fig.5 Effect of inoculum size and age on production of GlcUA by Z.rouxii ZSR2

圖6 魯氏接合酵母ZSR2產(chǎn)GlcUA發(fā)酵過程曲線Fig.6 The fermentation process curve of glucuronic acid by Z. rouxii ZSR2

2.3 補料策略促進(jìn)魯氏接合酵母產(chǎn)葡萄糖醛酸

前期研究證實，魯氏接合酵母生長與葡萄糖醛酸的合成是偶聯(lián)的。對魯氏接合酵母產(chǎn)葡萄糖醛酸發(fā)酵過程培養(yǎng)基中碳源和氮源分析表明，發(fā)酵后期菌體生長和產(chǎn)酸減緩，此時培養(yǎng)基中碳源充足而氮源不足(圖7)。因此，確定采用補加氮源的方法促進(jìn)產(chǎn)酸。由于16 h時菌體生長已進(jìn)入穩(wěn)定期，此時培養(yǎng)基中氮源已消耗至50%以下，因此選擇在發(fā)酵第14 h補加氮源。由圖8可以看出，在發(fā)酵第14 h補加有機(jī)氮源大豆蛋白胨，可以同時促進(jìn)菌體生長及葡萄糖醛酸的合成。在發(fā)酵過程中，向培養(yǎng)基中補加20 g/L大豆蛋白胨后，菌體量和葡萄糖醛酸產(chǎn)量均為最高；發(fā)酵24 h時菌體OD600達(dá)到14.65，葡萄糖醛酸產(chǎn)量提高到18.15 g/L，比對照提高22.7%。

圖7 魯氏接合酵母ZSR2產(chǎn)GlcUA發(fā)酵過程碳氮源含量變化Fig.7 The change of carbon and nitrogen sources during fermentation on GlcUA production by Z.rouxii ZSR2

A-補加氮源對菌體生長的影響；B-補加氮源對產(chǎn)GlcUA的影響圖8 補加氮源對魯氏接合酵母ZSR2生長及產(chǎn)GlcUA影響Fig.8 The effect of nitrogen source feeding on growth of Z.rouxii ZSR2 and GlcUA synthesis

在實際工業(yè)生產(chǎn)中，增加培養(yǎng)基中有機(jī)氮源的含量會造成生產(chǎn)成本的增加。無機(jī)氮源成本較低，并且同有機(jī)氮源比是相對利用緩慢的氮源。因此，添加無機(jī)氮源對于降低生產(chǎn)成本有重要意義，也可能促進(jìn)產(chǎn)酸。通過比較采用復(fù)合氮源或無機(jī)氮源補料對魯氏接合酵母ZSR2產(chǎn)葡萄糖醛酸的影響發(fā)現(xiàn)，采用無機(jī)氮源檸檬酸銨不僅有利于魯氏接合酵母ZSR2生長，也促進(jìn)了其產(chǎn)酸。從圖9可看出，隨著復(fù)合氮源中檸檬酸銨的比例增加，菌體的生長加快、葡萄糖醛酸產(chǎn)量也不斷提高。當(dāng)復(fù)合氮源全為檸檬酸銨(11.56 g/L)時，菌體量在16 h達(dá)到最大，葡萄糖醛酸產(chǎn)量在20 h達(dá)到最高，為22.36 g/L，比對照高了49.9%。分析原因可能為魯氏接合酵母ZSR2發(fā)酵產(chǎn)葡萄糖醛酸是一個產(chǎn)酸的過程，發(fā)酵液pH會不斷下降，而過低的pH會抑制菌體的生長以及降低相關(guān)酶系的活力，而檸檬酸銨相比于大豆蛋白胨，除了為菌體提供營養(yǎng)物質(zhì)，還可以起到中和緩沖的作用，從而維持發(fā)酵液pH的穩(wěn)定，促進(jìn)魯氏接合酵母ZSR2生長和產(chǎn)酸。

A-不同復(fù)合氮源對菌體生長的影響；B-不同復(fù)合氮源對產(chǎn)GlcUA的影響圖9 補加氮源策略對魯氏接合酵母ZSR2生長及產(chǎn)GlcUA影響Fig.9 The effect of nitrogen source feeding strategies on growth of Z.rouxii ZSR2 and GlcUA synthesis

3 結(jié)論

本研究以1株具有合成葡萄糖醛酸潛力的魯氏接合酵母ZSR2為生產(chǎn)菌株，通過發(fā)酵條件的單因素優(yōu)化，使葡萄糖醛酸產(chǎn)量從3.85 g/L提高到14.68 g/L，是優(yōu)化前的3.8倍。然后通過在發(fā)酵中期補加氮源的方式，使魯氏接合酵母合成葡萄糖醛酸的產(chǎn)量進(jìn)一步提高到22.36 g/L，是目前報道的純菌發(fā)酵產(chǎn)葡萄糖醛酸的最高水平。研究結(jié)果可為微生物發(fā)酵法生產(chǎn)葡萄糖醛酸的工業(yè)化進(jìn)程奠定基礎(chǔ)。