黃楠，周波，葉童，陳桂光，梁智群，曾偉*

1(亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)與利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(廣西大學(xué))，廣西 南寧，530004) 2(廣西大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，廣西 南寧，530004)

低聚異麥芽糖(isomaltooligosaccharides，IMO)是一類由α-1,6糖苷鍵連接葡萄糖基形成的功能性低聚糖[1-2]。IMO可促進(jìn)短鏈脂肪酸產(chǎn)生，降低腸道內(nèi)pH值以減少致病菌，還能促進(jìn)結(jié)腸中雙歧桿菌和乳酸桿菌群的增殖，抑制腸道病原體的生長(zhǎng)[3-4]。在食品中添加IMO能防止淀粉老化，延長(zhǎng)食品的保質(zhì)期[5]。作為益生元和膳食纖維的IMO具有熱值低、促益菌、防齲齒、穩(wěn)定性高等優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)被廣泛用于食品行業(yè)。

IMO起初作為一種淀粉酶解的副產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)于葡萄糖生產(chǎn)過程中。生產(chǎn)IMO的傳統(tǒng)方法有2種：(1)由α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)、β-淀粉酶(EC 3.2.1.2)和α-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.20)協(xié)同轉(zhuǎn)化生成[6-7]；(2)由α-葡糖苷酶與新普魯蘭酶(EC 3.2.1.135)協(xié)同轉(zhuǎn)化生成[8]。使用游離酶生產(chǎn)低聚異麥芽糖成本高且生產(chǎn)過程繁瑣。目前國(guó)內(nèi)外相關(guān)領(lǐng)域的研究主要集中在高產(chǎn)α-葡萄糖苷酶新菌株的選育[9-10]、新型α-葡萄糖苷酶的分離純化及其酶學(xué)性質(zhì)研究[11-13]、固定化細(xì)胞和固定化酶[14-15]等方面。然而，IMO的工業(yè)化生產(chǎn)仍面臨成本高，轉(zhuǎn)化時(shí)間長(zhǎng)，轉(zhuǎn)化率低等問題[16]。因此，有必要尋找一種低耗、高效的方法生產(chǎn)IMO。

全細(xì)胞催化是一種利用完整生物體作為催化劑進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化的方法，其因制備簡(jiǎn)單、生產(chǎn)成本低和催化效率高等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于各類產(chǎn)物的合成，如蔗果低聚糖[17]、茶多酚[18]、阿糖腺苷[19]等。OJHA等[20]利用微桿菌(Microbacteriumsp.)全細(xì)胞轉(zhuǎn)化麥芽糖合成IMO，其IMO轉(zhuǎn)化率達(dá)到58%，取得較好成果，但其菌體無法回收利用；徐燕杉[21]以黑曲霉(Aspergillusniger)α- 葡萄糖苷酶在畢赤酵母(Pichiapastoris)的表面展示，催化合成IMO，其初始IMO轉(zhuǎn)化率為45%，但重復(fù)利用3次后轉(zhuǎn)化率降低至30%。黑曲霉作為一種絲狀真菌有產(chǎn)酶能力強(qiáng)，菌體便于回收等特點(diǎn)，是用于全細(xì)胞轉(zhuǎn)化生產(chǎn)IMO的理想菌種。開展這一方向的研究工作，有利于進(jìn)一步降低商品IMO的生產(chǎn)成本和增加IMO的工業(yè)生產(chǎn)效率。

實(shí)驗(yàn)室在前期工作中通過復(fù)合誘變選育得到1株產(chǎn)α-葡萄糖苷酶的黑曲霉菌株H9-30，其菌體轉(zhuǎn)苷活力達(dá)24 000 U/g。本文以黑曲霉H9-30全細(xì)胞作為生物催化劑，以麥芽糖作為反應(yīng)底物，探究轉(zhuǎn)化合成IMO的最優(yōu)條件，并重復(fù)利用黑曲霉細(xì)胞生產(chǎn)IMO，以期為其工業(yè)化應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

黑曲霉H9-30，釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae) GXJ-1：保藏于廣西大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院食品發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 試劑

葡萄糖、麥芽糖、異麥芽糖、麥芽三糖、潘糖、異麥芽三糖標(biāo)準(zhǔn)品：美國(guó)Sigma-Aldrich公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基(g/L)：麩皮汁30，麥芽糖 30，瓊脂20，pH 5.0。麩皮種子培養(yǎng)基：麩皮8 g，蒸餾水4 mL，自然pH。發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：玉米淀粉80，玉米漿干粉40，醋酸鈣0.8，甲基-葡糖胺0.1，pH 4.8。酵母培養(yǎng)基(g/L)：麥芽糖10，胰蛋白胨5，酵母粉5。培養(yǎng)基于115 ℃滅菌30 min。

1.2 儀器與設(shè)備

LC-10AT型高效液相色譜儀，日本島津公司；SW-CJ-1F超凈工作臺(tái)，蘇州安泰空氣技術(shù)公司；METTLER TOLEDO PL303精密電子天平，德國(guó)METTLER公司；SKY-211B振蕩培養(yǎng)箱、SKY-110WX恒溫水浴搖床、SKJH-1109超凈工作臺(tái)，上海蘇坤公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 黑曲霉細(xì)胞的培養(yǎng)與收集

取培養(yǎng)60 h長(zhǎng)滿成熟孢子的種子，用無菌的生理鹽水將孢子洗下，以6層紗布將其過濾至含有玻璃珠的250 mL三角瓶中，得到孢子懸液。懸液在34 ℃， 220 r/min下振蕩30 min將孢子打散。以血球計(jì)數(shù)板法計(jì)算孢子數(shù)量，并將孢子懸液濃度調(diào)至1×107個(gè)/mL。將濃度為1×107個(gè)/mL的孢子懸液以體積分?jǐn)?shù)1%接種至含50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，在34 ℃，220 r/min的振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)42 h。將發(fā)酵液抽濾，以10倍體積的去離子水沖洗3次后收集細(xì)胞。

1.3.2 黑曲霉細(xì)胞的預(yù)處理

黑曲霉細(xì)胞菌體在2 g/L麥芽糖的NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液(20 mmol/L，pH 6.0)中重懸，在52 ℃ 下保溫30 min致死細(xì)胞。以10倍體積的去離子水沖洗致死后的黑曲霉細(xì)胞，重復(fù)沖洗3次后于40 ℃恒溫干燥箱放至恒重。

1.3.3 IMO的轉(zhuǎn)化參數(shù)

1.3.3.1 溫度對(duì)全細(xì)胞轉(zhuǎn)化合成IMO的影響

將黑曲霉細(xì)胞α-葡萄糖苷酶與底物于37、42、45、48、50、52、55、60、70 ℃分別保溫30 min后混勻，整個(gè)體系于pH 6.0的Britton-Robison緩沖液(20 mmol/L) 中反應(yīng)。以300 g/L的麥芽糖為底物檢測(cè)不同溫度下α-葡萄糖苷酶的轉(zhuǎn)苷活力，考察黑曲霉細(xì)胞α-葡萄糖苷酶的最適轉(zhuǎn)苷溫度。將黑曲霉細(xì)胞于45、48、50、52 ℃保溫24 h，考察黑曲霉細(xì)胞α-葡萄糖苷酶的熱穩(wěn)定性。

1.3.3.2 反應(yīng)初始pH值對(duì)全細(xì)胞轉(zhuǎn)化合成IMO的影響

將黑曲霉細(xì)胞α-葡萄糖苷酶與底物溶于pH值為3.0、4.0、4.2、4.5、5.0、5.5、6.0、7.0、8.0、9.0的Britton-Robison緩沖液，測(cè)定在不同pH值下α-葡萄糖苷酶轉(zhuǎn)苷活力，考察最適初始轉(zhuǎn)苷pH值。將α-葡萄糖苷酶與底物溶于pH值為4.0、4.2、4.5的Britton-Robison緩沖液，在最適反應(yīng)溫度下保溫24 h，混合體系于37 ℃測(cè)定酶的保留活力。

1.3.3.3 底物濃度對(duì)全細(xì)胞轉(zhuǎn)化合成IMO的影響

將黑曲霉細(xì)胞添加至含麥芽糖100、200、300、400、500、600、800 g/L的Britton-Robison緩沖液中，在最適溫度和pH值下轉(zhuǎn)化生成IMO，考察底物濃度對(duì)全細(xì)胞轉(zhuǎn)化合成IMO的影響。

1.3.3.4 黑曲霉細(xì)胞添加量對(duì)IMO合成的影響

將黑曲霉細(xì)胞以5、10、15、20 g/L添加至含有100 mL最適轉(zhuǎn)化濃度麥芽糖漿的250 mL三角瓶中，以最適溫度和pH值下轉(zhuǎn)化底物。跟蹤轉(zhuǎn)苷反應(yīng)，考察黑曲霉細(xì)胞添加量對(duì)IMO合成的影響。

1.3.4 IMO的全細(xì)胞轉(zhuǎn)化及純化

將黑曲霉細(xì)胞添加至麥芽糖漿中，在最適轉(zhuǎn)苷溫度與pH值下反應(yīng)，得到IMO與可發(fā)酵性糖(葡萄糖、麥芽糖等)的混合液。以釀酒酵母消耗混合液中的可發(fā)酵性糖[22]，得到純化的IMO。

1.3.5 α-葡萄糖苷酶轉(zhuǎn)苷活力的測(cè)定

1.3.5.1 α-葡萄糖苷酶轉(zhuǎn)苷活力的定義

在37 ℃、pH 4.2，300 g/L麥芽糖條件下，每小時(shí)轉(zhuǎn)化麥芽糖生成1 μg有效三糖(eIMO，包括異麥芽糖、潘糖和異麥芽三糖)所對(duì)應(yīng)的酶量定義為1個(gè)酶活力單位(U)。

1.3.5.2 菌絲體α-葡萄糖苷酶轉(zhuǎn)苷活力的測(cè)定方法

取黑曲霉細(xì)胞0.03 g于10 mL EP管中，加入5 mL以pH 4.2，20 mmol/L的醋酸-醋酸鈉緩沖液配制的300 g/L麥芽糖溶液，混勻，37 ℃水浴1 h。沸水浴10 min 終止轉(zhuǎn)苷反應(yīng)。使用配有Ecosil NH2柱(5 μm，4.6 mm×250 mm)和Waters Sugar-Pak 1柱(10 μm，6.5 mm×300 mm)的色譜系統(tǒng)，以HPLC分析eIMO，以確定轉(zhuǎn)苷活力。色譜條件參照GB/T 20881—2007，《低聚異麥芽糖》強(qiáng)制性國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中的檢測(cè)方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度對(duì)黑曲霉細(xì)胞轉(zhuǎn)苷反應(yīng)的影響

反應(yīng)溫度影響細(xì)胞中α-葡萄糖苷酶的活力和穩(wěn)定性。由圖1-A可知，黑曲霉細(xì)胞中的α-葡萄糖苷酶在52 ℃轉(zhuǎn)苷活力達(dá)到最大，且在45～55 ℃的轉(zhuǎn)苷活力為最高活力的80%以上。由圖1-B可見，反應(yīng)體系的溫度對(duì)α-葡萄糖苷酶的穩(wěn)定性影響較大。在48 ℃的α-葡萄糖苷酶穩(wěn)定性明顯高于50 ℃。這是由于α-葡萄糖苷酶隨著溫度的升高，酶逐漸失活造成[16]。雖然細(xì)胞中α-葡萄糖苷酶在52 ℃表現(xiàn)出最大轉(zhuǎn)苷活力，但其穩(wěn)定性遠(yuǎn)低于48 ℃。反應(yīng)溫度越低，α-葡萄糖苷酶的穩(wěn)定性越高，但過低的轉(zhuǎn)化溫度會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)化時(shí)間延長(zhǎng)。在實(shí)際應(yīng)用中，若反應(yīng)溫度低于48 ℃，反應(yīng)過程中的雜菌污染情況嚴(yán)重，因此本研究選擇反應(yīng)溫度為48 ℃。

A-溫度對(duì)黑曲霉細(xì)胞α-葡萄糖苷酶轉(zhuǎn)苷活力的影響；B-溫度對(duì)黑曲霉細(xì)胞α-葡萄糖苷酶穩(wěn)定性的影響圖1 溫度對(duì)黑曲霉細(xì)胞α-葡萄糖苷酶轉(zhuǎn)苷反應(yīng)的影響Fig.1 Effect of temperature on α-glucosidase transglycosylation of A. niger cells

2.2 初始pH值對(duì)黑曲霉細(xì)胞轉(zhuǎn)苷反應(yīng)的影響

由圖2-A可知，在弱酸性環(huán)境中α-葡萄糖苷酶的轉(zhuǎn)苷活力較強(qiáng)，這與固定化后的轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶性質(zhì)相似[23]。黑曲霉細(xì)胞α-葡萄糖苷酶的最適轉(zhuǎn)苷初始pH值為4.2，細(xì)胞中α-葡萄糖苷酶的轉(zhuǎn)苷活力在pH值4.0～5.0保持較高值(大于80%)。然而，當(dāng)反應(yīng)體系pH值為4.0時(shí)，α-葡萄糖苷酶的相對(duì)轉(zhuǎn)苷活力隨著保溫時(shí)間的增加急劇下降(圖2-B)。這是由于酶在超過耐酸閾值后逐漸變性失活所致。為保證較高的轉(zhuǎn)化效率和反應(yīng)中酶的穩(wěn)定性，本研究選擇初始pH值為4.2。

A-初始pH值對(duì)黑曲霉細(xì)胞α-葡萄糖苷酶轉(zhuǎn)苷活力的影響；B-初始pH值對(duì)黑曲霉細(xì)胞α-葡萄糖苷酶穩(wěn)定性的影響圖2 初始pH值對(duì)黑曲霉細(xì)胞α-葡萄糖苷酶轉(zhuǎn)苷反應(yīng)的影響Fig.2 Effect of initial pH value on α-glucosidase transglycosylation of A. niger cells

2.3 麥芽糖濃度對(duì)黑曲霉細(xì)胞轉(zhuǎn)苷反應(yīng)的影響

底物濃度通過改變酶的區(qū)域選擇性影響轉(zhuǎn)苷反應(yīng)[24]。α-葡萄糖苷酶在底物濃度遠(yuǎn)高于酶濃度時(shí)，酶作用于底物非還原端的1,4-糖苷鍵，并將切下的活性糖基供體轉(zhuǎn)移至糖基受體形成新的1,6-糖苷鍵，從而表現(xiàn)出轉(zhuǎn)糖苷活性[25]。實(shí)驗(yàn)在48 ℃和pH值為4.2的條件下，探究了麥芽糖質(zhì)量濃度(200～1 000 g/L)對(duì)菌絲體轉(zhuǎn)苷反應(yīng)的影響。由圖3-A可知，反應(yīng)體系中麥芽糖質(zhì)量濃度對(duì)菌絲體中α-葡萄糖苷酶的轉(zhuǎn)苷活力影響顯著。在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，α-葡萄糖苷酶轉(zhuǎn)苷活力隨底物濃度增加呈指數(shù)增長(zhǎng)(y=4.221exp(x/25.981)+8.211,R2=0.996)，這意味著單位時(shí)間底物的轉(zhuǎn)化速率大大增加。OJHA等[20]曾報(bào)道α-葡萄糖苷酶在高底物濃度下表現(xiàn)出強(qiáng)烈的轉(zhuǎn)苷作用，VETERE等[24]曾通過調(diào)節(jié)底物濃度改變酶的區(qū)域選擇性影響轉(zhuǎn)苷反應(yīng)，但α-葡萄糖苷酶轉(zhuǎn)苷活力隨底物濃度上升呈指數(shù)型升高尚屬首次報(bào)道。

然而，較高的轉(zhuǎn)苷活力并未使底物轉(zhuǎn)化率顯著提升。向麥芽糖濃度為300、600、800 g/L的反應(yīng)體系中添加等量的黑曲霉細(xì)胞，反應(yīng)終點(diǎn)的eIMO含量分別為154.3 g/L(圖3-B)、312.2 g/L(圖3-C)、316.8 g/L(圖3-D)。反應(yīng)初期(0～10 h)，eIMO的產(chǎn)生速率隨麥芽糖質(zhì)量濃度升高而加快。但這種轉(zhuǎn)苷速率提升的現(xiàn)象隨反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸消失。麥芽糖質(zhì)量濃度為800 g/L 時(shí)，eIMO在84 h達(dá)到最大值，遠(yuǎn)高于300 g/L麥芽糖下達(dá)到最大eIMO所需時(shí)間(20 h)。

A-麥芽糖濃度對(duì)黑曲霉細(xì)胞α-葡萄糖苷酶轉(zhuǎn)苷活力的影響；B-麥芽糖濃度對(duì)eIMO合成的影響圖3 麥芽糖濃度對(duì)黑曲霉細(xì)胞α-葡萄糖苷酶轉(zhuǎn)苷反應(yīng)的影響Fig.3 Effect of the concentration of maltose on transglycosylation of A. niger α-glucosidase

這是由于在反應(yīng)過程中，反應(yīng)體系的組分改變引起pH值降低，α-葡萄糖苷酶逐漸失活所致。在麥芽糖質(zhì)量濃度大于600 g/L時(shí)形成的高滲透壓下，反應(yīng)體系的微生物污染率低，有利于工業(yè)化生產(chǎn)。而過高的麥芽糖質(zhì)量濃度使低濃度緩沖體系無法在反應(yīng)過程中維持酸堿平衡，較高的緩沖液質(zhì)量濃度對(duì)產(chǎn)品品質(zhì)不利。由此，本研究選擇麥芽糖質(zhì)量濃度為600 g/L進(jìn)行反應(yīng)。

2.4 黑曲霉細(xì)胞添加量對(duì)轉(zhuǎn)苷反應(yīng)的影響

由圖4可知，eIMO合成速率隨黑曲霉細(xì)胞添加量的增加而上升。

圖4 黑曲霉細(xì)胞添加量對(duì)轉(zhuǎn)苷反應(yīng)的影響Fig.4 Effect of A. niger cell content on transglycosylation in the reaction system

eIMO產(chǎn)率在細(xì)胞添加量為5～15 g/L時(shí)保持穩(wěn)定，占總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的(50.5±0.8)%。在細(xì)胞添加量為20 g/L時(shí)，eIMO的合成峰值質(zhì)量濃度為268.9 g/L，低于低質(zhì)量濃度黑曲霉細(xì)胞添加量的合成水平。反應(yīng)在8 h后，eIMO質(zhì)量濃度明顯下降。這可能是由于體系中α-葡萄糖苷酶含量過多導(dǎo)致反應(yīng)向水解方向傾斜[25]。為了保證IMO的合成速率與轉(zhuǎn)化率，維持反應(yīng)體系中IMO穩(wěn)定，本研究選擇黑曲霉細(xì)胞添加量15 g/L進(jìn)行反應(yīng)。

2.5 利用黑曲霉全細(xì)胞轉(zhuǎn)化麥芽糖生產(chǎn)IMO

當(dāng)α-葡萄糖苷酶表現(xiàn)出轉(zhuǎn)糖苷活性且反應(yīng)體系中存在短鏈寡糖(葡萄糖聚合度為2～6)時(shí)，活化的糖基供體有幾率與寡糖連接形成異麥芽糖結(jié)構(gòu)，由此產(chǎn)生IMO[1, 26]。實(shí)驗(yàn)在48 ℃下，pH值為4.2的含600 g/L麥芽糖的醋酸-醋酸鈉緩沖液(20 mmol/L)中,每批次12 h轉(zhuǎn)化麥芽糖生產(chǎn)IMO。由圖5可知，eIMO含量隨反應(yīng)批次的增加而下降，這可能是由于α-葡萄糖苷酶在反應(yīng)體系中逐漸變性失活所致[26]。

圖5 黑曲霉全細(xì)胞轉(zhuǎn)化麥芽糖生產(chǎn)IMOFig.5 Synthesis of IMO by whole-cell catalysis of A. niger

轉(zhuǎn)化反應(yīng)在21批時(shí)，將所添加糖漿減少為初始的一半，eIMO質(zhì)量分?jǐn)?shù)仍無法大于35%(以IMO-50標(biāo)準(zhǔn))，由此確定此條件下，黑曲霉菌絲體生產(chǎn)IMO-50的半衰期為20批次(10 d)。菌絲體生產(chǎn)IMO的操作穩(wěn)定性強(qiáng)，實(shí)驗(yàn)中IMO的組分穩(wěn)定，第1批與第20批相比，總IMO含量?jī)H下降1.3%，葡萄糖含量低于38%，符合IMO-50的工業(yè)生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)。從表1可見，以黑曲霉H9-30細(xì)胞α-葡萄糖苷酶轉(zhuǎn)化麥芽糖產(chǎn)物主要為潘糖和異麥芽糖。第20批的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的酵母耗糖結(jié)果顯示，純化后的IMO達(dá)到總糖含量的93.8%，eIMO的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為總糖的67.8%，高于IMO-90生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn),為全細(xì)胞催化合成IMO提供了新的參考。

表1 第20批黑曲霉細(xì)胞轉(zhuǎn)化及酵母純化的IMO組成成分Table 1 Composition of IMO from the 20th batch of whole-cell transformation and yeast purification

3 結(jié)論

本文對(duì)黑曲霉H9-30細(xì)胞α-葡萄糖苷酶轉(zhuǎn)化麥芽糖生產(chǎn)IMO進(jìn)行研究。通過對(duì)反應(yīng)溫度、初始pH值、底物質(zhì)量濃度、細(xì)胞添加量對(duì)α-葡萄糖苷酶轉(zhuǎn)苷反應(yīng)影響的探究，確定了反應(yīng)最佳條件為：反應(yīng)溫度48 ℃，初始pH值4.2，麥芽糖質(zhì)量濃度為600 g/L，黑曲霉細(xì)胞添加量為15 g/L。此條件下，eIMO占總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的50.5%，總IMO含量達(dá)到63.3%，葡萄糖含量小于38%，符合工業(yè)生產(chǎn)IMO標(biāo)準(zhǔn)。黑曲霉細(xì)胞α-葡萄糖苷酶轉(zhuǎn)化IMO具有較好的操作穩(wěn)定性，生產(chǎn)IMO-50的半衰期為20批次(10 d)，第20批所產(chǎn)IMO經(jīng)酵母耗糖純化后仍高于IMO-90生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)，有望應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)IMO。