徐建妙，陳策，張博，柳志強

(浙江工業(yè)大學 生物工程學院，浙江 杭州，310014)

L-2-氨基丁酸(L-2-aminobutyric acid,L-ABA)在化工、醫(yī)藥等領(lǐng)域具有廣泛的用途，作為手性醫(yī)藥中間體可用于合成抗癲癇藥物左乙拉西坦和抗結(jié)核藥物鹽酸乙胺丁醇[1-2]。目前，L-2-氨基丁酸的生產(chǎn)主要有化學法和生物法兩大類?；瘜W法主要有化學拆分法[3-4]和化學合成法[5-6]。但是該種方法所需試劑價格昂貴，成本較高，不宜應用于工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)，同時使用到的大量有機溶劑，會增加環(huán)境壓力。生物法又包括酶催化法和微生物發(fā)酵法，酶催化制備方法專一性強，效率高，反應條件溫和，是一種較為理想的藥物中間體制備方法。目前主要有兩種酶催化法制備L-2-氨基丁酸，一種是通過轉(zhuǎn)氨酶[7-13]或者脫氫酶[14-16]催化2-酮丁酸(2-oxobutyric acid, 2-OBA)來制備，但是由于2-酮丁酸價格昂貴，不適合以其作為原料制備L-2-氨基丁酸；另一種是對消旋2-氨基丁酸進行酶法拆分制備[17]。目前常用的方法是先用蘇氨酸脫氨酶(threonine deaminase, TD)催化價格相對低廉的底物L-蘇氨酸(L-Threonine,L-Thr)轉(zhuǎn)化為中間產(chǎn)物2-酮丁酸，然后在輔酶NADH的參與下利用亮氨酸脫氫酶將其轉(zhuǎn)化為最終產(chǎn)物L-2-氨基丁酸(圖1)[18]。

圖1 蘇氨酸脫氨酶、亮氨酸脫氫酶和甲酸脫氫酶偶聯(lián)催化合成L-2-氨基丁酸工藝路線Fig.1 Synthesis of L-2-ABA by coupling TD, LeuDH and FDH

然而NADH價格昂貴，因此需要提供一套低成本、高效率的輔酶再生系統(tǒng)。輔酶的再生方法包括酶法、光化學法、電化學法[19]，其中酶法再生系統(tǒng)具有選擇性高、反應速度快、過程易于監(jiān)控、再生體系與合成體系兼容性好等優(yōu)點，因此應用比較廣泛[20]。甲酸銨/甲酸脫氫酶NADH再生系統(tǒng)具有諸多優(yōu)勢，如輔底物甲酸銨價格低廉且對酶無抑制作用，反應不可逆，副產(chǎn)物CO2易從體系中擴散出來，不會增加產(chǎn)物提取壓力[21]。

本實驗室已成功構(gòu)建了能夠共表達亮氨酸脫氫酶和甲酸脫氫酶的基因工程菌E.coli-BL21(DE3) (LeuDH/FDH)，構(gòu)成了基于細胞自身代謝的胞內(nèi)輔酶NADH循環(huán)再生體系，以該工程菌全細胞作為催化劑應用于L-2-氨基丁酸的制備，實現(xiàn)了反應過程中輔酶的零添加。雙酶偶聯(lián)體系催化效率的高低除了取決于兩個酶的酶活，更重要的是兩個酶的匹配程度。本文主要是通過對共表達菌株發(fā)酵產(chǎn)酶條件進行優(yōu)化，以期共表達的兩個酶的活力達到最優(yōu)的匹配程度，以降低工業(yè)化生產(chǎn)L-2-氨基丁酸的成本，并提高生產(chǎn)效率。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

重組大腸桿菌E.coli-BL21(DE3) (LeuDH/FDH) (LeuDH的基因片段來自Thermoactinomycesintermedius，F(xiàn)DH的基因片段來自Fusariumgraminearum)：由實驗室構(gòu)建并保藏；甲酸銨、L-蘇氨酸：阿拉丁公司；L-2-氨基丁酸標準品：東京化成工業(yè)株式會社。其他試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 儀器與設(shè)備

E2695高效液相色譜儀，美國Waters公司；LYNX-4000冷凍高速離心機，美國Thermo公司；DK-S32電熱恒溫水浴鍋，上海森信實驗儀器有限公司；HZQ-X300C恒溫振蕩器，上海一恒科學儀器有限公司；MS-15SU磁力攪拌器，美國Silentshake公司；BIOTECH-5JG 5 L發(fā)酵罐，上海保興生物設(shè)備工程有限公司；MLS-3780高壓蒸汽滅菌鍋，上海馳通儀器有限公司；AUTOPOL IV全自動旋光儀，美國Rudolph公司；Spectra Max MS多功能酶標儀，美國Molecular Devices公司；907恒態(tài)pH電位滴定儀，瑞士Metrohm公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 培養(yǎng)基與發(fā)酵條件

LB培養(yǎng)基(g/L)：NaCl 10，酵母粉5，蛋白胨10，蒸餾水溶解；發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：NaCl 10，酵母粉12，蛋白胨15，MgSO4·7H2O 0.375，甘油12，K2HPO4·3H2O 2.28，KH2PO41.36，(NH4)2SO45，蒸餾水溶解。以上培養(yǎng)基均在121 ℃滅菌20 min。

種子液培養(yǎng)：將甘油管中保存的菌種按0.1%接種量接入裝有50 mL LB液體培養(yǎng)基的搖瓶，在恒溫振蕩器中以150 r/min，37 ℃培養(yǎng)12 h。

搖瓶培養(yǎng)及誘導：在500 mL規(guī)格的搖瓶中裝入100 mL LB培養(yǎng)基，按1%的接種量將種子液轉(zhuǎn)接至LB培養(yǎng)基中，在恒溫振蕩器中以180 r/min，37 ℃培養(yǎng)至OD600達到0.6～0.8，降低溫度，并加入誘導劑IPTG，繼續(xù)培養(yǎng)。發(fā)酵結(jié)束后8 000 r/min， 4 ℃，10 min 離心收集菌體，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

發(fā)酵罐培養(yǎng)及誘導：在5 L發(fā)酵罐中裝入3 L發(fā)酵培養(yǎng)基，并添加3 mL消泡劑，按5%的接種量將種子液轉(zhuǎn)接至發(fā)酵培養(yǎng)基中，將pH控制在7.0(用體積分數(shù)為50%的磷酸水溶液和氨水水溶液調(diào)節(jié))，通氣量4.8 L/min，37 ℃，450 r/min培養(yǎng)至OD600達到8～10，降低溫度，并加入誘導劑乳糖，繼續(xù)培養(yǎng)。發(fā)酵結(jié)束后8 000 r/min，4 ℃，10 min離心收集菌體，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 反應條件

反應體系為180 g/L底物L-蘇氨酸，95.3 g/L輔底物甲酸銨，10 g/L含有蘇氨酸脫氨酶的濕菌體，40 g/L 共表達濕菌體，于去離子水中構(gòu)成100 mL反應體系，在35 ℃、600 r/min條件下進行酶催化反應，反應過程中定時取樣，用濃鹽酸終止反應，樣品用于液相色譜分析。

1.3.3 分析方法

HPLC檢測條件：色譜柱Eclipse XD8-C18(5 μm×4.6 mm×250 mm)，流動相:V(乙腈)∶V(0.02 mol/L Na2HPO4緩沖液(pH 7.2))=30∶70，紫外檢測波長：360 nm，柱溫：30 ℃，流速：1.0 mL/min。樣品衍生化條件：取稀釋一定倍數(shù)后的待測樣品100 μL，與100 μL 0.5 mol/L的NaHCO3溶液和50 μL體積分數(shù)1%的2,4-二硝基氟苯乙腈溶液混合，60 ℃避光保溫1 h，反應結(jié)束后冷卻至室溫，再加入750 μL NaH2PO4/ Na2HPO4緩沖液(0.2 mol/L，pH 7.0)。

菌體密度測定：以O(shè)D600表示菌體密度，用紫外分光光度計測定稀釋一定倍數(shù)后的發(fā)酵液在600 nm處的吸光值。

LeuDH酶活測定：NADH在340 nm處有最大吸光值，可通過檢測反應過程中NADH在340 nm處吸光值的變化測定LeuDH活力。反應體系包括：50 mmol/L 2-酮丁酸，200 mmol/L磷酸鈉緩沖液(pH 8.0)，200 mmol/L NH3/ NH4Cl緩沖液(pH 7.5)，0.25 mmol/L NADH，10 μL經(jīng)冰浴超聲破碎的酶液，總體積為200 μL，35 ℃下每隔30 s記錄NADH吸光值的變化。在測定條件下，每分鐘消耗1 μmol NADH所需的酶量定義為1個酶活單位(U)。

FDH酶活測定：原理與LeuDH酶活測定相同。反應體系包括：167 mmol/L甲酸銨，200 mmol/L磷酸鈉緩沖液(pH 8.0)，1.67 mmol/L NAD+，10 μL經(jīng)冰浴超聲破碎的酶液，總體積為200 μL，35 ℃下每隔30 s記錄NADH吸光值的變化。在測定條件下，每分鐘生成1 μmol NADH所需的酶量定義為1個酶活單位(U)。

對映體過量值(e.e.)的計算方法，如公式(1)：

(1)

式中,R、S分別表示樣品中(R)-和(S)-2種構(gòu)型產(chǎn)物的濃度，mol/L。

時空產(chǎn)率(space time yield，STY)的計算方法,如公式(2)：

(2)

式中，c為反應液中產(chǎn)物的摩爾濃度，mol/L；M為L-2-氨 基丁酸的摩爾質(zhì)量，g/mol；t為反應所用時間，h。

2 結(jié)果與分析

2.1 搖瓶水平對亮氨酸脫氫酶和甲酸脫氫酶共表達菌株發(fā)酵條件的優(yōu)化

2.1.1 誘導溫度的選擇

誘導溫度對酶蛋白合成和質(zhì)粒穩(wěn)定性有重要影響，過低的誘導溫度會導致酶蛋白合成緩慢，從而影響酶活，但過高的誘導溫度可能會導致酶蛋白積累過快，使酶蛋白因錯誤折疊形成大量沒有活性的包涵體[22]。誘導時加入0.10 mmol/L的IPTG，分別在18、20、22、24、26、28 ℃條件下誘導16 h，結(jié)果見圖2。

A-F分別是在誘導溫度18、20、22、24、26和28 ℃下誘導培養(yǎng)的菌體破碎上清物；a-f是相對應的沉淀物圖2 不同誘導溫度下LeuDH和FDH的SDS-PAGE分析Fig.2 SDS-PAGE analysis of LeuDH and FDH at different induced temperature

由圖2可知，甲酸脫氫酶蛋白的表達量多于亮氨酸脫氫酶蛋白表達量，且甲酸脫氫酶蛋白條帶的變化程度大于亮氨酸脫氫酶蛋白條帶，當誘導溫度從18 ℃逐漸升高到26 ℃時，菌體破碎后的上清物中的可溶性蛋白和沉淀物中的包涵體都隨之增加，當誘導溫度達到28 ℃時，可溶性蛋白減少，包涵體繼續(xù)增加，說明過低或過高的誘導溫度都不利于可溶性蛋白的合成。

取等量的6組菌體的全細胞與含有蘇氨酸脫氨酶的菌體進行配比，加入底物L-蘇氨酸和輔底物甲酸銨，催化合成L-2-氨基丁酸，圖3顯示，當誘導溫度為22 ℃時，轉(zhuǎn)化率達到最高，雖然亮氨酸脫氫酶和甲酸脫氫酶蛋白的表達量都沒有達到最大，但共表達菌株達到最佳催化效果，誘導溫度低于或高于22 ℃，都不利于催化反應的進行。綜合實驗結(jié)果，確定22 ℃為最佳的誘導溫度。

圖3 不同誘導溫度對共表達菌株催化活力的影響Fig.3 Effect of temperature on coexpression strains catalysis activity

2.1.2 誘導劑濃度的選擇

誘導時分別添加0.06、0.08、0.10、0.12、0.14、0.16 mmol/L誘導劑IPTG，22 ℃條件下誘導16 h，考察IPTG濃度對產(chǎn)酶的影響，結(jié)果見圖4。由圖4可知，添加0.06 mmol/L的IPTG后目的蛋白的表達量比其他幾組的蛋白表達量少。隨著誘導劑濃度的提高，可溶性蛋白表達量沒有明顯變化，包涵體略有增加。由圖5可知，當誘導劑濃度為0.06和0.08 mmol/L時，底物沒有達到完全轉(zhuǎn)化，當IPTG濃度由0.10 mmol/L升高到0.16 mmol/L時，最終都達到了完全轉(zhuǎn)化，但2 h的轉(zhuǎn)化率逐漸降低，可能因為過高濃度的IPTG對酶活有影響，降低了反應速度。綜合實驗結(jié)果，確定最適的IPTG濃度為0.10 mmol/L。

A-F分別是在誘導劑濃度0.06、0.08、0.10、0.12、0.14和0.16 mmol/L下誘導培養(yǎng)的菌體破碎上清物；a-f是相對應的沉淀物圖4 不同誘導劑濃度下LeuDH和FDH的SDS-PAGE分析Fig.4 SDS-PAGE analysis of LeuDH and FDH at different inducer concentration

圖5 不同誘導劑濃度對共表達菌株催化活力的影響Fig.5 Effect of inducer concentration on coexpression strains catalysis activity

2.1.3 誘導時間的選擇

誘導時加入0.10 mmol/L的IPTG，22 ℃條件下分別誘導8、10、12、14、16、18、20 h，考察誘導時間對產(chǎn)酶的影響。由圖6可知，延長誘導時間有利于可溶性蛋白的積累，但包涵體也隨之增加。圖7表明，隨著誘導時間的增加，一定程度上有利于催化反應的進行，誘導14 h后，共表達菌株的催化反應能力基本達到穩(wěn)定，之后不會隨著誘導時間的增加而發(fā)生明顯變化。最終確定最佳誘導時間為14 h。

A-G分別是在誘導時間8、10、12、14、16、18和20 h下誘導培養(yǎng)的菌體破碎上清物；a-g是相對應的沉淀物圖6 不同誘導時間下LeuDH和FDH的SDS-PAGE分析Fig.6 SDS-PAGE analysis of LeuDH and FDH at different induction time

圖7 不同誘導時間對共表達菌株催化活力的影響Fig.7 Effect of induction time on coexpression strains catalysis activity

由實驗結(jié)果可以看出，溫度對酶蛋白的可溶性表達和催化活力影響最大，誘導時間次之，誘導劑濃度的影響最小。當誘導溫度22 ℃，誘導劑IPTG濃度0.10 mmol/L，誘導時間14 h，共表達菌株達到最佳催化效果，亮氨酸脫氫酶和甲酸脫氫酶的酶活分別達到83.4 U/g(以濕重計)和267.6 U/g(以濕重計)。甲酸脫氫酶蛋白的表達量和酶活都遠大于亮氨酸脫氫酶，說明酶催化反應對NADH的需求量較大，需要大量的甲酸脫氫酶快速將NAD+轉(zhuǎn)化為NADH，使細胞中的NADH保持較高水平。

2.2 5 L發(fā)酵罐水平對亮氨酸脫氫酶和甲酸脫氫酶共表達菌株發(fā)酵條件的優(yōu)化

2.2.1 誘導劑乳糖濃度對催化反應進程的影響

在搖瓶實驗的基礎(chǔ)上，擴大發(fā)酵培養(yǎng)規(guī)模，在5 L發(fā)酵罐水平對重組菌進行發(fā)酵條件的優(yōu)化。由于IPTG的成本較高，工業(yè)生產(chǎn)中常使用乳糖作為代替品，且經(jīng)過實驗驗證，在5 L發(fā)酵罐水平誘導時分別加入0.10 mmol/L的IPTG和8.0 g/L的乳糖，菌體的催化效果相當，但是用IPTG誘導的菌體產(chǎn)量為26 g/L，用乳糖誘導的菌體產(chǎn)量為35 g/L，故本實驗中選擇乳糖為誘導劑。誘導時分別添加質(zhì)量濃度為4.0、6.0、8.0、10.0、12.5 g/L的乳糖，22 ℃條件下誘導17 h。由圖8可知，過低的乳糖添加量不利于反應的進行，使底物完全轉(zhuǎn)化的最低乳糖質(zhì)量濃度為8.0 g/L，繼續(xù)提高乳糖濃度對反應的進程沒有明顯影響，確定最適的乳糖質(zhì)量濃度為8.0 g/L。

圖8 不同誘導劑乳糖濃度對催化反應進程的影響Fig.8 Time course of production of L-ABA used different inducer lactose concentration

2.2.2 誘導時間對催化反應進程的影響

隨著誘導時間的延長，酶蛋白的表達量會有一定程度的增加，為了確定最適誘導時間，分別在降溫誘導11、13、15、17、19 h后取樣檢測。由圖9可知，隨著誘導時間的延長，目的蛋白酶的催化能力逐漸升高，誘導17 h后，催化能力基本達到穩(wěn)定，其后增長不明顯。最終確定誘導時間為17 h。

圖9 不同誘導時間對催化反應進程的影響Fig.9 Time course of production of L-ABA used different induction time

在5 L發(fā)酵罐水平上對共表達菌株發(fā)酵條件進行優(yōu)化，實驗結(jié)果表明，當誘導溫度22 ℃，誘導劑乳糖質(zhì)量濃度8.0 g/L，誘導時間17 h，共表達菌株達到最佳催化效果，亮氨酸脫氫酶和甲酸脫氫酶的酶活分別達到79.2 U/g(以濕重計)和216.1 U/g(以濕重計)。

2.3 催化制備L-2-氨基丁酸反應條件的優(yōu)化

2.3.1 底物L-蘇氨酸濃度的選擇

在生物催化的過程中，過低濃度的底物添加量會浪費資源，增加生產(chǎn)成本，而過高濃度的底物添加量會造成底物抑制現(xiàn)象，都不利于工業(yè)化生產(chǎn)，故尋求最適濃度的底物添加量是十分必要的。反應體系中L-蘇氨酸的初始質(zhì)量濃度分別為120、150、180、210、240 g/L，甲酸銨的摩爾量與L-蘇氨酸的摩爾量相同，在上述優(yōu)化的反應條件下進行酶催化反應，結(jié)果見圖10。低濃度的底物添加量，催化反應進行的較快，當L-蘇氨酸的質(zhì)量濃度為120、150、180 g/L時，可實現(xiàn)底物的完全轉(zhuǎn)化，當?shù)孜餄舛壤^續(xù)提高，會出現(xiàn)底物抑制現(xiàn)象。因此，選定L-蘇氨酸的質(zhì)量濃度180 g/L。

圖10 不同L-蘇氨酸質(zhì)量濃度對催化反應進程的影響Fig.10 Time course of production of L-ABA used different L-Thr concentration

2.3.2 輔底物甲酸銨濃度的選擇

輔底物甲酸銨可用于輔酶NADH的再生，甲酸銨的添加量決定了NADH循環(huán)再生的效率，進而影響催化反應的進行。一般在NADH再生體系中，添加的輔底物的摩爾當量要大于底物的摩爾當量，以實現(xiàn)底物的完全轉(zhuǎn)化。由圖1的反應式可知，甲酸銨與L-蘇氨酸的理論摩爾比為1∶1，故當反應體系中L-蘇氨酸的質(zhì)量濃度為180 g/L時，分別添加與L-蘇氨酸的摩爾比1.00∶1、1.05∶1、1.10∶1、1.15∶1、1.20∶1、1.25∶1 的甲酸銨，在上述優(yōu)化的反應條件下，實驗結(jié)果見圖11。所有反應中底物都實現(xiàn)了完全轉(zhuǎn)化，且甲酸銨濃度較高時，反應進程并沒有明顯加快，為了方便提純和節(jié)約成本，選擇添加與L-蘇氨酸的摩爾量相同的甲酸銨，即為95.3 g/L甲酸銨。

圖11 不同甲酸銨濃度對催化反應進程的影響Fig.11 Time course of production of L-ABA used different ammonium formate concentration

2.3.3 反應溫度和反應體系pH的選擇

繼而考察反應溫度對制備L-2-氨基丁酸的影響，反應體系為180 g/L底物L-蘇氨酸，95.3 g/L輔底物甲酸銨，10 g/L含有蘇氨酸脫氨酶的濕菌體，40 g/L共表達濕菌體，于去離子水中構(gòu)成100 mL反應體系，不控制反應液pH，分別在25、30、35、40、45、50 ℃，600 r/min條件下進行酶催化反應8 h，結(jié)果見圖12-A。

A-反應溫度；B-pH圖12 不同反應溫度和反應體系的pH對共表達菌株催化活力的影響Fig.12 Effect of reaction temperature and reaction pH on co-expression strains catalysis activity

在35 ℃之前，隨著反應溫度的提高，轉(zhuǎn)化率也提高，當反應溫度為35 ℃時，轉(zhuǎn)化率達到最高，繼續(xù)升高反應溫度，轉(zhuǎn)化率急劇下降，可能是因為過高的反應溫度使酶失活，溫度對于酶活的影響符合一般的酶活規(guī)律，綜合實驗結(jié)果，確定35 ℃為最佳反應溫度。

進一步考察反應體系pH對制備L-2-氨基丁酸的影響，實驗組于0.2 mmol/L磷酸鈉緩沖液中構(gòu)成100 mL反應體系，使用恒態(tài)pH電位滴定儀通過添加體積分數(shù)為50%的磷酸水溶液和氨水水溶液分別控制反應液的pH為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0，結(jié)果見圖12-B。過高或過低的pH都會影響酶活，當pH為6.5～8.0時，轉(zhuǎn)化率達99%以上，當pH為8.5時，轉(zhuǎn)化率達98.0%，且控制反應體系pH時，反應進程并沒有明顯提高，故為了節(jié)約成本和方便提純，以去離子水為反應介質(zhì)構(gòu)成反應體系，不控制反應體系的pH。

2.4 催化反應進程

為了探究共表達菌株工業(yè)化生產(chǎn)L-ABA的潛力，利用在5 L發(fā)酵罐水平優(yōu)化后獲得的菌體全細胞作為催化劑，耦合蘇氨酸脫氨酶，在上述優(yōu)化的反應條件下，反應體系擴大到1L，反應結(jié)果見圖13。L-ABA在反應2 h內(nèi)生成的速度較快，之后反應速度放緩，可能是因為隨著反應的進行酶活性不斷降低，并且產(chǎn)物的積累對酶活性也有一定的抑制作用。反應至8 h基本結(jié)束，此時底物轉(zhuǎn)化率99%以上，e.e.值99.5%以上，時空產(chǎn)率19.3 g/(L·h)。

圖13 蘇氨酸脫氨酶偶聯(lián)共表達細胞催化合成L-2-氨基丁酸進程Fig.13 Time course of production of L-ABA by TD coupling with LeuDH and FDH co-expression cells

3 結(jié)論

本實驗室構(gòu)建的亮氨酸脫氫酶和甲酸脫氫酶雙酶共表達基因工程菌E.coli-BL21(DE3) (LeuDH/FDH)，其全細胞可作為催化劑應用于L-2-氨基丁酸的制備，在反應過程中實現(xiàn)了胞內(nèi)輔酶NADH的循環(huán)再生，無需額外添加輔酶。在搖瓶水平優(yōu)化了產(chǎn)酶條件，實驗結(jié)果表明，當誘導溫度22 ℃，IPTG濃度為0.10 mmol/L，誘導時間14 h時，共表達菌株達到最佳催化效果，亮氨酸脫氫酶和甲酸脫氫酶的酶活分別達到83.4 U/g(以濕重計)和267.6 U/g(以濕重計)。在此基礎(chǔ)上，培養(yǎng)規(guī)模擴大到5 L發(fā)酵罐，實驗結(jié)果表明，當誘導溫度22 ℃，誘導劑乳糖質(zhì)量濃度8.0 g/L，誘導時間17 h，共表達菌株達到最佳催化效果，亮氨酸脫氫酶和甲酸脫氫酶的酶活分別達到79.2 U/g (以濕重計)和216.1 U/g(以濕重計)。目前以L-蘇氨酸為底物，利用蘇氨酸脫氨酶和亮氨酸脫氫酶，并偶聯(lián)NADH再生系統(tǒng)催化制備L-2-氨基丁酸的相關(guān)報道中，蘇金環(huán)等[14]的實驗中L-蘇氨酸質(zhì)量濃度為100 g/L，反應至16.5 h基本結(jié)束，可以達到99%以上的轉(zhuǎn)化率，e.e.值99.9%以上；劉珊等[28]的實驗中L-蘇氨酸質(zhì)量濃度50 g/L，反應20 h，可實現(xiàn)L-2-氨基丁酸的摩爾產(chǎn)率為99%，產(chǎn)量為43 g/L；郭紅顏等[29]的實驗中L-蘇氨酸質(zhì)量濃度為7 g/100 mL 時，反應20 h，產(chǎn)率達95%；徐建妙等[18]的實驗中L-蘇氨酸質(zhì)量濃度為180 g/L，反應9 h后，底物轉(zhuǎn)化率達99%以上，時空產(chǎn)率17.2 g/(L·h)，e.e.值99.5%以上；TAO等[15]的實驗中，L-蘇氨酸質(zhì)量濃度為119 g/L，轉(zhuǎn)化率可達97.3%，時空產(chǎn)率6.37 g/(L·h)。并且以上報道的實驗中都需要額外投加輔酶，這大大增加了生產(chǎn)成本。利用共表達菌體耦合蘇氨酸脫氨酶制備L-2-氨基丁酸，在1L反應體系中當?shù)孜風-蘇氨酸達到180 g時，無需額外添加輔酶，8 h后底物轉(zhuǎn)化率達99%以上，e.e.值99.5%以上，時空產(chǎn)率達19.3 g/(L·h)，顯著高于目前報道水平。本論文所采用的雙酶偶聯(lián)體系為建立高效、低成本的L-2-氨基丁酸工業(yè)化生產(chǎn)方法提供了一定的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。