趙菲佚，馬家琦，安建平，焦成瑾，馬偉超

（天水師范學(xué)院 生物工程與技術(shù)學(xué)院，甘肅 天水 741001）

紫花苜蓿（Medicago savita）屬豆科苜蓿多年生草本植物，素有“牧草之王”和“飼料皇后”的美稱。[1]苜蓿有極高的營養(yǎng)價值，[2]是世界上最重要的牧草之一，廣泛分布于全世界，對牛、羊等牲畜的生長具有重要的作用。[3]

硫在動物所需的營養(yǎng)中占有重要地位，對促進(jìn)家畜的生長和發(fā)育以及家畜產(chǎn)品的質(zhì)量和生產(chǎn)具有極其重要的意義。在苜蓿品質(zhì)指標(biāo)中，含硫氨基酸含量為重要的指標(biāo)之一。[4]苜蓿雖富含高量蛋白，但氨基酸組成不平衡，含硫氨基酸[半胱氨酸（Cys）和甲硫氨酸（Met）]含量很低，而Cys和Met是人畜的必需氨基酸，長期食用低硫含量的飼料會引起牛羊的脫毛，降低皮毛質(zhì)量，蛋奶質(zhì)量以及影響對其他氨基酸的吸收。因此提高苜蓿含量中含硫氨基酸的含量在牧草生產(chǎn)中具有重要的意義。

半胱氨酸是植物合成的第一個有機(jī)硫化物，其合成調(diào)控很可能是提高植物含硫氨基酸的關(guān)鍵點(diǎn)，因而，半胱氨酸合成酶(CSase)在植物含硫氨基酸代謝中起著關(guān)鍵的作用。CSase是由多成員組成的小家族。目前，已經(jīng)從擬南芥、水稻、大豆、截形苜蓿、鷹嘴豆等植物中克隆得到OAS-TL基因，部分基因已成功轉(zhuǎn)入擬南芥等模式植物[5]，通過基因工程的手段從紫花苜蓿本身克隆到OAS-TL的基因，然后再將其轉(zhuǎn)入紫花苜蓿，提高OAS-TL的表達(dá)量，從而提高體外無機(jī)硫轉(zhuǎn)化為體內(nèi)有機(jī)硫的效率，進(jìn)而增加紫花苜蓿的硫含量。

本研究將紫花苜蓿三得利（Sanditi）半胱氨酸合成酶基因成員MsSDCS-0序列從克隆載體pBSC亞克隆至pCAMBIA1205植物表達(dá)載體上，成功構(gòu)建植物熒光表達(dá)載體pCAMBIA1205-GFPn-MsS?DCS-0，轉(zhuǎn)入野生型（Col-0）擬南芥原生質(zhì)體考察半胱氨酸合成酶MsSDCS-0成員亞細(xì)胞定位，并同時轉(zhuǎn)化擬南芥整體植物以考察其表達(dá)模式。為該基因成員在植物含硫氨基酸代謝中功能與應(yīng)用后續(xù)研究提供基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1植物材料

擬南芥野生型(Col-0)為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2實(shí)驗(yàn)菌株與載體

大腸桿菌E.coliDH5α與含pBSC-MsSDCS-0克隆載體DH5α菌株、農(nóng)桿菌GV3101、熒光表達(dá)載體pCAMBIA1205-GFPn均為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.3菌落PCR引物

含陽性植物熒光GFP表達(dá)載體的GV3101農(nóng)桿菌菌落PCR鑒定引物序列如表1，由上海生物工程公司合成。

表1 菌落PCR鑒定用引物序列

1.1 試劑與儀器

1.2.1主要試劑

SanPrep柱式質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒、San?Prep柱式DNA膠回收試劑盒、T4 DNA連接酶試劑盒、Taq DNA聚合酶等購自上海生物工程股份有限責(zé)任公司。限制性內(nèi)切酶Bam HⅠ和SalⅠ等均購自Takara公司。

1.2.2主要儀器

梯度PCR儀（Eppendorf，6321A），凝膠成像系統(tǒng)（UVP，GelDoc-it2），激光共聚焦顯微鏡（Con?focal）(Zeiss，META-510)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1MsSDCS-0基因植物表達(dá)載體的構(gòu)建

克隆載體pBSC-MsSDCS-0及植物熒光表達(dá)載體pCAMBIA1205-GFPn的工程菌培養(yǎng)與質(zhì)粒提取按試劑盒產(chǎn)品指導(dǎo)進(jìn)行。使用Bam HⅠ和SalⅠ對目標(biāo)質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，酶切體系建立及酶切反應(yīng)結(jié)果確認(rèn)均按標(biāo)準(zhǔn)分子操作進(jìn)行[6]。

1.3.2 pCAMBIA1205-GFPn-MsSDCS-0重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化GV3101與陽性菌落鑒定

取3μl構(gòu)建成功的pCAMBIA1205-GFPn-MsS?DCS-0重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至GV3101感受態(tài)細(xì)胞中，轉(zhuǎn)化過程使用凍融法進(jìn)行。轉(zhuǎn)化細(xì)胞涂布于含Chl（30mg/L），Rif（50mg/L）和Gent（25mg/L）抗性的LB平板上，28℃倒置培養(yǎng)過夜，挑取單菌落作為模板PCR驗(yàn)證，篩選陽性克隆。PCR反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性10min，94℃變性10 s，58.5℃退火30 s，72℃延伸1min，共35個循環(huán)，最后72℃延伸7min.使用正向引物為35SF，反向引物MsSDCS-0R進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測，確認(rèn)陽性克隆后保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 pCAMBIA1205-GFPn-MsSDCS-0重組質(zhì)粒擬南芥原生質(zhì)體瞬時表達(dá)

使用生長在短日照條件下，大約3～4周未開花植物，取第2～4對葉片，用鋒利的刀片去掉葉片的尖部和尾部，把中間部分切成0.5～1mm的長條。將10～20個葉片的切片溶于裝5～10ml的W 5溶液（1.25%celluase R10，0.3%mace-rozyme R10，0.4 Mmannitol，20mM KCl，20mMMES，pH 5.7，10 mM CaCl2，0.1%BSA，0.45μm濾膜過濾，溶液呈透明橙色）燒杯中。用30～75μm(200目)的尼龍膜過濾含有原生質(zhì)體的W 5溶液置于50m l的離心管中。100 g，lmin離心沉淀原生質(zhì)體，去上清。在PEG轉(zhuǎn)化前用適量的MMg溶液（0.4 Mmannito，15mMMgCl2，4mMMES，pH 5.7)懸浮原生質(zhì)體(1-2x105/m l)。

30μg質(zhì)粒DNA加入200μl原生質(zhì)體(4x104)放入離心管中，混勻，勿上下顛倒，防止原生質(zhì)體破碎。加220μl PEG溶液（4 g PEG4000，3m l H2O，2.5 ml 0.8 M mannitol，1 ml 1 M CaCl2)，混勻，23℃孵育5～30min.每次處理6個樣品，加0.8ml W5溶液，混勻，10 g，lmin，離心去除PEG，先用100μlW 5懸浮原生質(zhì)體，再加W5至1m l.液體放在24孔板上23℃孵育，24 h后在Confocal下進(jìn)行熒光亞細(xì)胞定位觀察。

1.3.4植物GFP熒光表達(dá)載體的擬南芥轉(zhuǎn)化

植物轉(zhuǎn)化方法采用農(nóng)桿菌浸蘸法，[7]擬轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101菌株在含Chl（30mg/L），Rif（50mg/L）和Gent（25mg/L）抗性的5ml LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，次日轉(zhuǎn)接于200ml與上述小量培養(yǎng)液相同的LB培養(yǎng)基中，當(dāng)菌液的OD600至0.8～1.0時，5000 rpm常溫離心10min收集菌體，菌體沉淀重懸浮于等體積（200ml）MSB培養(yǎng)基（每L含MS 2.2 g、蔗糖50 g、silwet L-77 200μl、6-BA 200μl）中，挑選處于開花期、生長良好的野生型擬南芥Col-0，在含目的載體質(zhì)粒的GV3103的轉(zhuǎn)化液中轉(zhuǎn)化2min后，用保鮮膜包裹，分別做好標(biāo)記，水平放置于培養(yǎng)盤中暗中培養(yǎng)24 h，后置于正常生長條件下繼續(xù)生長。T1代種子分別用于表型觀察和熒光觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 MsSDCS-0基因植物GFP熒光表達(dá)載體構(gòu)建

pBSC-MsSDCS-0及pCAMBIA1205-GFPn質(zhì)粒經(jīng)Bam HⅠ和SalⅠ雙酶切、膠回收后，使用T4 DNA連接酶將MsSDCS-0片段與pCAMBIA1205-GFPn酶切后載體進(jìn)行連接，并轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞中。在含Chl抗性的LB平板上篩選陽性克隆。挑取單個陽性克隆菌落于LB/Chl培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)。質(zhì)粒提取質(zhì)量如圖1A所示，用Bam HⅠ和SalⅠ對所構(gòu)建重組質(zhì)粒載體進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證，電泳結(jié)果如圖1 B所示。并將該重組質(zhì)粒載體被命名為pCAM?BIA1205-GFPn-MsSDCS-0.

圖1 重組質(zhì)粒pCAMBIA1205-GFPn-MsSDCS-0質(zhì)粒提取與酶切驗(yàn)證

電泳檢測結(jié)果顯示：重組質(zhì)粒載體pCAM?BIA1205-GFPn-MsSDCS-0經(jīng)Bam HⅠ和SalⅠ雙酶切后可釋放出2個片段，其分別為目的基因MsS?DCS-0片段及pCAMBIA1205-GFPn載體骨架片段，條帶表現(xiàn)清晰，分別為～970bp和～10Kb，且符合預(yù)期大小。表明MsSDCS-0已成功構(gòu)建到植物熒光表達(dá)載體pCAMBIA1205-GFPn上，可用于擬南芥原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化及農(nóng)桿菌GV3101的轉(zhuǎn)化。

2.2 pCAMBIA1205-GFPn-MsSDCS-0農(nóng)桿菌及擬南芥轉(zhuǎn)化與陽性轉(zhuǎn)化子驗(yàn)證

將重組載體pCAMBIA1205-GFPn-MsSDCS-0使用凍融法轉(zhuǎn)化至GV3101農(nóng)桿菌。挑取農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化克隆作為PCR模板，以35SF為正向引物，目的基因特有MsSDCS-0R為反向引物進(jìn)行菌落PCR，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖2A所示。為考察目的基因在擬南芥中的表達(dá)模式，以農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方式將所構(gòu)建的植物GFP熒光表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至擬南芥中，T1代種子在含潮霉素的MS平板上進(jìn)行篩選，并提取篩選平板上的陽性植株基因組DNA為模板，以與鑒定陽性農(nóng)桿菌相同的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)果如圖2B所示。

圖2 pCAMBIA1205-GFPn-MsSDCS-0轉(zhuǎn)化、GV3101菌落及擬南芥PCR驗(yàn)證

圖2A顯示不同的轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌均可擴(kuò)增出一條大約1600 bp的陽性條帶，片段大小約為1000bp，2x35S長度約為600 bp，擴(kuò)增條帶大小與理論預(yù)期大小相符，此結(jié)果表明植物熒光GFP表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌成功，可以用于擬南芥植物的轉(zhuǎn)化過程。

從圖2B中可看出，在所選取的11株擬南芥轉(zhuǎn)化株中，4株可擴(kuò)增出一條處于約1.6 Kb陽性帶，而未轉(zhuǎn)化植株無陽性特征條帶。擴(kuò)增出的陽性條帶明顯，片段大小與農(nóng)桿菌中的陽性條帶相同，考慮其所用引物的特異性，可確認(rèn)目的基因植物GFP熒光表達(dá)載體已成功轉(zhuǎn)化至擬南芥中。

2.3 MsSDCS-0的亞細(xì)胞定位觀察

為考察目的基因在細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位，將所構(gòu)建的重組植物GFP熒光表達(dá)載體以PEG方法轉(zhuǎn)化至擬南芥野生型（Col-0）原生質(zhì)體中，表達(dá)24 h后在Confocal上進(jìn)行熒光觀察，原生質(zhì)體中GFP熒光觀察如圖3所示：

圖3 pCAMBIA1205-GFPn-MsSDCS-0轉(zhuǎn)化擬南芥后MsSDCS-0蛋白的熒光亞細(xì)胞定位

圖3基因熒光圖譜顯示：在所觀察的細(xì)胞中，目的基因表達(dá)蛋白熒光信號主要出現(xiàn)于胞質(zhì)中或細(xì)胞器中，表明目的基因在細(xì)胞中主要定位于胞質(zhì)或細(xì)胞器中。

2.4 重組質(zhì)粒載體pCAMBIA1205-GFPn-MsS?DCS-0轉(zhuǎn)基因擬南芥表型觀察

苜蓿半胱氨酸合成酶成員MsSDCS-0主要參與植物體內(nèi)半胱氨酸的合成，為確認(rèn)當(dāng)該基因成員在植物體內(nèi)過表達(dá)后是否會對植物的生長產(chǎn)生影響，本研究中獲得MsSDCS-0的擬南芥后，將其T1代種子種植于營養(yǎng)缽中，當(dāng)生長至3-4周后觀察其生長表型是否會發(fā)生變化，典型的MsSDCS-0轉(zhuǎn)基因擬南芥生長表型如圖4所示：

圖4 MsSDCS-0轉(zhuǎn)擬南芥陽性植株表型觀察

圖4顯示，與野生型擬南芥相比，過表達(dá)MsS?DCS-0的擬南芥在3-4周的生長表型，包括葉的數(shù)目、形狀及葉色上并未顯示出差異。表明當(dāng)MsS?DCS-0在植物體內(nèi)過表達(dá)后不會對植物的正常生長產(chǎn)生有害的影響。

2.5 pCAMBIA1205-GFPn-MsSDCS-0在擬南芥根中的表達(dá)模式

基因表達(dá)模式預(yù)示著基因的功能，為考察Ms?SDCS-0在轉(zhuǎn)基因擬南芥中的在體表達(dá)模式，將目的基因的植物GFP熒光表達(dá)載體轉(zhuǎn)入擬南芥中，使用GFP熒光觀察轉(zhuǎn)擬南芥根尖目的基因表達(dá)模式，目的基因在轉(zhuǎn)基因擬南芥根尖的GFP熒光Confocal圖像如圖5所示：與在擬南芥中所觀察到的該基因亞細(xì)胞定位一樣，該基因在轉(zhuǎn)基因擬南芥根尖中的GFP熒光信號主要表達(dá)于植物細(xì)胞的胞質(zhì)中，在部分細(xì)胞中也可在核中檢測到該基因的GFP熒光信號，從上述結(jié)果可看出，該基因在體也主要表達(dá)于細(xì)胞胞質(zhì)中。

圖5 轉(zhuǎn)基因擬南芥根尖目的基因GFP圖像

3 討 論

本研究對含pBSC-MsSDCS-0克隆載體陽性菌株進(jìn)行復(fù)蘇純化并提取質(zhì)粒，將其與pCAM?BIA1205-GFPn載體使用Bam HⅠ和SalⅠ雙酶切，純化后使用T4 DNA連接酶進(jìn)行連接，最終構(gòu)建成功GFP融合的目的基因植物表達(dá)載體。驗(yàn)證載體正確后使用PEG方法轉(zhuǎn)化入野生型擬南芥（Col-0）原生質(zhì)體中，熒光觀察目的基因的定位。同時將目的基因植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101，對野生型擬南芥（Col-0）根尖進(jìn)行熒光觀察，確認(rèn)該基因的表達(dá)模式。此外，對轉(zhuǎn)基因擬南芥的生長表型進(jìn)行了觀察。

本研究結(jié)果表明：MsSDCS-0擬南芥原生質(zhì)體及在體植物根尖中主要定位于細(xì)胞質(zhì)中，并在植物細(xì)胞器中也可檢測到熒光信號，表明部分該蛋白成員也存在于植物細(xì)胞器中。植物CSase家族存在多個同工酶成員，已有研究表明，不同植物其成員組成不同，水稻有9個同工酶，擬南芥有9個，高粱和大豆各6個，毛果楊有10個[7]。在擬南芥中對于Cys合成所需的同工酶和編碼基因已經(jīng)有了比較詳細(xì)的研究，CSase家族中的9個成員的基因序列已全部測出。[8]通過生化分析已確認(rèn)，擬南芥中合成半胱氨酸的主要同工酶有OAS-TL A1（細(xì)胞質(zhì)）、OAS-TLB（葉綠體）、和OAS-TLC（線粒體）。其合成的主要場所是葉肉細(xì)胞胞質(zhì)，酶活性可以達(dá)到細(xì)胞總OAS-TL活性的95%以上。[8-11]本研究結(jié)果表明苜蓿半胱氨酸合成酶MsSDCS-0成員主要定位于擬南芥胞質(zhì)中，此與已有的成果相一致，說明其與擬南芥相應(yīng)成員序列的高相似性與其功能的一致性。也說明該成員主要在胞質(zhì)中參與植物半胱氨酸合成的功能。

然而，前期對該成員的體外活性測試顯示，該酶是一個雙功酶，體外活性測試中表現(xiàn)出了2種活性。其不僅具有半胱氨酸合成酶的活性，也表現(xiàn)出了氰基丙氨酸合成酶的活性，此活性的功能主要用于細(xì)胞內(nèi)對CN-的解毒上，并主要在細(xì)胞器如線粒體中進(jìn)行[12]。本研究中MsSDCS-0不僅定位于胞質(zhì)中，也存在于細(xì)胞器中，猜測其在細(xì)胞不同的部位行使不同的功能。然而，該成員在細(xì)胞中定位于不同的部位，或其可進(jìn)行跨膜轉(zhuǎn)輸，仍需對此機(jī)理做進(jìn)一步的研究。

在擬南芥中過表達(dá)苜蓿半胱氨酸合成酶成員MsSDCS-0未發(fā)現(xiàn)植物生長表型異常，表明在提高植物體內(nèi)Cys合成或其他含硫氨基酸含量時，沒有對植物的生長產(chǎn)生影響。猜測在植物體內(nèi)可能存在其他的調(diào)節(jié)元件或機(jī)制，以對抗該基因的過表達(dá)影響，使其生長表型未發(fā)生變化。然而，植物細(xì)胞內(nèi)任何的基因過表達(dá)均會對其整個代謝網(wǎng)絡(luò)發(fā)生擾動，此種影響可能是本研究未檢測的項(xiàng)目。因此，對轉(zhuǎn)基因植物中含硫氨基酸含量的測定及其他的生理指標(biāo)的測定也是本研究的進(jìn)一步工作。