張磊， 姚江雄， 紀(jì)洵敏， 余婷婷， 蒲俏虹， 唐芮， 許瑛， 賴文輝， 彭拓華△， 張吉凱

1廣東省生物制品與藥物研究所耐藥監(jiān)測室(廣東廣州 510440)； 2廣州白云山星群(藥業(yè))股份有限公司(廣東廣州 510288)

登革病毒(dengue virus，DENV)是單股正鏈RNA病毒，有脂質(zhì)包膜包裹，隸屬于黃病毒科[1]，該病毒主要引起登革熱，是一種急性發(fā)熱性疾病，登革熱病毒主要包括4種血清型：Ⅰ型登革熱病毒(DENV-1)、Ⅱ型登革熱病毒(DENV-2)、Ⅲ型登革熱病毒(DENV-3)和Ⅳ型登革熱病毒(DENV-4)。近幾年，登革熱發(fā)展趨勢迅猛，發(fā)病病例逐年增加，已成為全球性的公共衛(wèi)生事件，該疾病主要在熱帶、亞熱帶地區(qū)流行[2]，在我國，則主要在華南地區(qū)流行，以DENV-1為主。目前對登革熱的治療主要分為抗病毒治療，對癥治療和中醫(yī)辨證治療[3]。夏桑菊源自于清代吳鞠通《溫病條辨》的經(jīng)典名方“桑菊飲”，收載于《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》中藥成方制劑第十五冊，夏桑菊主要由夏枯草、桑葉、野菊花3味藥材經(jīng)加工而制成，具有清肝明目、疏風(fēng)散熱，除濕痹以及解瘡毒之功效，常用于風(fēng)熱感冒、目赤頭痛和咽喉腫痛等癥的治療[4]。目前，夏桑菊顆粒對DENV-1的作用效果研究還未見于公開發(fā)表的文獻(xiàn)，2017年10月至2018年6月，本研究以前期基礎(chǔ)研究工作為基礎(chǔ)，以期為登革熱疾病的抗病毒治療提供基礎(chǔ)研究數(shù)據(jù)，豐富臨床治療手段。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥物 白云山牌夏桑菊顆粒劑(批號：MA0180，廣州白云山星群藥業(yè))，用PBS配制1 g/mL夏桑菊顆粒溶液，0.22 μm微孔濾膜過濾除菌；陽性對照藥物利巴韋林注射液(批號：1409254，杭州民生藥業(yè)，100 mg/mL)。

1.1.2 細(xì)胞與病毒 C6/36白紋伊蚊細(xì)胞(簡稱C6/36細(xì)胞)與DENV-1均由廣東省疾病預(yù)防控制中心提供。

1.1.3 儀器與試劑 LightCycler 480實時熒光定量PCR(羅氏，美國)，奧林巴斯熒光倒置顯微鏡IX73(奧林巴斯，日本)、酶標(biāo)儀(BioTek，美國)、LHS-150SC恒溫培養(yǎng)箱(上海一恒科技有限公司)、二級生物安全柜(Thermo Fisher Scientific，美國)等；DMEM(Gibco，美國Life Technologies)，胎牛血清 (四季青，浙江天航生物有限公司)，MTT(Sigma，美國)，DMSO(天津市富宇精細(xì)化工有限公司)，山羊抗小鼠IgG H&L(Alexa Fluor? 594)(Abcam，ab150116)，Anti-Dengue Virus NS1 glycoprotein抗體[DN1](Abcam，ab41490)，DENV-1核酸檢測試劑盒(澳東，批號：40086)，病毒RNA提取試劑盒(QIAamp Viral RNA Mini Kit，QIAGEN，批號：154032285)。

1.2 方法

1.2.1 藥物細(xì)胞毒性測定 將C6/36細(xì)胞以1×106·mL-1接種至96孔板，100 μL/孔，37℃，5%CO2培養(yǎng)過夜，將藥物按照倍比稀釋自1∶8稀釋至1∶2 048，夏桑菊顆粒對應(yīng)的濃度分別為125.00、62.50、31.25、15.63、7.81、3.91、1.95、0.98、0.49 mg/mL，利巴韋林對應(yīng)的濃度分別為12.50、6.25、3.13、1.56、0.78、0.39、0.20、0.10、0.05 mg/mL。每孔加100 μL藥物和100 μL細(xì)胞維持液(以下簡稱MM，DMEM+2%FBS)，設(shè)3個復(fù)孔，同時設(shè)立空白對照孔。37℃、5%CO2培養(yǎng)96 h，按照MTT操作說明，測定OD值，試驗重復(fù)3次，確定細(xì)胞的最大無毒劑量[5]。

1.2.3 細(xì)胞免疫熒光法分析夏桑菊顆粒對DENV-1抑制率的影響 將不同濃度的夏桑菊顆粒與病毒36℃的預(yù)處理1 h后，加入到細(xì)胞濃度為1×106·mL-1的C6/36細(xì)胞中，每個濃度設(shè)3個復(fù)孔，同時設(shè)空白對照組和對照組，置于37℃、5%的CO2孵箱中，孵育1.5 h，棄上清后繼續(xù)加入不含藥物的MM，再孵育96 h；出去培養(yǎng)基，PBS洗1次；4%多聚甲醛(溶于PBS中，pH=7.4)室溫孵育細(xì)胞10 min，PBS洗3次，每次5 min；用1% BSA室溫下封閉1 h；然后加入以小鼠抗DENV-1 NS1蛋白抗體為一抗(1∶2 000)[7]，室溫孵育2 h；PBS洗3次，每次5 min；再加入Alexa Fluor? 594標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG為二抗(稀釋度為1∶10 000)，常溫避光孵育1 h。熒光顯微鏡下觀察病毒NS1抗原的表達(dá)，Image Pro Plus6.0軟件分析NS1抗原表達(dá)情況，計算相對感染率。相對感染率=(藥物陽性細(xì)胞數(shù)/病毒陽性組細(xì)胞數(shù))×100%。

1.2.4 熒光定量PCR分析夏桑菊顆粒對DENV-1 RNA復(fù)制的影響 細(xì)胞按照對應(yīng)的處理方式處理后，連續(xù)培養(yǎng)96 h，取細(xì)胞和培養(yǎng)基上清，在-80℃冰箱和37℃水浴反復(fù)凍融3次，3 000 r/min，離心20 min，取上清，病毒RNA抽提試劑盒抽提RNA，熒光定量PCR實驗參照試劑盒說明書，進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，檢測上清液中DENV-1的拷貝數(shù)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)分析采用方差分析法，多組間的兩兩比較采用t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 夏桑菊顆粒對C6/36細(xì)胞毒性測定 MTT結(jié)果顯示，夏桑菊顆粒溶液在稀釋至15.63 mg/mL(1/64)時，細(xì)胞活力為(81.0±3.5)%，而在7.81 mg/mL(1/128)，細(xì)胞活力達(dá)到(93.0±7.1)%，并且隨著稀釋度的增大，細(xì)胞活性無顯著變化，因而選取夏桑菊顆粒溶液的最大無毒劑量為7.81 mg/mL(圖1)。利巴韋林注射液在6.25 mg/mL(1/16)時，細(xì)胞活力為(79.0±4.3)%，而在6.25 mg/mL(1/32)時，細(xì)胞活力達(dá)到(92±3.8)%，并且隨著稀釋度的增大，細(xì)胞活性均維持在92%以上，無出現(xiàn)顯著變化，因而選取夏桑菊顆粒溶液的最大無毒劑量6.25 mg/mL(圖1)。

圖1 夏桑菊顆粒和利巴韋林細(xì)胞毒性實驗

2.2 夏桑菊顆粒對DENV-1感染細(xì)胞病變效應(yīng)的影響結(jié)果 病毒陽性組的細(xì)胞存活率為(57.1±4.6)%，病毒經(jīng)3.13和1.56 mg/mL陽性藥物利巴韋林處理后，感染細(xì)胞，細(xì)胞存活率分別增加至(96.3±6.5)%和(81.3±7.7)%(P<0.05)，細(xì)胞活力分別增加(39.2±1.9)%和(24.2±3.1)%，引起細(xì)胞的病變效應(yīng)明顯減弱，細(xì)胞活力明顯增加(P<0.05)；同時，病毒經(jīng)7.81和3.91 mg/mL夏桑菊顆粒溶液處理后，感染細(xì)胞，細(xì)胞存活率分別增加至(79.0±8.9)%和(72.8±8.6)%，細(xì)胞活力分別增加(21.9±4.3)%和(15.7±4.1)%，引起細(xì)胞的病變效應(yīng)明顯減弱，細(xì)胞活力明顯增加(P<0.05)。夏桑菊顆粒恢復(fù)細(xì)胞存活率的能力不及利巴韋林，但與病毒陽性組相比細(xì)胞的存活率明顯增加，病毒引起的病變效應(yīng)降低。見圖2。

與病毒陽性組比較*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

2.3 夏桑菊顆粒對DENV-1的抑制率影響(細(xì)胞免疫熒光) 紅色熒光部分為DENV-1感染陽性的細(xì)胞，利巴韋林在3.13和1.56 mg/mL濃度時相對感染率分別為(48.9±2.3)%和(60.7±2.9)%，病毒相對感染率下降(51.1±2.3)%和(49.3±2.9)%；夏桑菊顆粒在7.81和3.91 mg/mL濃度時相對感染率分別為(57.9±7.4)%和(75.8±2.5)%，病毒相對感染率下降(42.1±7.4)%和(24.2±2.5)%；利巴韋林和夏桑菊顆粒對DENV-1感染細(xì)胞具有明顯的抑制作用(P<0.05)，這種抑制作用呈現(xiàn)出一定的劑量依賴性。見圖3。

2.4 夏桑菊顆粒對DENV-1 RNA復(fù)制的影響 利巴韋林在3.13 mg/mL和1.56 mg/mL濃度時病毒拷貝數(shù)平均比值分別為(48.9±2.3)%，(60.7±2.9)%，抑制率達(dá)到(51.1±2.3)%和(39.3±2.9)%；夏桑菊顆粒在7.81 mg/mL和3.91 mg/mL濃度時病毒拷貝數(shù)平均比值分別為(57.9±7.4)%，(75.8±2.5)%，抑制率達(dá)到(42.1±7.4)%和(24.2±2.5)%，利巴韋林和夏桑菊顆粒對DENV-1的復(fù)制產(chǎn)生了明顯的抑制作用(P<0.05)，并且都存在明顯的劑量依賴性。見圖4。

3 討論

登革熱主要由登革熱病毒引起，臨床癥狀包括典型登革熱，登革熱出血熱以及登革熱休克綜合征，該病已波及到全球幾十億人口，我國登革熱主要流行于廣東、廣西、海南和臺灣等地，而且以DENV-1為主[8-9]。目前，尚未有治療登革熱的特效藥物，臨床治療主要以對癥治療為主，包括退熱、補(bǔ)液和鎮(zhèn)靜止痛。

登革熱病屬于中醫(yī)學(xué)的“瘟疫”范疇，濕熱郁遏，衛(wèi)氣同病，治療以清熱解毒為主[10]，登革熱診療指南(2014年第2版)中推薦的清熱解毒的藥物包括熱毒寧、清開靈等，并且相關(guān)的臨床研究證明熱毒寧、清開靈等在臨床上治療登革熱均有明顯的療效[11-13]。

A：未轉(zhuǎn)染病毒的空白細(xì)胞組；B：利巴韋林1/32稀釋組；C：利巴韋林1/64稀釋組；D：病毒陽性組；E：夏桑菊顆粒1/128稀釋組；F：夏桑菊顆粒1/256稀釋組；G：夏桑菊顆粒與利巴韋林對DENV-1感染細(xì)胞抑制率的影響；與病毒陽性組比較*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

圖3不同的藥物稀釋度對病毒感染細(xì)胞的影響(n=3)

與病毒陽性組比較*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；比值為藥物組/病毒陽性組

圖4qPCR實驗結(jié)果(n=3)

夏桑菊顆粒與熱毒寧、清開靈等同屬清熱解毒藥物，已被列入2018年流行性感冒診療方案中的推薦治療藥物[14]，夏桑菊顆粒劑是由夏枯草、桑葉和野菊花三味中草藥組成的復(fù)方制劑，具有清肝明目、清熱解毒之功效。具有明顯的抗病毒，消炎抗過敏等作用[15-16]。夏桑菊顆粒組成之一夏枯草的主要成分為黃酮類物質(zhì)，其抗登革熱病毒作用國外已有報道[17]，但是作為復(fù)方制劑的夏桑菊顆粒的抗登革熱病毒的作用國內(nèi)外還未見報道。

本研究在前期采用藥物與病毒同時加入、藥物預(yù)保護(hù)后加入病毒、病毒感染后再加入藥物以及藥物與病毒預(yù)處理后感染細(xì)胞4種方式進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)只有藥物與病毒預(yù)處理方式對病毒有明顯的作用，因而選用這種處理方式，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)夏桑菊顆粒處理后病毒感染細(xì)胞的能力明顯下降，同時采用細(xì)胞免疫熒光和熒光定量PCR的方法進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)在無明顯細(xì)胞毒性的稀釋度下，夏桑菊顆粒能夠明顯抑制DENV-1感染細(xì)胞的能力，DENV-1的復(fù)制能力也受到了抑制。這說明夏桑菊顆粒能夠?qū)ENV-1產(chǎn)生直接的作用，主要可能對病毒的感染能力和RNA復(fù)制能力產(chǎn)生直接的抑制，這種抑制作用與目前一些清熱解毒藥物的抗登革熱病毒報道[12，18]的作用機(jī)制是類似的。說明夏桑菊顆粒具有抗登革熱病毒的作用，但是該研究只是基于細(xì)胞層面，缺乏相應(yīng)的動物實驗數(shù)據(jù)以及臨床試驗數(shù)據(jù)，其抗登革熱病毒的作用還需進(jìn)一步探討。

綜上所述，夏桑菊顆粒具有明顯的直接抗DENV-1的作用，夏桑菊顆粒是一種明確的中藥成方制劑，是我國中醫(yī)藥的杰出代表，適用范圍大，安全性高，進(jìn)一步發(fā)掘其在治療登革熱方面的價值，對豐富登革熱臨床治療手段具有重要意義，其有望成為抗登革熱病毒藥物家族的新成員。雖然本實驗將為夏桑菊顆粒應(yīng)用臨床治療登革熱疾病提供了基礎(chǔ)研究數(shù)據(jù)，但是其確切的作用機(jī)制和體內(nèi)效果還需要動物實驗數(shù)據(jù)和臨床研究的進(jìn)一步研究證實。