陶興魁,高貴珍,張興桃,王海潮,李秀娟,孔小燕

(宿州學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院，安徽 宿州 234000)

藍(lán)莓(Vaccinium Spp)，別名越橘，屬于杜鵑花科越桔屬，多年生漿果類灌木，果實(shí)營養(yǎng)豐富。藍(lán)莓果實(shí)中的花青素可以保護(hù)眼睛、增強(qiáng)視力[1]，是一種抗養(yǎng)化劑。藍(lán)莓也是一種高纖維食品，對(duì)防止人體細(xì)胞衰老，預(yù)防老年性疾病(心臟病、白內(nèi)障、癌癥、記憶力衰退等)具有特殊功效[2]，因而被國際糧農(nóng)組織列為五大健康食品之一[3-4]，被譽(yù)為“黃金漿果”，在我國具有很好的市場發(fā)展前景[5-7]。藍(lán)莓常規(guī)繁殖速度較慢，且病毒感染嚴(yán)重，品種容易退化[8-9]，利用組織培養(yǎng)則繁殖速度較快，且能保持品種特性[10]。因此對(duì)藍(lán)莓的組織培養(yǎng)及快速繁殖進(jìn)行了研究，探索了不同培養(yǎng)基、植物激素及pH對(duì)藍(lán)莓誘導(dǎo)叢生芽增殖的影響；不同培養(yǎng)基、活性炭含量、激素濃度及pH對(duì)試管苗生根的影響，從而獲得適合藍(lán)莓快速繁殖各個(gè)階段的最適培養(yǎng)條件。

1 材料和方法

1.1 材料

生長健壯的無病蟲害的當(dāng)年生藍(lán)莓新枝條(宿州市埇橋區(qū)西二鋪藍(lán)莓苗圃基地)。

1.2 方法

(1)外植體的選擇和滅菌。幼嫩枝去掉頂梢，用清水浸泡，催芽，溫度控制在20 ℃～25 ℃。當(dāng)枝條的腋芽萌發(fā)后，用自來水沖洗3 h，剪取長1.0～1.5 cm的帶腋芽莖段，用清水反復(fù)沖洗，然后在超凈工作臺(tái)上用75%酒精溶液處理30 s，無菌水沖洗數(shù)次，再用1%升汞溶液浸泡5 min，用無菌水沖洗5～6次，沖洗速度先快后慢。

(2)培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件。分別以MS、1/2MS、改良WPM、1/2WPM為基本培養(yǎng)基，增添瓊脂粉7.0 g/L，蔗糖20 g/L，培養(yǎng)基滅菌20 min，高壓滅菌鍋設(shè)置為121 ℃、131 Kpa，培養(yǎng)室溫度設(shè)置為25 ℃。采用L9(34)正交表探究不同培養(yǎng)基、IBA、pH和ZT對(duì)外植體芽誘導(dǎo)的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示；相同pH(5.3)，不同培養(yǎng)基、6-BA、ZT對(duì)叢生芽增殖的影響，結(jié)果如表2所示；不同活性炭含量、pH、NAA和ZT對(duì)試管苗生根的影響，結(jié)果如表3所示。

表1 藍(lán)莓叢生芽誘導(dǎo)正交實(shí)驗(yàn)因素水平表L9(34)

表2 藍(lán)莓叢生芽的增殖正交實(shí)驗(yàn)因素水平表L9(34)

表3 組培生根正交試驗(yàn)因素水平表L9(34)

(3)誘導(dǎo)叢生芽萌發(fā)。以正交實(shí)驗(yàn)因素水平表為依據(jù)，配制9種培養(yǎng)基，在莖段兩端剪除多余部分，在無菌條件下將單芽莖段接種于培養(yǎng)基中，每種培養(yǎng)基接種20瓶，每瓶4～5個(gè)，重復(fù)3次，經(jīng)過40d培養(yǎng)統(tǒng)計(jì)發(fā)芽數(shù)和計(jì)算萌芽率，觀察腋芽誘導(dǎo)的效果和新生芽的長勢。

(4)藍(lán)莓叢生芽的增殖。將原代培養(yǎng)的芽切割成2 cm左右的段，轉(zhuǎn)入繼代培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，每種培養(yǎng)基接種20瓶，每瓶4～5個(gè)，重復(fù)3次，經(jīng)過30 d培養(yǎng)統(tǒng)計(jì)增殖倍數(shù)。

(5)藍(lán)莓試管苗的生根。以改良1/2WPM為基本培養(yǎng)基，選取生長健壯的試管苗剪切成長3 cm的尖梢，接種于生根培養(yǎng)基中，每種培養(yǎng)基接種20瓶，每瓶4～5個(gè)，重復(fù)3次，經(jīng)過一個(gè)月培養(yǎng)后，觀察生根情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 藍(lán)莓叢生芽的誘導(dǎo)

不同因素對(duì)藍(lán)莓誘導(dǎo)叢生芽萌發(fā)的影響極差分析如表4所示。由表4可知，3，4，9號(hào)培養(yǎng)基中的單芽莖段叢生芽的萌發(fā)最多，平均出芽率分別達(dá)到60.50%，52.83%和55.83%，存活率比其他培養(yǎng)基都高，并且長勢很好;2，6，8號(hào)培養(yǎng)基中叢生芽的萌發(fā)比較好，平均出芽率值是43.83%～47.17%，但是存活率較低，僅為25%;1，5，7號(hào)培養(yǎng)基中叢生芽的萌發(fā)次之，平均值分別為28.17%，33.00%和26.67%，存活率在25%～30%之間。

正交試驗(yàn)中，極差R值越大，表明該因素在試驗(yàn)中影響越顯著。通過表4極差數(shù)據(jù)分析表明，R值最大的是B因子，因子A的R值最小，即培養(yǎng)基對(duì)單芽莖段萌發(fā)的影響最大，而IBA影響最小，依次為培養(yǎng)基>ZT>pH>IBA。單從誘導(dǎo)叢生芽萌發(fā)的角度看，根據(jù)極差分析的結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，A1B3C2D3是藍(lán)莓單芽莖段叢生芽的萌發(fā)培養(yǎng)基的最佳組合。正交試驗(yàn)是一種均一性設(shè)計(jì)試驗(yàn)，不可能包含全部處理組合，因此A1B3C2D3在實(shí)驗(yàn)中就沒有顯現(xiàn)出來。為驗(yàn)證A1B3C2D3是最優(yōu)組合，配制此種培養(yǎng)基20瓶進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果表明，叢生芽的萌發(fā)誘導(dǎo)達(dá)到85%，明顯高于正交表中的9種培養(yǎng)基，從而證明了A1B3C2D3是藍(lán)莓誘導(dǎo)叢生芽萌發(fā)的最適培養(yǎng)基，即1/2WPM+0.5 mg/L IBA+2.0 mg/L ZT+pH 5.0。

為了進(jìn)一步探究各處理間及因子水平之間的不同，故進(jìn)行了方差分析如表5所示。培養(yǎng)基、ZT的F比均大于F臨界值，影響因素均達(dá)到顯著差異(p<0.05)，而且此結(jié)果與極差分析的結(jié)果相吻合。由此可以得出，誘導(dǎo)藍(lán)莓叢生芽萌發(fā)的最適培養(yǎng)基是1/2WPM+0.5 mg/L IBA+2.0 mg/L ZT+pH 5.0。

表4 不同因素對(duì)藍(lán)莓誘導(dǎo)叢生芽萌發(fā)的影響極差分析

表5 不同因素對(duì)藍(lán)莓誘導(dǎo)叢生芽萌發(fā)的影響方差分析

2.2 藍(lán)莓叢生芽的增殖

不同因素對(duì)藍(lán)莓叢生芽增殖的影響的極差分析如表6所示。由表6可知，4，5號(hào)培養(yǎng)基中的叢生芽的增殖最多，平均增殖倍數(shù)分別達(dá)到106.67%和110.58%，存活率也比其他7種培養(yǎng)基都高，存活率分別達(dá)到83.33%和87.50%，并且長勢很好；3，7號(hào)培養(yǎng)基中的叢生芽的增殖比較好，平均增值倍數(shù)是90.00%～95.00%，存活率是54.17%～70.83%。1，2，6，9號(hào)培養(yǎng)基中叢生芽的增殖不好，平均值分別是62.50%～80.33%，存活率在54.17%～83.33%之間。8號(hào)培養(yǎng)基的叢生芽的增殖最低，平均值僅達(dá)到39.00%，且長勢很不好，存活率也非常低，僅50.00%。

通過表6極差數(shù)據(jù)分析表明，R值最大的是C因子，因子B的R值最小，即6-BA對(duì)叢生芽增殖的影響最大，而ZT影響最小，依次為6-BA>培養(yǎng)基>ZT。單從叢生芽增殖的角度看，從極差分析的結(jié)果可以看出，藍(lán)莓叢生芽增殖培養(yǎng)基的最優(yōu)組合為A2B1C3。為了驗(yàn)證A2B1C3是最優(yōu)組合，配制此種培養(yǎng)基20瓶進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果表明，叢生芽增殖倍數(shù)達(dá)到150%，明顯高于正交表中的9種培養(yǎng)基，并且根系粗壯，須根比較少，從而證明了A2B1C3是藍(lán)莓叢生芽增殖的最適合培養(yǎng)基，即1/2MS+1.0 mg/L ZT+1.5 mg/L 6-BA。

不同因素對(duì)藍(lán)莓叢生芽增殖的影響方差分析如表7所示。由表7可知，因子培養(yǎng)基、6-BA和ZT影響因素均沒有達(dá)到顯著差異(p<0.05)，6-BA的F比值較其他的大。由此可以得出，最適合藍(lán)莓叢生芽增殖的培養(yǎng)基為1/2MS+1.0 mg/L ZT+1.5 mg/L 6-BA。

2.3 藍(lán)莓的組培生根

不同因素對(duì)藍(lán)莓組培生根影響極差分析如表8所示。由表8可知，4號(hào)培養(yǎng)基中的試管苗的生根數(shù)最多，平均生根率是74%，存活率也比較高，達(dá)到66.67%，且根不僅粗壯而且比較長；3，8號(hào)培養(yǎng)基中試管苗的生根數(shù)比較好，平均生根率值是70%；3，8號(hào)培養(yǎng)基存活率較2，6，7號(hào)培養(yǎng)基的存活率低，但是2，6，7號(hào)培養(yǎng)基生根率僅在45%～50%；1，5，9號(hào)培養(yǎng)基中試管苗生根數(shù)比較少，生根率均值在30%～40%之間，且存活率比較低，存活率均值在29.17%～41.67%。

由表8可知，R值最大的是D因子，因子C的R值最小，即活性炭對(duì)藍(lán)莓試管苗生根的影響最大，而pH影響最小，依次為活性炭>ZT>NAA>pH。從極差分析的結(jié)果可以得到，藍(lán)莓試管苗生根的培養(yǎng)基的最優(yōu)組合為A2B3C2D3，在實(shí)驗(yàn)中沒有顯示出來。為了進(jìn)行驗(yàn)證，配制該培養(yǎng)基20瓶進(jìn)行了驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，試管苗生根率發(fā)達(dá)到86%，明顯高于正交表中的9種培養(yǎng)基，從而驗(yàn)證了A2B3C2D3培養(yǎng)基為藍(lán)莓試管苗生根的最適宜培養(yǎng)基，即1.0 mg/L ZT+0.8 mg/L NAA+pH 5.0+0.25%活性炭。

表6 不同因素對(duì)藍(lán)莓叢生芽增殖的影響的極差分析

表7 不同因素對(duì)藍(lán)莓叢生芽增殖的影響方差分析

表8 不同因素對(duì)藍(lán)莓組培生根影響極差分析

不同因素對(duì)藍(lán)莓組培生根影響方差分析如表9所示。由表9可知，因子活性炭的F比值大于F臨界值，達(dá)到顯著差異(p<0.05)，因此也可以看出，活性炭是影響藍(lán)莓試管苗生根的主要因素，而且此結(jié)果與極差分析的結(jié)果相吻合。由此可以得出，藍(lán)莓組培苗生根的最適宜培養(yǎng)基為改良1/2WPM+1.0 mg/L ZT+0.8 mg/L NAA+pH 5.0+0.25%活性炭。

表9 不同因素對(duì)藍(lán)莓組培生根影響方差分析

3 討論與結(jié)論

實(shí)驗(yàn)利用正交設(shè)計(jì)進(jìn)行了極差和方差分析，比較了影響藍(lán)莓增殖的主要因素，以此篩選出了藍(lán)莓組織培養(yǎng)各階段適宜的培養(yǎng)條件。通過實(shí)驗(yàn)得到如下結(jié)論：影響誘導(dǎo)藍(lán)莓叢生芽萌發(fā)的主要因素是培養(yǎng)基和玉米素(ZT)，通過試驗(yàn)篩選出最適宜誘導(dǎo)藍(lán)莓叢生芽萌發(fā)的培養(yǎng)基是1/2WPM+0.5 mg/L IBA+2.0 mg/L ZT+pH 5.0，并且藍(lán)莓長勢良好，存活率也比較高。篩選出藍(lán)莓叢生芽增殖的最適宜培養(yǎng)基是1/2MS+1.0 mg/L ZT+1.5 mg/L 6-BA，叢生芽增殖倍數(shù)高達(dá)150%，分化的苗數(shù)比較多，生長比較旺盛，植株比較粗，而且比較高。藍(lán)莓試管苗生根的最適宜培養(yǎng)基是改良1/2WPM+1.0 mg/L ZT+0.8 mg/L NAA+pH 5.0+0.25%活性炭，試管苗生根率高達(dá)86%，根系比較粗壯，分支多，有利于試管苗移栽成活。

WPM系列培養(yǎng)基在藍(lán)莓初代培養(yǎng)、愈傷組織誘導(dǎo)與分化及叢生芽增殖培養(yǎng)中有較好的培養(yǎng)效果[11]。馬懷宇在高叢藍(lán)莓不定芽再生植株的研究中以WPM、1/2WPM為適合培養(yǎng)基[12]，本實(shí)驗(yàn)得到的結(jié)果誘導(dǎo)藍(lán)莓叢生芽萌發(fā)的主要因素是1/2WPM和玉米素，藍(lán)莓叢生芽萌發(fā)培養(yǎng)基為1/2WPM+0.5 mg/L IBA+2.0 mg/L ZT+pH 5.0，與上述研究結(jié)果一致?；钚蕴吭谒{(lán)莓試管苗增殖和生根過程中起到很好的調(diào)節(jié)作用，鄭理喬[13]等研究表明，當(dāng)培養(yǎng)基中加入100～200 mg/L的活性炭時(shí)，增殖培養(yǎng)效果好，而且可以防褐化，生根情況最為理想。李華娟[14]等以藍(lán)莓莖段為外植體，研究表明增殖培養(yǎng)基以WPM+1.0 mg/L ZT+0.5 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA最佳，生根誘導(dǎo)培養(yǎng)基則以1/2WPM+1.0 mg/L NAA+1.0 g/L活性碳為最好[13]。實(shí)驗(yàn)研究表明，在生根培養(yǎng)基中加入0.25%活性炭，試管苗生根率高達(dá)86%，根系比較粗壯，分支多，有利于試管苗移栽成活。最適培養(yǎng)基的類型及培養(yǎng)條件與前人研究有所差異，可能是由于藍(lán)莓品種的多樣性、基因型的不同、選擇的外植體類型差別等因素。以后可以分別對(duì)不同品種的藍(lán)莓進(jìn)行系統(tǒng)深入研究，以期獲得不同藍(lán)莓品種適宜的培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件。