張靖潔 段露露 程蔚蘭 季春麗 崔紅利 李潤植

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)分子農(nóng)業(yè)與生物能源研究所，太谷030801）

微藻是一類能進(jìn)行光合自養(yǎng)且廣泛分布于自然界的低等植物，因其生長速率快、生物量大和能高水平合成積累多種天然化合物而被人類廣泛利用。微藻基生物產(chǎn)品目前已經(jīng)應(yīng)用于生物制藥、化妝美容、醫(yī)療保健，生物染料、畜禽養(yǎng)殖和水產(chǎn)等行業(yè)中［1-3］。利用微藻生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)生物柴油已成為當(dāng)今國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)之一［4-5］，現(xiàn)已對優(yōu)質(zhì)富油藻種選育［6］、規(guī)?；囵B(yǎng)體系及油脂富集調(diào)控技術(shù)和制油工藝［7］等進(jìn)行了諸多研究，微藻生物柴油產(chǎn)業(yè)化呈現(xiàn)良好前景，盡管成本高和存在一些限制因素。

提高微藻生物質(zhì)和油脂產(chǎn)量是規(guī)?；苽渖锊裼突蚋咧翟逵彤a(chǎn)品的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。然而，微藻規(guī)模化培養(yǎng)過程中常有伴生細(xì)菌污染，尤其是微藻藻際微環(huán)境中存在一些不易去除的細(xì)菌?，F(xiàn)今對這些伴生或共生的細(xì)菌與微藻互作機(jī)制以及對微藻生長和目標(biāo)產(chǎn)物積累的影響還知之甚少。一些研究指出［8-10］，微藻和細(xì)菌密不可分，經(jīng)過長期自然進(jìn)化，真核微藻與原核細(xì)菌之間形成復(fù)雜的相互作用，包括營養(yǎng)依賴、代謝互補(bǔ)等多種方式。而且，藻菌互作是動態(tài)的，能對不同環(huán)境做出響應(yīng)。

目前，已有研究證明［11］，菌藻共生系統(tǒng)可以用于對工廠、市政和養(yǎng)殖等各種污水進(jìn)行高效處理，具有良好的經(jīng)濟(jì)、環(huán)境和社會效益。有關(guān)在微藻規(guī)?；B(yǎng)殖中，應(yīng)用有益藻菌共生體系以期獲得高量微藻生物質(zhì)和生產(chǎn)生物燃油等其他藻基產(chǎn)品還未見詳盡報道。

本文以前期篩選獲得的埃氏小球藻（Chlorella emersonii）藻株SXND-25為試材，分離鑒定藻際細(xì)菌菌群，篩選優(yōu)勢促生菌，人工構(gòu)建藻菌共生體系，分析促生菌對小球藻作用，建立了能顯著提高微藻生物量和產(chǎn)油量的藻菌共生體系。據(jù)此提出了在微藻規(guī)模化養(yǎng)殖中，通過建立調(diào)節(jié)藻際有益菌豐度的藻菌共生體系以期高效生產(chǎn)微藻生物質(zhì)和其他高值藻基產(chǎn)品的技術(shù)策略。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藻種與培養(yǎng)基 實(shí)驗(yàn)所采用的藻種是本實(shí)驗(yàn)室從山西一煤化廠附近水體中分離純化的藻株，經(jīng)18S rDNA鑒定其為埃氏小球藻（Chlorella emersonii）的一個新株系，命名為SXND-25。埃氏小球藻用BG11培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.1.2 菌株與培養(yǎng)基 實(shí)驗(yàn)所使用的菌株是在培養(yǎng)埃氏小球藻的過程中，從藻際微環(huán)境分離出來的6個細(xì)菌菌群/種，經(jīng)過16SrRNA鑒定，分別屬于鶉雞腸球菌（Enterococcusgallinarum）、大腸桿菌（Escherichia coli）、假單胞菌（Pseudomonas）和菠蘿泛菌（Pantoea）4個屬。菌株用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 藻種的分離、純化與鑒定 將采集到的水樣加入BG11培養(yǎng)基，置于光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為：溫度（25±1）℃，濕度45%，光照強(qiáng)度4 500 lx，光暗比16 h∶8 h，每天定時搖動3次。用平板涂布法將藻液稀釋分離，待長出單細(xì)胞藻落，用接種環(huán)挑單株落于液體培養(yǎng)基培養(yǎng)。純化方法是重復(fù)平板涂布和挑單株培養(yǎng)，直至培養(yǎng)皿上沒有雜菌和雜藻為止。

純化的藻種在達(dá)到一定的生物量后離心獲得濕藻液，冷凍干燥后獲得干藻粉，參照程蔚蘭等［12］用CTAB法提取藻DNA，用18S rDNA為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，測序后在數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行序列比對，用鄰接法在MEGA7.0中構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，鑒定藻種。

1.2.2 菌群/種的分離、培養(yǎng)與鑒定 根據(jù)小球藻生長曲線，在生長初期、對數(shù)生長期、穩(wěn)定期各取藻液1 mL，分別稀釋105-108倍。每10倍為一個梯度，各濃度梯度重復(fù)3次。平板涂布于固體牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，做好標(biāo)記。2-3 d后，觀察并記錄固體培養(yǎng)基中菌落形態(tài)特征，挑取固體培養(yǎng)基中形態(tài)特征不同的單菌落分裝于牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，作好標(biāo)號，擴(kuò)繁培養(yǎng)。

菌液離心獲得菌體，提取細(xì)菌DNA，用16S rRNA為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，序列對比后用鄰接法在MEGA7.0中構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，從而鑒定出菌群的種屬。

1.2.3 優(yōu)勢促生菌種/群的篩選 在1 L BG11中接種初始小球藻0.2 g，實(shí)驗(yàn)組分別加入藻菌比（細(xì)胞數(shù)）為1∶1的6個菌株/群進(jìn)行混合培養(yǎng)。菌液經(jīng)8 000 r/min離心5 min，棄上清。菌體沉淀用20 mL BG11培養(yǎng)基重懸后，接入小球藻的培養(yǎng)體系中。對照組為小球藻培養(yǎng)，在小球藻培養(yǎng)體系中加入 20mL BG11培養(yǎng)基，每組設(shè)置3次重復(fù)。檢測培養(yǎng)一定時期的藻體生物量和藻細(xì)胞油脂積累等性狀，以確定促進(jìn)微藻生長的優(yōu)勢菌群/種。

1.2.4 菌藻共生體系的構(gòu)建 實(shí)驗(yàn)組選用優(yōu)勢菌種/群，將菌液接入到小球藻對數(shù)期培養(yǎng)體系（藻體干重為0.2 g/L，體積為1 L）中，分別設(shè)置藻菌比為 10∶1、5∶1、1∶1、1∶5、1∶10 等組合進(jìn)行共培養(yǎng)。每組設(shè)置3次重復(fù)，對照組為小球藻單獨(dú)培養(yǎng)（藻干重為0.2 g/L，體積為1 L）。

1.2.5 小球藻尼羅紅染色和油脂含量及成分測定 將800 μL藻液與200 μL二甲基亞砜（DMSO），10 μL尼羅紅丙酮溶液（0.1 mg/mL）均勻混合，42℃條件下避光水浴5 min。使用藍(lán)光作為激發(fā)光，在正置熒光顯微鏡下觀察并拍照。

本實(shí)驗(yàn)提取油脂的方法是直接轉(zhuǎn)酯化法：將 5 mg凍干藻粉、0.1-0.3 mL氯仿∶甲醇（2∶1，V/V）、0.1-0.5 mL HCl-甲醇（5%，V/V）依次加入特氟龍密封墊片的玻璃螺紋管中。85℃水浴30 min，冷卻至室溫后，加入900 μL正己烷。將其在設(shè)定條件為25℃，150 r/min的搖床上萃取1 h。靜置過夜后，取上清正己烷萃取液，參照張飛等［13］描述的方法，使用氣相色譜儀（GC）（Agilent 7890D）測定脂肪酸組成及含量。色譜柱為Agilent HP-88弱極 性 毛 細(xì) 管 色 譜 柱（30 m×250 μm×0.25 μm），樣品1 μL分流進(jìn)樣，分流比1∶40進(jìn)樣口溫度260℃。使用氮?dú)庾鳛檩d氣，流速為1.0 mL/min。計算各組分的百分含量：峰面積歸一化法。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)Excel整理后進(jìn)行統(tǒng)計和作圖，采用SPSS軟件t檢驗(yàn)進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表示為3次重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 藻株形態(tài)學(xué)及分子鑒定

分離出的單株藻在光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)為綠色，圓球形（圖1），初步鑒定為一株小綠藻。經(jīng)18S rDNA擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物大小為1 798 bp（圖2），測序并與已有微藻18S rDNA序列比對構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示，此藻種與埃氏小球藻（KX395729.1）的距離最近（圖3），但其序列相似度為98%，并不是同一株系，最終鑒定此藻種為埃式小球藻的一個新株系，命名為SXND-25。

圖1 純化的藻種在光學(xué)顯微鏡下的形態(tài)

2.2 埃氏小球藻油脂含量和脂肪酸成分分析

用尼羅紅染料對小球藻細(xì)胞染色，在熒光顯微鏡下定性觀察油脂儲存情況（圖4），可以看到油體在細(xì)胞內(nèi)均勻分布。提取油脂、GC測試結(jié)果顯示，此種小球藻含油量為28.25%，油脂成分中單不飽和脂肪酸（16∶1和18∶1）含量占總油脂含量的13.50%（圖 5）。

2.3 埃氏小球藻藻際共生菌菌落形態(tài)和菌的鑒定

將分離到的細(xì)菌涂布于細(xì)菌培養(yǎng)基，培養(yǎng)至菌落形成，觀察菌落形態(tài)（圖6），包括菌落大小、表面黏稠程度、顏色、邊緣特征，將菌落分成6個不同菌種（表1）。挑去單個菌落，分別純化培養(yǎng)后，提取基因組DNA，進(jìn)行16S rRNA測序鑒定。序列比對（圖7）顯示1號和4號菌種為腸桿菌科的菠蘿泛菌屬（Pantoea），5號菌種為腸桿菌科的大腸桿菌屬（Escherichia coli），2號和6號菌種是假單胞桿菌科的假單胞菌屬（Pseudomonas），3號菌種是腸球菌科的鶉雞腸球菌屬（Enterococcus gallinarum）。

圖2 藻株基因組DNA（A）和藻株18S rDNA PCR產(chǎn)物（B）

圖3 幾種微藻18S rDNA序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

圖4 尼羅紅染色后的埃氏小球藻在熒光顯微鏡下的油體分布

圖5 埃氏小球藻的總油脂含量（W/W）及各脂肪酸相對含量（%）

圖6 菌落的形態(tài)

表1 來自埃氏小球藻藻際6個細(xì)菌菌落的形態(tài)及特征

2.4 六株共棲菌對埃氏小球藻生物量的影響及優(yōu)勢促生菌的篩選

將埃氏小球藻與6株共棲菌分別以1∶1比例組合，連續(xù)8 d共培養(yǎng)，檢測微藻生物量（圖8）表明，6株共棲菌中，菌株3鶉雞腸球菌和菌株5大腸桿菌抑制了微藻的生長，其中抑制作用最強(qiáng)的菌株為菌株3。其余4株共棲菌促進(jìn)了微藻的生長，菌株2假單胞菌的促進(jìn)作用最顯著，微藻生物量達(dá)到4.12 g/L，比對照組增長1.32 g/L，增長量占對照組生物量的47.14%；其次是菌株4菠蘿泛菌的促進(jìn)作用明顯微藻生物量達(dá)到3.73 g/L，比對照組增長0.93 g/L，增長量占對照組生物量的33.21%。據(jù)此，篩選出促進(jìn)微藻生長的優(yōu)勢促生菌株/群為2號和4號菌種，即假單胞菌和菠蘿泛菌，用于下一步埃氏小球藻藻菌共生體系的構(gòu)建。

圖7 六個菌種及其他已知菌種18S rDNA序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

圖8 六株共棲菌對埃氏小球藻生物量的影響

2.5 埃氏小球藻與假單胞菌共生體系的構(gòu)建及對微藻生長的影響

構(gòu)建埃氏小球藻與假單胞菌不同配比（10∶1、5∶1、1∶1、1∶5、1∶10）藻菌共生體系，分別共培養(yǎng)8 d，檢測每天的生物量和第8天的藻細(xì)胞含油量。結(jié)果表明（圖9），藻菌比和生物量呈先增后減的趨勢。在藻菌比例為1∶1時，第8天生物量高達(dá)4.12 g/L，相比對照組增長了1.32 g/L，增長率為47.14%，此時油脂含量為29.50%，相比對照組增長了1.25%，增率為4.42%。埃氏小球藻和假單胞菌共生體系中，生物量和油脂含量在1∶1以前呈正相關(guān)（圖10），其后隨著藻菌比的降低，小球藻的生物量和含油率均減低。

圖9 埃氏小球藻與假單胞菌共生體系生物量變化情況

圖10 埃氏小球藻與假單胞菌共生培養(yǎng)第8天的微藻生物量和油脂含量

2.6 埃氏小球藻與菠蘿泛菌共生體系的構(gòu)建及對微藻生長的影響

構(gòu)建埃氏小球藻與菠蘿泛菌不同配比（10∶1、5∶1、1∶1、1∶5、1∶10）藻菌共生體系，分別共培養(yǎng)8 d，檢測每天的生物量，結(jié)果表明（圖11）當(dāng)藻菌比例為1∶5時，埃氏小球藻生物量最大，第8天生物量為5.86 g/L，相比對照組增長了3.06 g/L，增長率為109.29%。

取微藻培養(yǎng)第8天藻樣，檢測藻細(xì)胞含油量。圖12顯示，藻細(xì)胞油脂含量與生物量趨勢相反，藻菌比例與油脂含量的趨勢先減后增。當(dāng)藻菌比例為1∶5時，藻細(xì)胞油脂含量降低為26.88%，相比對照組降低了4.85%。

圖11 埃氏小球藻與菠蘿泛菌共生體系微藻生物量變化

圖12 埃氏小球藻與菠蘿泛菌共培養(yǎng)第8天的微藻生物量和油脂含量

2.7 藻菌共生體系對微藻脂肪酸組成的影響

構(gòu)建埃氏小球藻與假單胞菌比為1∶1的共生體系1以及埃氏小球藻與菠蘿泛菌比為1∶5的共生體系2，分別培養(yǎng)8天后，檢測藻細(xì)胞各脂肪酸成分含量，并計算飽和脂肪酸（SFA）、單不飽和脂肪酸（MUFA）和多不飽和脂肪酸（PUFA）的含量。檢測結(jié)果表明（表2）共生體系1和共生體系2中MUFA含量比對照組均有提高。共生體系2中藻細(xì)胞MUFA含量提高更顯著，比對照增加了162.96%，同時飽和脂肪酸和多不飽和脂肪酸相應(yīng)地降低。在藻菌共生培養(yǎng)體系中，藻細(xì)胞油脂的總產(chǎn)量均比對照組高（表3），且共生體系2總油脂產(chǎn)量高達(dá)1 575 mg/L，共生體系1次之。然而，共生體系2中的MUFA產(chǎn)量遠(yuǎn)高于共生體系1，達(dá)554-564 mg/L，其中油酸（C18∶1）比對照組顯著提高。單不飽和的油酸和棕櫚油酸（16∶1）是制取優(yōu)質(zhì)生物柴油的理想脂肪酸成分。因此，共生體系2更適合應(yīng)用于生產(chǎn)生物柴油的規(guī)模化培養(yǎng)。

表2 埃氏小球藻及其藻菌共培養(yǎng)第8天藻細(xì)胞各脂肪酸含量（%）

3 討論

微藻生長自然水體以及微藻規(guī)?；囵B(yǎng)過程中，其藻際微環(huán)境常存在一些不易徹底分離和去除的細(xì)菌菌群，包括抑藻菌、溶藻菌和促生菌以及依賴菌等。Amin［14］和張晶等［15］對自然水體中藻菌共生體系研究揭示，細(xì)菌為微藻的生長提供了CO2，同時可以分解有機(jī)物，固定無機(jī)氮；微藻則提供了O2促使菌的生長。在微藻純化培養(yǎng)過程中，添加抗生素只殺死了部分外部菌，有益的共生菌則會因藻種的協(xié)助得以生存。將促生菌與目標(biāo)微藻構(gòu)建藻菌共生體系，已應(yīng)用于各種廢水處理，廢水凈化及資源化利用效果明顯。

表3 埃氏小球藻及其藻菌共培養(yǎng)第8天總油脂及飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸產(chǎn)量（mg/L）

通過構(gòu)建優(yōu)勢促生菌種與埃氏小球藻的共生體系，我們研究發(fā)現(xiàn)，埃氏小球藻與假單胞菌（Pseudomonas）1∶1組合（共生體系1），以及埃氏小球藻與菠蘿泛菌（Pantoea）1∶5組合（共生體系2），不僅能顯著提高微藻生物量，還促進(jìn)藻細(xì)胞油脂合成積累。共生體系1在培養(yǎng)8 d時，微藻油脂含量由28.25%增長到29.50%，油脂總產(chǎn)量由791 mg/L增長到1 215 mg/L。雖然共生體系2的油脂含量有所降低，但是在生物量提高較大，最終微藻總油脂產(chǎn)量由791 mg/L增長到1 575 mg/L。其他一些人工構(gòu)建藻菌共生體系研究亦顯示有益共生菌可促進(jìn)微藻生物量和油脂積累的增加［16-18］。例如，Suminto 等［19］研究表明，黃桿菌屬對小球藻的生長具有促進(jìn)作用。史玉倩等［20］報道菠蘿泛菌也可以促進(jìn)小球藻生長和油脂積累，Mouget等［21］的結(jié)果顯示，假單胞菌（Pseudomonas）對小球藻（Chlorella）和柵藻（Scenedesmusobliqnus）的生長都有促進(jìn)作用。

需要指出的是，不同種屬的細(xì)菌與不同微藻的互作效果差異較大。章登嵐［22］研究表明假單胞菌（Pseudomonassp.）會導(dǎo)致微囊球藻（Microcystis aeruginosa）的死亡，從而降低了微囊球藻的生物量。Abed等［23］的研究則顯示，假單胞菌（Pseudomonas）能促進(jìn)藍(lán)藻（Cyanobacterial）—也稱藍(lán)細(xì)菌生物量提高8倍。本研究從埃氏小球藻藻際分離鑒定出6種不同菌種，其中2個菌種抑制微藻生長，4個菌種促進(jìn)微藻生長，假單胞菌（Pseudomonas）和菠蘿泛菌（Pantoea）促生效果極為顯著。

盡管本研究未檢測藻菌互作具體機(jī)制，可能是抑生菌為了競爭養(yǎng)分產(chǎn)生了抑制小球藻生長的物質(zhì)，從而殺死部分埃氏小球藻，而促生菌有可能產(chǎn)生能促進(jìn)微藻生長的物質(zhì)，導(dǎo)致埃氏小球藻生物量增加。本文中假單胞菌（Pseudomonas）對小球藻的生物量和油脂含量均有顯著提高，是最值得關(guān)注的問題。尚海［10］等做電鏡顯示細(xì)菌與藻細(xì)胞以胞外連體的形式共生。共生狀態(tài)下的假單胞菌隨著藻細(xì)胞的大量繁衍，逐漸處于一種脅迫狀態(tài)，可能通過胞外連體錯誤地向藻細(xì)胞傳遞脅迫信號，藻細(xì)胞接受脅迫信號從而調(diào)節(jié)了自身的油脂代謝途徑。可進(jìn)一步分離測得共生菌的細(xì)胞數(shù)和油脂含量來驗(yàn)證。

另外，一些研究表明，假單胞菌（Pseudomonas）和菠蘿泛菌（Pantoea）是一些高等植物的病原菌［24-25］。例如，顧沁等［26］報道菠蘿泛菌是玉米葉脈產(chǎn)生黃色斑點(diǎn)的致病菌。菠蘿泛菌也是多肉植物褐腐病的致病菌［27］。然而，這兩個菌卻能顯著促進(jìn)埃氏小球藻及其他一些微藻的生長。可見，藻菌共生及互作效果具有種屬專一性。小球藻作為單細(xì)胞真核生物，經(jīng)與共生菌協(xié)同進(jìn)化，藻細(xì)胞可能釋放一些抑制周圍其他生物的活性成分，使得菠蘿泛菌不會像危害高等植物那樣抑制小球藻生長，反而小球藻能適當(dāng)控制菠蘿泛菌的生物量，存活的菠蘿泛菌可不斷地提供CO2和其他營養(yǎng)促進(jìn)小球藻的快速生長，二者處于協(xié)作共生狀態(tài)。進(jìn)一步檢測微藻產(chǎn)生何種物質(zhì)或信號分子能有效控制這兩種植物病原菌的生長，可為研發(fā)藻源功效成分及其在農(nóng)作物生產(chǎn)上應(yīng)用提供了理論依據(jù)。

微藻總油脂產(chǎn)量和脂肪酸構(gòu)成（特別是單不飽和脂肪酸）是微藻用于制備優(yōu)質(zhì)生物柴油和高值微藻油脂產(chǎn)品的兩個關(guān)鍵因素。本研究另一個重要發(fā)現(xiàn)是，所構(gòu)建的兩個藻菌共生體系均能顯著提高藻細(xì)胞油脂中單不飽和脂肪酸（十六烯酸和十八烯酸）合成積累量，尤其是共生體系2效果更強(qiáng)。這可能是菌藻共生互作所調(diào)控的結(jié)果。隨著藻菌共生體系培養(yǎng)時間延長，氮源供應(yīng)量下降，造成體系進(jìn)入氮脅迫狀態(tài)。為應(yīng)對氮脅迫，微藻積累更多油脂和具有高抗氧化活性的單不飽和脂肪酸［28］，具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。從制備油脂生物燃油和高端藻油產(chǎn)品出發(fā)，可選用共生體系2進(jìn)行埃氏小球藻規(guī)?；咝юB(yǎng)殖。

4 結(jié)論

本研究篩選到一株生長快、含油量高（＞28%，干重百分比）的優(yōu)異埃氏小球藻藻株，并從其藻際微環(huán)境分離鑒定出6種不同的細(xì)菌菌種。成功構(gòu)建了埃氏小球藻與2種優(yōu)勢促生菌（假單胞菌和菠蘿泛菌）分別組合的有益藻菌共生體系。研究表明，通過構(gòu)建藻菌共生體系，適當(dāng)調(diào)控優(yōu)勢促生菌的豐度，可顯著提高微藻生物量及總油脂和單不飽和脂肪酸的產(chǎn)量。這為探究藻菌互作和規(guī)?；B(yǎng)殖微藻以制備優(yōu)質(zhì)生物燃油或高值微藻油脂產(chǎn)品提供了一條新策略。