竇雯 李尤 逯欣宇 錢雪梅 沈丹宇
(1. 南京外國(guó)語(yǔ)學(xué)校,南京 210008;2. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué),南京 210095)
全球大規(guī)模商業(yè)化種植轉(zhuǎn)基因作物(Genetically modified crops,GMC)自從1996年以來(lái)已有20多年的時(shí)間,種植面積現(xiàn)已經(jīng)累計(jì)達(dá)到23億hm2,涉及大豆、玉米、棉花和油菜等多種作物[1-2]。而在我國(guó)允許商業(yè)化種植的轉(zhuǎn)基因作物只有轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉花和抗病毒番木瓜[3]。大豆是我國(guó)重要的糧食油料作物,同時(shí)大豆在榨油后的豆粕也是重要?jiǎng)游镲暳蟻?lái)源[4]。我國(guó)是大豆消費(fèi)大國(guó),需求量從1990年的1 100萬(wàn)t增加到2015年的9 300萬(wàn)t[5]。但我國(guó)種植的大豆總產(chǎn)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足國(guó)內(nèi)需求,從1996起就開(kāi)始大規(guī)模進(jìn)口。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì),我國(guó)大豆的進(jìn)口量從1996年的111萬(wàn)t持續(xù)增加到2017年的近億噸,其中主要是從巴西、美國(guó)和阿根廷進(jìn)口的轉(zhuǎn)基因大豆[6-7]。盡管目前中國(guó)還沒(méi)有開(kāi)放轉(zhuǎn)基因大豆的商業(yè)化種植,但每年進(jìn)口的轉(zhuǎn)基因大豆已經(jīng)占據(jù)了我國(guó)大豆市場(chǎng)的90%[8]。按照國(guó)家規(guī)定進(jìn)口轉(zhuǎn)基因大豆只能作為榨油和飼料用途,而日常消費(fèi)直接食用的大豆為非轉(zhuǎn)基因大豆。因此,開(kāi)發(fā)轉(zhuǎn)基因大豆的快速檢測(cè)方法對(duì)轉(zhuǎn)基因大豆的實(shí)時(shí)監(jiān)控具有重要意義。
所謂的轉(zhuǎn)基因大豆就是將所需的外源目的基因通過(guò)一定的途徑轉(zhuǎn)入到大豆基因組中,與基因組整合并能穩(wěn)定地遺傳和表達(dá),從而改造大豆的生物學(xué)性狀[9]。目前轉(zhuǎn)基因大豆品種主要有抗除草劑、改良大豆油脂的、抗蟲(chóng)的和復(fù)合性狀轉(zhuǎn)基因大豆[10]。耐除草劑大豆品種含有特異性的抗草甘膦、抗草胺磷或抗磺酰脲類等除草劑的目的基因,能夠高效地去除雜草又確保作物安然無(wú)恙[11]??瓜x(chóng)的轉(zhuǎn)基因大豆將蘇云金桿菌的殺蟲(chóng)蛋白Bt基因或其他殺蟲(chóng)基因轉(zhuǎn)入到大豆基因組中,使得這些轉(zhuǎn)基因大豆能夠有效地預(yù)防害蟲(chóng)的發(fā)生。復(fù)合性狀的轉(zhuǎn)基因大豆就是把以上兩個(gè)或幾個(gè)基因同時(shí)整合到大豆中[10]。由于這些轉(zhuǎn)基因大豆比非轉(zhuǎn)基因大豆具有出油率高和價(jià)格便宜等諸多優(yōu)勢(shì),因此自1996年轉(zhuǎn)基因大豆商業(yè)化種植以來(lái),全球轉(zhuǎn)基因大豆的種植面積連年持續(xù)增加[12],而我國(guó)轉(zhuǎn)基因大豆尚處于前期研究階段,并沒(méi)有實(shí)際的商業(yè)種植[13]。
根據(jù)檢測(cè)原理的不同,目前常用的轉(zhuǎn)基因植物檢測(cè)技術(shù)主要有兩大類:一類為蛋白水平的檢測(cè)方法,如免疫試紙條法、蛋白質(zhì)芯片和酶聯(lián)免疫吸附法等[14];另一類為核酸水平上的鑒定方法,如PCR以及PCR相關(guān)的檢測(cè)技術(shù),還有核酸雜交和基因芯片等方法[15]。蛋白質(zhì)水平的檢測(cè)是基于所轉(zhuǎn)的目的基因在轉(zhuǎn)基因植株中得到了表達(dá),通過(guò)檢測(cè)這些蛋白的存在來(lái)確定轉(zhuǎn)基因。由于這些鑒定方法只適用于新鮮的和未加工過(guò)的轉(zhuǎn)基因材料,并且當(dāng)轉(zhuǎn)入的基因表達(dá)量低時(shí)也無(wú)法檢測(cè),因此這些方法并未得到廣泛采用。DNA水平上的檢測(cè)方法主要是基于PCR反應(yīng),但這些檢測(cè)方法都需要熱循環(huán)PCR儀,實(shí)驗(yàn)程序復(fù)雜并且檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng),難以滿足非實(shí)驗(yàn)室條件下的快速篩查和檢測(cè)的需求[16]。最近幾年出現(xiàn)了恒溫條件下的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù),其中研究較熱的一個(gè)技術(shù)就是環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)[17]。LAMP 檢 測(cè) 方法快速,能在恒溫65℃下完成整個(gè)反應(yīng)且實(shí)現(xiàn)了在反應(yīng)管中肉眼對(duì)反應(yīng)結(jié)果的判讀,已經(jīng)成功應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因大豆的檢測(cè),但仍然需要恒溫加熱設(shè)備[18]。
重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)(Recombinase polymerase amplification,RPA)是2006年 Piepenburg等[19]研發(fā)出的一種等溫?cái)U(kuò)增技術(shù),它能在37-42℃恒溫條件下快速完成數(shù)十億DNA擴(kuò)增[20]。RPA反應(yīng)體系中主要包括重組酶(uvsX)、單鏈結(jié)合蛋白(Gp32)和鏈置換DNA聚合酶Bsu,其反應(yīng)原理不同于體外DNA復(fù)制的PCR技術(shù),重組酶uvsX在常溫下就能打開(kāi)DNA雙鏈進(jìn)行變性,因此不需要熱循環(huán)PCR儀[21-22]。RPA反應(yīng)技術(shù)靈敏度高,反應(yīng)快速,并且通過(guò)試紙條可以直接進(jìn)行觀察,方法簡(jiǎn)便易行。因此,本文的目的是建立一個(gè)轉(zhuǎn)基因大豆的RPA快速檢測(cè)技術(shù),利用試劑條顯色反應(yīng)實(shí)現(xiàn)肉眼鑒定樣品中是否含有轉(zhuǎn)基因成分,并對(duì)日常接觸到的大豆食品和種植的大豆進(jìn)行初步應(yīng)用。
試驗(yàn)中所需的引物由金斯瑞生物科技有限公司合成并提供。待檢測(cè)的豆芽、新鮮毛豆和大豆植株是隨機(jī)從市場(chǎng)購(gòu)買或田間采集。作為陽(yáng)性對(duì)照的轉(zhuǎn)基因大豆,含有花椰菜花葉病毒CaMV35S啟動(dòng)子和根癌農(nóng)桿菌NOS終止子序列的轉(zhuǎn)基因質(zhì)粒載體pBinGFP2 DNA(50 ng/μL)由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)植保學(xué)院提供。
1.2.1 大豆材料基因組DNA提取 各種大豆材料的基因組DNA提取均采用“DNAsecure新型植物基因組DNA提取試劑盒 ”(天根,北京,貨號(hào)DP320),并按使用說(shuō)明書(shū)操作。
1.2.2 PCR擴(kuò)增和反應(yīng)產(chǎn)物的檢測(cè) PCR試劑盒購(gòu)自諾唯贊(Vazyme),貨號(hào)為P505-d1/d2/d3。50 μL 反應(yīng)體系中包括 25 μL 2×Phanta Max Buffer、1 μL dNTP Mix、1 μL Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase、2 μL DNA 模板,10 μmol/L 上下游引物各 2.0 μL。PCR 反應(yīng)程序?yàn)?:95℃ 預(yù)變性 3 min;95℃變性15 s,63℃退火 15 s,72℃延伸 30 s,35次循環(huán);72℃延伸5 min。反應(yīng)結(jié)束后取出PCR 管,對(duì)PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行2% 瓊脂糖電泳檢測(cè)。
1.2.3 RPA引物的設(shè)計(jì) 現(xiàn)有的轉(zhuǎn)基因作物中大都有花椰菜花葉病毒CaMV35S啟動(dòng)子和根癌農(nóng)桿菌NOS終止子[10],通過(guò)對(duì)這些保守DNA序列分析可以設(shè)計(jì)RPA引物。RPA引物長(zhǎng)度一般在30-35 nt,擴(kuò)增片段長(zhǎng)度最好在100-200 bp,利用Primer3軟件(http://primer3.ut.ee/),設(shè)計(jì)了5對(duì)RPA引物用作RPA試劑條引物的初步篩選(表1)。
表1 RPA試劑條檢測(cè)引物設(shè)計(jì)及序列
1.2.4 RPA試劑條引物和探針設(shè)計(jì) RPA反應(yīng)體系包括一對(duì)特異性引物和一條nfo探針,其中下游引物修飾有生物素B,nfo探針修飾有fluorescein isothiocyanate熒光素FITC。根據(jù)Nos終止子以及Nos163引物的序列,我們?cè)O(shè)計(jì)了Nos163的RPA引物和探針,序列見(jiàn)表2。如果反應(yīng)體系中的模板DNA為轉(zhuǎn)基因大豆基因組DNA,擴(kuò)增產(chǎn)物會(huì)含有生物素B和FITC,擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)毛細(xì)作用從試紙條的加樣點(diǎn)由下而上流動(dòng)時(shí),試紙條上會(huì)顯現(xiàn)control band 和test band兩條條帶。當(dāng)為非轉(zhuǎn)基因模板DNA或其他DNA時(shí),試紙條上只顯示control band一條帶。
1.2.5 RPA試劑條檢測(cè)反應(yīng) RPA試劑盒(TwistAmp nfo)和 Milenia Hybridtech 1 strips(no nfo kits)試紙條均購(gòu)自南京沃博生物科技有限公司,貨號(hào)分別為TANFO02KIT和MILENIA01。RPA反應(yīng)體系按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行混合,為了保證反應(yīng)同時(shí)進(jìn)行,2.5 μL 280 mmol/L醋酸鎂溶液應(yīng)該最后加在八連管的蓋子上,小心翻轉(zhuǎn)蓋上,然后上下顛倒八連管混勻,離心。整個(gè)操作過(guò)程要在冰上進(jìn)行。RPA反應(yīng)在39℃恒溫下反應(yīng)4 min后,取出反應(yīng)管進(jìn)行渦旋震蕩,點(diǎn)動(dòng)離心,再在39℃恒溫下反應(yīng)26 min,反應(yīng)結(jié)束后取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物滴加至試紙條檢測(cè)區(qū),再將95 μL試紙條檢測(cè)buffer加入到1.5 mL EP管中,最后將試紙條垂直放入試紙條檢測(cè)buffer中,以質(zhì)控線出現(xiàn)明顯條帶即可,3 min左右,待試紙條晾干后拍照。
表2 轉(zhuǎn)基因大豆的RPA試紙條引物和探針序列
為了篩選特異性且擴(kuò)增效率高的RPA檢測(cè)引物,我們首先利用常規(guī)PCR技術(shù)對(duì)5對(duì)RPA引物分別進(jìn)行擴(kuò)增,陽(yáng)性對(duì)照模板DNA為含有CaMV35S啟動(dòng)子和NOS終止子的質(zhì)粒載體pBinGFP2 DNA(50 ng/μL),陰性對(duì)照采用超純水。如圖1所示,引物35s266和35s157對(duì)pBinGFP2 DNA擴(kuò)增出兩條或兩條以上的條帶(3和9),但從水中也擴(kuò)增出條帶(4),說(shuō)明有污染。Nos183擴(kuò)增的產(chǎn)物條帶(1)較弱擴(kuò)增效率低,且陰性對(duì)照條帶有污染(2)。而Nos156和Nos163引物條帶清晰(5和7)且沒(méi)有污染(6和8),說(shuō)明用Nos156和Nos163引物擴(kuò)增DNA反應(yīng)特異性強(qiáng)能夠產(chǎn)生單一的條帶,且擴(kuò)增效率高,產(chǎn)物濃度高,因此選擇這2對(duì)引物進(jìn)行后續(xù)的RPA檢測(cè)。
圖1 五對(duì)RPA引物的常規(guī)PCR檢測(cè)
為了進(jìn)一步檢測(cè)引物Nos156和Nos163反應(yīng)的靈敏性,分別利用稀釋后不同濃度的質(zhì)粒pBinGFP2DNA作為模板進(jìn)行PCR反應(yīng),如圖2所示引物Nos163的PCR反應(yīng)比Nos156更為敏感,在相同template DNA濃度下,PCR條帶更為明顯,因此我們最終選擇Nos163引物用來(lái)設(shè)計(jì)RPA試劑條。
圖2 引物Nos156和Nos163的PCR靈敏度檢測(cè)
2.3.1 RPA檢測(cè)反應(yīng)體系的簡(jiǎn)單優(yōu)化
為了進(jìn)一步優(yōu)化RPA反應(yīng)體系,以質(zhì)粒載體pBinGFP2作為模板DNA進(jìn)行了不同溫度和反應(yīng)時(shí)間的試劑條檢測(cè),如圖3-A所示,RPA體系反應(yīng)溫度為25-45℃,但最合適的反應(yīng)溫度為大約40℃。反應(yīng)時(shí)間圖3-B所示從10 min-50 min都可以進(jìn)行,最適合的反應(yīng)時(shí)間大約為40 min。
圖3 RPA反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間的優(yōu)化
2.3.2 RPA體系與常規(guī)PCR靈敏度的比較 以轉(zhuǎn)基因大豆基因組DNA作為模板,反應(yīng)溫度為39℃,時(shí)間為40 min進(jìn)行RPA反應(yīng),實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖4-A所示隨著模板DNA濃度的降低,RPA條帶濃度逐漸減弱,當(dāng)模板DNA濃度從100 pg-100 ag 時(shí),RPA方法都能檢測(cè)出轉(zhuǎn)基因DNA。利用同樣濃度的轉(zhuǎn)基因大豆DNA進(jìn)行PCR反應(yīng),結(jié)果如圖4-B所示,只有DNA為1 ng時(shí)PCR才能檢測(cè)出轉(zhuǎn)基因DNA的存在。PCR和RPA方法比較說(shuō)明RPA反應(yīng)靈敏度更高,在模板DNA濃度微量時(shí)(< 1 ng)RPA檢測(cè)比PCR方法具有顯著的檢測(cè)優(yōu)勢(shì)。
為驗(yàn)證上述RPA技術(shù)的實(shí)用性,選取市場(chǎng)銷售的豆芽菜,新鮮毛豆夾以及田間采摘的大豆樣品共6種材料進(jìn)行檢測(cè),實(shí)驗(yàn)過(guò)程中以2株已確定轉(zhuǎn)基因的大豆作為陽(yáng)性對(duì)照和1株已知非轉(zhuǎn)基因大豆為陰性對(duì)照,結(jié)果(圖5-A)顯示,兩株轉(zhuǎn)基因大豆(Transgenic1和2)均顯示明顯的兩條帶,為陽(yáng)性,而非轉(zhuǎn)基因大豆(WT)只有一條帶,為陰性。所有的大豆樣品均為陰性,顯示為非轉(zhuǎn)基因,說(shuō)明南京周邊檢測(cè)到的市售大豆新鮮產(chǎn)品和種植的大豆沒(méi)有轉(zhuǎn)基因成分?,F(xiàn)有的轉(zhuǎn)基因大豆檢測(cè)技術(shù)中最常用的為PCR,為了驗(yàn)證RPA檢測(cè)體系的準(zhǔn)確性,我們利用這些樣品進(jìn)行PCR檢測(cè),結(jié)果(圖5-B)顯示,只有兩株轉(zhuǎn)基因大豆(Transgenic 1和Transgenic 2)顯示為陽(yáng)性,其他樣品均為陰性,此結(jié)果與RPA檢測(cè)相一致,進(jìn)一步證明RPA技術(shù)的可靠性。
圖4 RPA反應(yīng)體系與常規(guī)PCR靈敏度比較
圖5 RPA和PCR檢測(cè)豆芽菜和大豆樣品
轉(zhuǎn)基因大豆的大量進(jìn)口和使用,對(duì)于緩解我國(guó)大豆短缺的問(wèn)題具有重要意義,同時(shí)對(duì)進(jìn)口轉(zhuǎn)基因大豆的監(jiān)控提出新的挑戰(zhàn)。為了防止轉(zhuǎn)基因大豆國(guó)內(nèi)的非法種植和流通,因此迫切需要簡(jiǎn)便可行的轉(zhuǎn)基因大豆快速檢測(cè)方法。
現(xiàn)已建立的轉(zhuǎn)基因大豆檢測(cè)方法主要包括PCR和實(shí)時(shí)定量熒光PCR[25-26]。但這些方法都需要PCR儀或?qū)崟r(shí)定量熒光PCR儀以及瓊脂糖電泳,操作繁瑣,檢測(cè)過(guò)程長(zhǎng)達(dá)幾個(gè)小時(shí),不適合實(shí)時(shí)快速監(jiān)測(cè)。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法是近年來(lái)應(yīng)用較多的不依賴于復(fù)雜昂貴的儀器設(shè)備、簡(jiǎn)便快速DNA檢測(cè)方法,并已應(yīng)用于大豆的檢測(cè)[27]。但環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法需60-65℃等溫條件,并要設(shè)計(jì)4種引物。根據(jù)現(xiàn)有轉(zhuǎn)基因大豆檢測(cè)上的優(yōu)缺點(diǎn)和RPA技術(shù)不需要專門的儀器,常溫下能進(jìn)行目的基因特異性擴(kuò)增的優(yōu)勢(shì),本研究設(shè)計(jì)建立轉(zhuǎn)基因大豆的RPA試劑條快速檢測(cè)技術(shù),通過(guò)對(duì)不同濃度的轉(zhuǎn)基因大豆基因組DNA擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,該方法比常規(guī)PCR方法更靈敏,在微量的模板DNA濃度下(<1 ng),PCR無(wú)法檢測(cè)時(shí)RPA也能檢測(cè)到轉(zhuǎn)基因DNA的存在。同時(shí)利用此方法對(duì)市場(chǎng)隨機(jī)購(gòu)買的豆芽和毛豆樣品以及田間種植的大豆樣品進(jìn)行檢測(cè),未發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因大豆的存在,此結(jié)果和常規(guī)PCR檢測(cè)結(jié)果一致,進(jìn)一步證明了本體系的可靠性和準(zhǔn)確性。與環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法相比本方法具有無(wú)需恒溫加熱儀器的優(yōu)點(diǎn),RPA可以在25-45℃之間反應(yīng),簡(jiǎn)單的保溫杯或人體溫度甚至常溫就可以實(shí)現(xiàn)。同時(shí)RPA的引物設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單和PCR引物設(shè)計(jì)方法相似,無(wú)需復(fù)雜的分析,而環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法需要設(shè)計(jì)4種引物。總之,本文中的轉(zhuǎn)基因大豆RPA快速檢測(cè)方法具有常溫下反應(yīng)靈敏度高和結(jié)果可靠等優(yōu)勢(shì),可以用于國(guó)內(nèi)大豆的監(jiān)控。
本研究建立的轉(zhuǎn)基因大豆的RPA試劑條快速分子檢測(cè)方法,簡(jiǎn)便易操作,無(wú)需PCR和電泳儀等昂貴的實(shí)驗(yàn)器材,檢測(cè)周期短,試劑條結(jié)果肉眼可見(jiàn)。應(yīng)用此方法初步檢測(cè)南京市田間和市場(chǎng)大豆,在待檢測(cè)的樣品中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因成分。