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        原花青素B2對(duì)D-半乳糖模型小鼠腸道菌群的影響

        2019-06-04 02:54:42訾雨歌吳其國(guó)尹志婷周一鳴周小理
        食品科學(xué) 2019年9期
        關(guān)鍵詞:丁酸花青素菌群

        訾雨歌,徐 越,肖 瀛*,吳其國(guó),尹志婷,周一鳴,周小理

        (上海應(yīng)用技術(shù)大學(xué)香料香精技術(shù)與工程學(xué)院,上海 201418)

        機(jī)體生長(zhǎng)發(fā)育到成熟階段后,其組織器官和生理功能就會(huì)隨年齡的增長(zhǎng)出現(xiàn)衰退,機(jī)體出現(xiàn)全身性退化性行為的現(xiàn)象稱(chēng)為衰老[1]。衰老是生命體發(fā)展過(guò)程的必經(jīng)階段,不可抗拒,其會(huì)從生理和心理多方面降低人的生活質(zhì)量。當(dāng)人們進(jìn)入到衰老期,腸道的屏障、吸收及免疫功能都會(huì)發(fā)生改變,加上各種外因(飲食習(xí)慣改變、疾病藥物的使用、營(yíng)養(yǎng)攝入平衡等)的影響[2-4],可導(dǎo)致腸道微生態(tài)平衡的破壞。人體腸道微生物基因是最為復(fù)雜的,其中棲息著復(fù)雜且數(shù)量龐大的腸道菌群,細(xì)菌的總數(shù)比人體細(xì)胞總數(shù)多10 倍,其種類(lèi)有100 種以上[5]。菌群影響著營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收與代謝,在調(diào)節(jié)人體免疫和預(yù)防疾病等方面顯著影響著機(jī)體健康[6]。隨著年齡的增長(zhǎng),人體腸道菌群會(huì)發(fā)生質(zhì)和量的變化,導(dǎo)致人體菌群出現(xiàn)老化的現(xiàn)象。

        原花青素B2作為一種高效的天然抗氧化劑,不僅可以清除體內(nèi)過(guò)多的自由基,還能抑制脂質(zhì)過(guò)氧化的發(fā)生,發(fā)揮維持體內(nèi)自由基與抗氧化酶之間穩(wěn)態(tài)的作用,從而預(yù)防自由基引起的相關(guān)疾病[7]。不可否認(rèn)的是,原花青素在體內(nèi)的代謝吸收對(duì)其功能的發(fā)揮至關(guān)重要[8]。原花青素的消化吸收主要發(fā)生在小腸部位,但其利用率較低[9],未吸收的多酚可進(jìn)入結(jié)腸影響腸道菌群結(jié)構(gòu)。原花青素B2影響腸道微生物可能是發(fā)揮其功能活性作用的重要途徑之一。因此,本研究采用D-半乳糖誘導(dǎo)衰老模型小鼠,通過(guò)Illumina MiSeq高通量測(cè)序平臺(tái)對(duì)小鼠糞便樣本中細(xì)菌16S rRNA V4區(qū)進(jìn)行定性分析,解析衰老小鼠腸道菌群的變化,探索原花青素B2抑制小鼠衰老與腸道菌群改變間的關(guān)系及可能機(jī)理。

        1 材料與方法

        1.1 動(dòng)物、材料與試劑

        雄性4 周齡C 5 7 B L/6小鼠3 0 只,體質(zhì)量為(15f2)g,購(gòu)買(mǎi)于上海靈暢生物科技公司(許可證號(hào):SCXK(滬)2013-0018)。將小鼠飼養(yǎng)在室溫為(22f2)℃、12 h晝夜交替的動(dòng)物房?jī)?nèi),自由攝食和飲水,1 周后隨機(jī)分為3 組,每組10 只,分2 籠飼養(yǎng),分別為對(duì)照組、衰老組、原花青素B2組。實(shí)驗(yàn)周期為7 周,每天按照0.1 mL/10 g的劑量給衰老組與原花青素組小鼠皮下(頸部)注射質(zhì)量分?jǐn)?shù)5% D-半乳糖,對(duì)照組小鼠注射等劑量的生理鹽水,并根據(jù)小鼠體質(zhì)量的變化調(diào)整劑量。對(duì)照組與衰老組小鼠飼喂標(biāo)準(zhǔn)飼料AIN93G,原花青素組小鼠飼喂原花青素B2干預(yù)飼料(AIN93G+質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.2%原花青素B2)。

        D-半乳糖、肝素鈉(分析純) 上海阿拉丁生化科技公司;原花青素B2(純度≥90%) 上海同田生物技術(shù)有限公司;無(wú)水乙醇、乙醚(分析純)國(guó)藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑公司;總抗氧化能力(total antioxidant capacity,T-AOC)試劑盒、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)試劑盒、過(guò)氧化氫酶(catalase,CAT)試劑盒、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-PX)試劑盒、丙二醛(lipid peroxidation,MDA)試劑盒 南京建成生物研究所;QIAamp DNA Stool Mini Kit 德國(guó)Qiagen公司;熒光定量試劑SYBR Premix Ex Taq、DNA純化試劑盒、D2000 DNA Marker 天根生化科技公司。

        1.2 儀器與設(shè)備

        DF-1156型低溫冰箱 日本三洋電機(jī)公司;3k-18型離心機(jī) 德國(guó)Sigma公司;PURELAB Classic型超純水機(jī) 英國(guó)ELGA公司;GeneAmp?9700型聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)儀 美國(guó)ABI公司;TQ8040氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(gas chromatography-mass spectrometer,GC-MS) 日本島津公司。

        1.3 方法

        1.3.1 樣品采集

        實(shí)驗(yàn)最后一周早晨,采集小鼠的新鮮糞便約0.1 g于滅菌試管中,-80 ℃凍存待測(cè);另取0.2 g置于滅菌試管中凍存待測(cè)。乙醚麻醉后頸椎脫臼法將小鼠處死并迅速打開(kāi)腹腔,取出十二指腸和結(jié)腸,在冰浴條件下用生理鹽水勻漿,制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%組織勻漿液,4 ℃、5 000 r/min離心10 min取上清液,保存于-80 ℃待測(cè)。

        1.3.2 抗氧化指標(biāo)測(cè)定

        取1.3.1節(jié)勻漿好的上清液,按照試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定T-AOC、SOD及CAT活力和MDA含量。

        1.3.3 糞便DNA提取及測(cè)序

        稱(chēng)取200 mg糞便于2 mL離心管中,按試劑盒說(shuō)明書(shū)提取DNA,將DNA樣品送至上海美吉生物科技公司進(jìn)行16S rDNA測(cè)序。

        1.3.4 SCFAs含量測(cè)定

        稱(chēng)取0.1 g糞便樣品置于2 mL離心管中,加入500 μL飽和NaCl溶液,打碎均質(zhì)至無(wú)明顯塊狀物后加入20 μL硫酸溶液(由0.5 mL濃硫酸和5 mL水混合配制)酸化,漩渦振蕩30 s,加入800 μL無(wú)水乙醚以萃取短鏈脂肪酸(short-chain fatty acids,SCFAs)。將溶液漩渦振蕩30 s,14 000 r/min離心15 min后吸取上清液,將上清液加到裝有0.25 g無(wú)水硫酸鈉的2 mL離心管中,再次以同樣條件離心,以除去上清液中殘留的水分,轉(zhuǎn)入GC樣品瓶。

        GC條件:載氣為He;分流比為10∶1;流速為2.0 mL/min;升溫程序?yàn)?.5 ℃/min從100 ℃上升至140 ℃,保持4 min;60 ℃/min升溫至200 ℃。柱箱溫度100 ℃,進(jìn)樣口溫度240 ℃,離子源溫度220 ℃,接口溫度250 ℃,溶劑延遲時(shí)間0.5 min。MS采集時(shí)間1.5~9.5 min,采集方式為Q3 Scan,m/z范圍是20.00~300.00,進(jìn)樣量為1 μL,每個(gè)樣品檢測(cè)時(shí)間均為23.58 min。

        1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

        數(shù)據(jù)采用fs表示,并采用SPSS 11.5軟件中的方差分析方法進(jìn)行顯著性分析,P<0.05為差異顯著。對(duì)Illumina MiSeq測(cè)序的質(zhì)量進(jìn)行質(zhì)控和過(guò)濾,區(qū)分樣本后進(jìn)行運(yùn)算分類(lèi)單位(operational taxonomic unit,OTU)聚類(lèi)分析和物種分類(lèi)學(xué)分析,基于OTU對(duì)測(cè)序進(jìn)行多種多樣性指數(shù)分析以及深度檢測(cè);基于分類(lèi)學(xué)信息在各個(gè)分類(lèi)水平上進(jìn)行群落結(jié)構(gòu)的統(tǒng)計(jì)分析。在上述分析的基礎(chǔ)上,對(duì)多樣本的群落組成和系統(tǒng)發(fā)育信息進(jìn)行多元分析和差異顯著性檢驗(yàn)等一系列深入的統(tǒng)計(jì)學(xué)和可視化分析。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 原花青素B2對(duì)小鼠體質(zhì)量及抗氧化指標(biāo)的影響

        在一定程度上,小鼠體質(zhì)量變化能反映小鼠的生長(zhǎng)發(fā)育情況[10]。如圖1所示,前3 周小鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)較快,從第4周開(kāi)始小鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)的速度下降;與對(duì)照組小鼠比較,衰老組小鼠體質(zhì)量有所減輕,原花青素B2組小鼠體質(zhì)量有所增大,這表明D-半乳糖抑制了小鼠正常生長(zhǎng),原花青素B2對(duì)D-半乳糖造成衰老小鼠體質(zhì)量降低有所改善。

        圖1 原花青素B2對(duì)小鼠體質(zhì)量的影響Fig.1 Effect of procyanidin B2 on body mass in aging mice

        表1 原花青素B2對(duì)衰老小鼠抗氧化指標(biāo)的影響Table1 Effect of procyanidin B2 on antioxidant indices of aging mice

        從表1可知,與對(duì)照組比較,衰老小鼠的十二指腸中SOD、CAT活力和T-AOC與對(duì)照組沒(méi)有顯著差異,但均有下降趨勢(shì);結(jié)腸中T-AOC和SOD活力同樣與對(duì)照組差異不顯著,但CAT活力顯著下降。衰老小鼠十二指腸與結(jié)腸組織的MDA含量均顯著上升(P<0.05)。與衰老組比較,原花青素組小鼠十二指腸中T-AOC、SOD和CAT活力都顯著升高(P<0.05);在結(jié)腸組織中SOD和CAT活力顯著上升(P<0.05),但T-AOC差異不顯著。這表明原花青素B2可以提高衰老小鼠十二指腸和結(jié)腸組織的抗氧化能力,清除體內(nèi)過(guò)多的自由基,抑制脂質(zhì)過(guò)氧化,降低MDA 含量。

        2.2 原花青素B2對(duì)小鼠腸道菌群多樣性的影響

        圖2 小鼠腸道微生物多樣性指數(shù)Fig.2 Diversity index of gut microf l ora in mice

        為探究3 組小鼠腸道菌群之間的相關(guān)性,本研究采用RDP classif i er貝葉斯算法計(jì)算在97%相似水平的OTU數(shù)量,發(fā)現(xiàn)對(duì)照組的OTU數(shù)量為229 個(gè),衰老組的OTU數(shù)量為233 個(gè),原花青素的OTU數(shù)量為230 個(gè)。3 組共有的OTU數(shù)為212 個(gè),對(duì)照組與衰老組共有但原花青素B2組沒(méi)有的OTU數(shù)量是5 個(gè),衰老組與原花青素B2組共有但對(duì)照組沒(méi)有的OTU數(shù)量是11 個(gè)。如圖2所示,衰老組的Alpha多樣性Shannon指數(shù)極顯著高于原花青素B2組(P<0.01)。

        圖3 小鼠腸道微生物多樣性的主成分分析Fig.3 Principal component analysis of the diversity of gut microf l ora in mice

        如圖3所示,基于OTU水平利用主成分分析進(jìn)行分類(lèi)。衰老組樣本與對(duì)照組樣本相距較遠(yuǎn),表明D-半乳糖對(duì)小鼠腸道菌群組成及結(jié)構(gòu)影響較明顯。原花青素B2組與對(duì)照組相距較近,表明原花青素B2干預(yù)的小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)與對(duì)照組相似。

        圖4 小鼠腸道菌群門(mén)水平相對(duì)豐度Fig.4 Abundance of dominant intestinal bacterial phyla in mice

        如圖4所示,對(duì)照組、衰老組、原花青素B2組小鼠的腸道菌群門(mén)水平都以Bacteroidetes和Firmicutes為主,其相對(duì)豐度分別為63.78%和22.67%、44.19%和44.81%、60.34%和33.96%。

        如圖5所示,3 組小鼠的腸道菌群屬水平組成如下:對(duì)照組小鼠的糞便中包含norank-f-Bacteroidales-s24-7、Bifidobacterium、Bacteroides、Lactobacillus等多個(gè)屬,還有11.22%的其他菌屬。衰老組小鼠的糞便中主要包含norank-f-Bacteroidales-s24-7、Ruminiclostriduim、Bacteroides、Bifidobacterium、Blautia、unclassified-Lachnospiraeae等菌屬。原花青素B2組樣品主要包括norank-f-Bacteroidales-s24-7、Bacteroides、Bif i dobacterium、Blautia、unclassif i ed-Lachnospiraeae等菌屬。

        圖5 小鼠腸道菌群屬水平相對(duì)豐度Fig.5 Abundance of dominant intestinal bacterial genus in mice

        2.3 原花青素B2對(duì)小鼠腸道差異菌群的影響

        圖6 原花青素B2對(duì)小鼠腸道B/F值的影響Fig.6 Effect of procyanidins B2 on B/F ratio in mice

        如圖6所示,在門(mén)水平上,與對(duì)照組相比,衰老組小鼠的B/F值(擬桿菌門(mén)與厚壁桿菌門(mén)數(shù)量比值)顯著降低。與衰老組相比,原花青素B2組的B/F值顯著上升。進(jìn)一步比較3 組小鼠腸道菌群的差異性,分析差異性菌屬,如圖7所示,發(fā)現(xiàn)7 種存在顯著差異的菌屬:norank-f-Bacteroidales-s24-7、Bacteroides、Blautia、unclassified-Lachnospiraeae、Ruminiclostridium、Lachnospiraeae-NK4A136、Roseburia。相比于對(duì)照組,衰老組小鼠norank-f-Bacteroidales-s24-7的相對(duì)豐度顯著降低,而其他菌屬的相對(duì)豐度顯著上升。與衰老組相比,原花青素B2組小鼠中norank-f-Bacteroidales-s24-7、Roseburia、Lachnospiraeae-NK4A136和Bacteroides菌屬的相對(duì)豐度顯著上升,而B(niǎo)lautia、unclassified-Lachnospiraeae和Ruminiclostridium的相對(duì)豐度顯著降低。

        圖7 小鼠腸道微生物差異性菌屬Fig.7 Differential genus of gut microf l ora in mice

        2.4 原花青素B2對(duì)小鼠糞便中SCFAs含量的影響

        表2 原花青素B2對(duì)小鼠糞便中SCFAs含量的影響Table2 Effect of procyanidin B2 on SCFAs contents in feces of mice

        如表2所示,衰老組乙酸、丙酸、丁酸、總酸的含量均顯著低于對(duì)照組(P<0.05),在經(jīng)過(guò)原花青素B2干預(yù)后,小鼠糞便中各SCFAs含量顯著高于對(duì)照組與衰老組,這表明原花青素B2可調(diào)節(jié)產(chǎn)SCFAs菌群的豐度。

        3 討 論

        本研究發(fā)現(xiàn)原花青素干預(yù)的衰老模型小鼠腸道的T-AOC和SOD、CAT活力都顯著增加。當(dāng)機(jī)體發(fā)生衰老時(shí),體內(nèi)自由基動(dòng)態(tài)平衡失衡,會(huì)發(fā)生如脂質(zhì)過(guò)氧化、蛋白質(zhì)氧化、DNA突變等現(xiàn)象,從而產(chǎn)生氧化應(yīng)激,導(dǎo)致相關(guān)疾病的發(fā)生[11-13]。原花青素B2具有多個(gè)酚羥基,能有效地清除衰老小鼠體內(nèi)過(guò)多的超氧自由基、過(guò)氧化氫及過(guò)氧化物,抑制脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物堆積,從而延緩機(jī)體衰老進(jìn)程。

        腸道菌群是由種類(lèi)繁多的大量微生物組成的龐大復(fù)雜的生態(tài)系統(tǒng),與宿主的生長(zhǎng)、發(fā)育、物質(zhì)代謝和衰老有著密切的關(guān)系[14]。但如果機(jī)體內(nèi)的自由基動(dòng)態(tài)平衡失調(diào),過(guò)量的自由基會(huì)引起腸黏膜損傷,使機(jī)體遭受致病菌侵染[15-16]。本研究發(fā)現(xiàn)飼喂原花青素飼料后,小鼠腸道優(yōu)勢(shì)菌群為Bacteroidetes和Firmicutes這兩個(gè)細(xì)菌門(mén),同時(shí)B/F值也顯著上升,與Bezirtzoglou等[17]的研究結(jié)果一致。Bacteroidetes可以分解植物中的糖類(lèi)物質(zhì),使其轉(zhuǎn)化為對(duì)身體有益的產(chǎn)物[18-19]。同時(shí),在原花青素干預(yù)后,衰老小鼠體內(nèi)Bacteroides的相對(duì)豐度顯著提高,與對(duì)照組沒(méi)有顯著差異,這與Ley等[20-21]的研究結(jié)果一致,表明原花青素B2可調(diào)節(jié)衰老小鼠腸道中Bacteroidetes和Firmicutes的相對(duì)豐度,調(diào)整腸道菌群結(jié)構(gòu),從而延緩衰老進(jìn)程。

        本研究發(fā)現(xiàn)原花青素B2干預(yù)的衰老模型小鼠Roseburia和Lachnospiracea屬的相對(duì)豐度均顯著上升,其中Roseburia是一類(lèi)在結(jié)腸代謝產(chǎn)生丁酸的革蘭氏陽(yáng)性菌,其可以發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)生乳酸及少量乙酸[22]。據(jù)報(bào)道,身體虛弱的老年人[23]、結(jié)直腸癌患者[24]以及肝硬化患者[25]的糞便中丁酸鹽產(chǎn)生菌顯著減少。王芳[25]通過(guò)Illumina MiSeq測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)百歲老人腸道中球狀梭菌類(lèi)群的Roseburia屬相對(duì)豐度顯著增加,Zhao Liang等[26]也得到同樣的結(jié)果。unclassif i ed-Lachnospiraeae是厚壁菌門(mén)中產(chǎn)生丁酸鹽的重要類(lèi)群,丁酸被證實(shí)能夠減輕腸炎對(duì)黏膜的損傷[27],并且能夠緩解衰老導(dǎo)致的腸道炎癥[28-30]。原花青素B2干預(yù)后,衰老小鼠體內(nèi)SCFAs含量顯著上升。SCFAs尤其是丁酸能通過(guò)影響白細(xì)胞黏附分子的表達(dá)而起到抗炎作用,同時(shí),SCFAs可保護(hù)黏膜細(xì)胞的正常功能,減少有毒物質(zhì)的吸收,增加細(xì)胞活性,延緩衰老[31-33]。原花青素可促進(jìn)小鼠腸道代謝產(chǎn)生SCFAs,調(diào)節(jié)腸道pH值,維持腸道內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定,進(jìn)而改善衰老機(jī)體腸道菌群的平衡狀態(tài),具有延緩衰老的作用。

        本研究結(jié)果表明原花青素B2可以增強(qiáng)衰老小鼠腸道抗氧化活性,調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu),一定程度上增加了產(chǎn)生丁酸類(lèi)有益菌的相對(duì)豐度,促進(jìn)SCFAs產(chǎn)生,維持腸道平衡,進(jìn)而延緩衰老進(jìn)程。

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