訾雨歌，徐 越，肖 瀛*，吳其國，尹志婷，周一鳴，周小理

（上海應(yīng)用技術(shù)大學(xué)香料香精技術(shù)與工程學(xué)院，上海 201418）

機(jī)體生長發(fā)育到成熟階段后，其組織器官和生理功能就會隨年齡的增長出現(xiàn)衰退，機(jī)體出現(xiàn)全身性退化性行為的現(xiàn)象稱為衰老[1]。衰老是生命體發(fā)展過程的必經(jīng)階段，不可抗拒，其會從生理和心理多方面降低人的生活質(zhì)量。當(dāng)人們進(jìn)入到衰老期，腸道的屏障、吸收及免疫功能都會發(fā)生改變，加上各種外因（飲食習(xí)慣改變、疾病藥物的使用、營養(yǎng)攝入平衡等）的影響[2-4]，可導(dǎo)致腸道微生態(tài)平衡的破壞。人體腸道微生物基因是最為復(fù)雜的，其中棲息著復(fù)雜且數(shù)量龐大的腸道菌群，細(xì)菌的總數(shù)比人體細(xì)胞總數(shù)多10 倍，其種類有100 種以上[5]。菌群影響著營養(yǎng)物質(zhì)吸收與代謝，在調(diào)節(jié)人體免疫和預(yù)防疾病等方面顯著影響著機(jī)體健康[6]。隨著年齡的增長，人體腸道菌群會發(fā)生質(zhì)和量的變化，導(dǎo)致人體菌群出現(xiàn)老化的現(xiàn)象。

原花青素B2作為一種高效的天然抗氧化劑，不僅可以清除體內(nèi)過多的自由基，還能抑制脂質(zhì)過氧化的發(fā)生，發(fā)揮維持體內(nèi)自由基與抗氧化酶之間穩(wěn)態(tài)的作用，從而預(yù)防自由基引起的相關(guān)疾病[7]。不可否認(rèn)的是，原花青素在體內(nèi)的代謝吸收對其功能的發(fā)揮至關(guān)重要[8]。原花青素的消化吸收主要發(fā)生在小腸部位，但其利用率較低[9]，未吸收的多酚可進(jìn)入結(jié)腸影響腸道菌群結(jié)構(gòu)。原花青素B2影響腸道微生物可能是發(fā)揮其功能活性作用的重要途徑之一。因此，本研究采用D-半乳糖誘導(dǎo)衰老模型小鼠，通過Illumina MiSeq高通量測序平臺對小鼠糞便樣本中細(xì)菌16S rRNA V4區(qū)進(jìn)行定性分析，解析衰老小鼠腸道菌群的變化，探索原花青素B2抑制小鼠衰老與腸道菌群改變間的關(guān)系及可能機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

雄性4 周齡C 5 7 B L/6小鼠3 0 只，體質(zhì)量為（15f2）g，購買于上海靈暢生物科技公司（許可證號：SCXK（滬）2013-0018）。將小鼠飼養(yǎng)在室溫為（22f2）℃、12 h晝夜交替的動物房內(nèi)，自由攝食和飲水，1 周后隨機(jī)分為3 組，每組10 只，分2 籠飼養(yǎng)，分別為對照組、衰老組、原花青素B2組。實驗周期為7 周，每天按照0.1 mL/10 g的劑量給衰老組與原花青素組小鼠皮下（頸部）注射質(zhì)量分?jǐn)?shù)5% D-半乳糖，對照組小鼠注射等劑量的生理鹽水，并根據(jù)小鼠體質(zhì)量的變化調(diào)整劑量。對照組與衰老組小鼠飼喂標(biāo)準(zhǔn)飼料AIN93G，原花青素組小鼠飼喂原花青素B2干預(yù)飼料（AIN93G＋質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.2%原花青素B2）。

D-半乳糖、肝素鈉（分析純） 上海阿拉丁生化科技公司；原花青素B2（純度≥90%） 上海同田生物技術(shù)有限公司；無水乙醇、乙醚（分析純）國藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑公司；總抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）試劑盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒、過氧化氫酶（catalase，CAT）試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-PX）試劑盒、丙二醛（lipid peroxidation，MDA）試劑盒 南京建成生物研究所；QIAamp DNA Stool Mini Kit 德國Qiagen公司；熒光定量試劑SYBR Premix Ex Taq、DNA純化試劑盒、D2000 DNA Marker 天根生化科技公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DF-1156型低溫冰箱 日本三洋電機(jī)公司；3k-18型離心機(jī) 德國Sigma公司；PURELAB Classic型超純水機(jī) 英國ELGA公司；GeneAmp?9700型聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀 美國ABI公司；TQ8040氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS） 日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品采集

實驗最后一周早晨，采集小鼠的新鮮糞便約0.1 g于滅菌試管中，－80 ℃凍存待測；另取0.2 g置于滅菌試管中凍存待測。乙醚麻醉后頸椎脫臼法將小鼠處死并迅速打開腹腔，取出十二指腸和結(jié)腸，在冰浴條件下用生理鹽水勻漿，制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%組織勻漿液，4 ℃、5 000 r/min離心10 min取上清液，保存于－80 ℃待測。

1.3.2 抗氧化指標(biāo)測定

取1.3.1節(jié)勻漿好的上清液，按照試劑盒說明書測定T-AOC、SOD及CAT活力和MDA含量。

1.3.3 糞便DNA提取及測序

稱取200 mg糞便于2 mL離心管中，按試劑盒說明書提取DNA，將DNA樣品送至上海美吉生物科技公司進(jìn)行16S rDNA測序。

1.3.4 SCFAs含量測定

稱取0.1 g糞便樣品置于2 mL離心管中，加入500 μL飽和NaCl溶液，打碎均質(zhì)至無明顯塊狀物后加入20 μL硫酸溶液（由0.5 mL濃硫酸和5 mL水混合配制）酸化，漩渦振蕩30 s，加入800 μL無水乙醚以萃取短鏈脂肪酸（short-chain fatty acids，SCFAs）。將溶液漩渦振蕩30 s，14 000 r/min離心15 min后吸取上清液，將上清液加到裝有0.25 g無水硫酸鈉的2 mL離心管中，再次以同樣條件離心，以除去上清液中殘留的水分，轉(zhuǎn)入GC樣品瓶。

GC條件：載氣為He；分流比為10∶1；流速為2.0 mL/min；升溫程序為7.5 ℃/min從100 ℃上升至140 ℃，保持4 min；60 ℃/min升溫至200 ℃。柱箱溫度100 ℃，進(jìn)樣口溫度240 ℃，離子源溫度220 ℃，接口溫度250 ℃，溶劑延遲時間0.5 min。MS采集時間1.5～9.5 min，采集方式為Q3 Scan，m/z范圍是20.00～300.00，進(jìn)樣量為1 μL，每個樣品檢測時間均為23.58 min。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

數(shù)據(jù)采用fs表示，并采用SPSS 11.5軟件中的方差分析方法進(jìn)行顯著性分析，P＜0.05為差異顯著。對Illumina MiSeq測序的質(zhì)量進(jìn)行質(zhì)控和過濾，區(qū)分樣本后進(jìn)行運算分類單位（operational taxonomic unit，OTU）聚類分析和物種分類學(xué)分析，基于OTU對測序進(jìn)行多種多樣性指數(shù)分析以及深度檢測；基于分類學(xué)信息在各個分類水平上進(jìn)行群落結(jié)構(gòu)的統(tǒng)計分析。在上述分析的基礎(chǔ)上，對多樣本的群落組成和系統(tǒng)發(fā)育信息進(jìn)行多元分析和差異顯著性檢驗等一系列深入的統(tǒng)計學(xué)和可視化分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 原花青素B2對小鼠體質(zhì)量及抗氧化指標(biāo)的影響

在一定程度上，小鼠體質(zhì)量變化能反映小鼠的生長發(fā)育情況[10]。如圖1所示，前3 周小鼠體質(zhì)量增長較快，從第4周開始小鼠體質(zhì)量增長的速度下降；與對照組小鼠比較，衰老組小鼠體質(zhì)量有所減輕，原花青素B2組小鼠體質(zhì)量有所增大，這表明D-半乳糖抑制了小鼠正常生長，原花青素B2對D-半乳糖造成衰老小鼠體質(zhì)量降低有所改善。

圖1 原花青素B2對小鼠體質(zhì)量的影響Fig.1 Effect of procyanidin B2 on body mass in aging mice

表1 原花青素B2對衰老小鼠抗氧化指標(biāo)的影響Table1 Effect of procyanidin B2 on antioxidant indices of aging mice

從表1可知，與對照組比較，衰老小鼠的十二指腸中SOD、CAT活力和T-AOC與對照組沒有顯著差異，但均有下降趨勢；結(jié)腸中T-AOC和SOD活力同樣與對照組差異不顯著，但CAT活力顯著下降。衰老小鼠十二指腸與結(jié)腸組織的MDA含量均顯著上升（P＜0.05）。與衰老組比較，原花青素組小鼠十二指腸中T-AOC、SOD和CAT活力都顯著升高（P＜0.05）；在結(jié)腸組織中SOD和CAT活力顯著上升（P＜0.05），但T-AOC差異不顯著。這表明原花青素B2可以提高衰老小鼠十二指腸和結(jié)腸組織的抗氧化能力，清除體內(nèi)過多的自由基，抑制脂質(zhì)過氧化，降低MDA 含量。

2.2 原花青素B2對小鼠腸道菌群多樣性的影響

圖2 小鼠腸道微生物多樣性指數(shù)Fig.2 Diversity index of gut microf l ora in mice

為探究3 組小鼠腸道菌群之間的相關(guān)性，本研究采用RDP classif i er貝葉斯算法計算在97%相似水平的OTU數(shù)量，發(fā)現(xiàn)對照組的OTU數(shù)量為229 個，衰老組的OTU數(shù)量為233 個，原花青素的OTU數(shù)量為230 個。3 組共有的OTU數(shù)為212 個，對照組與衰老組共有但原花青素B2組沒有的OTU數(shù)量是5 個，衰老組與原花青素B2組共有但對照組沒有的OTU數(shù)量是11 個。如圖2所示，衰老組的Alpha多樣性Shannon指數(shù)極顯著高于原花青素B2組（P＜0.01）。

圖3 小鼠腸道微生物多樣性的主成分分析Fig.3 Principal component analysis of the diversity of gut microf l ora in mice

如圖3所示，基于OTU水平利用主成分分析進(jìn)行分類。衰老組樣本與對照組樣本相距較遠(yuǎn)，表明D-半乳糖對小鼠腸道菌群組成及結(jié)構(gòu)影響較明顯。原花青素B2組與對照組相距較近，表明原花青素B2干預(yù)的小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)與對照組相似。

圖4 小鼠腸道菌群門水平相對豐度Fig.4 Abundance of dominant intestinal bacterial phyla in mice

如圖4所示，對照組、衰老組、原花青素B2組小鼠的腸道菌群門水平都以Bacteroidetes和Firmicutes為主，其相對豐度分別為63.78%和22.67%、44.19%和44.81%、60.34%和33.96%。

如圖5所示，3 組小鼠的腸道菌群屬水平組成如下：對照組小鼠的糞便中包含norank-f-Bacteroidales-s24-7、Bifidobacterium、Bacteroides、Lactobacillus等多個屬，還有11.22%的其他菌屬。衰老組小鼠的糞便中主要包含norank-f-Bacteroidales-s24-7、Ruminiclostriduim、Bacteroides、Bifidobacterium、Blautia、unclassified-Lachnospiraeae等菌屬。原花青素B2組樣品主要包括norank-f-Bacteroidales-s24-7、Bacteroides、Bif i dobacterium、Blautia、unclassif i ed-Lachnospiraeae等菌屬。

圖5 小鼠腸道菌群屬水平相對豐度Fig.5 Abundance of dominant intestinal bacterial genus in mice

2.3 原花青素B2對小鼠腸道差異菌群的影響

圖6 原花青素B2對小鼠腸道B/F值的影響Fig.6 Effect of procyanidins B2 on B/F ratio in mice

如圖6所示，在門水平上，與對照組相比，衰老組小鼠的B/F值（擬桿菌門與厚壁桿菌門數(shù)量比值）顯著降低。與衰老組相比，原花青素B2組的B/F值顯著上升。進(jìn)一步比較3 組小鼠腸道菌群的差異性，分析差異性菌屬，如圖7所示，發(fā)現(xiàn)7 種存在顯著差異的菌屬：norank-f-Bacteroidales-s24-7、Bacteroides、Blautia、unclassified-Lachnospiraeae、Ruminiclostridium、Lachnospiraeae-NK4A136、Roseburia。相比于對照組，衰老組小鼠norank-f-Bacteroidales-s24-7的相對豐度顯著降低，而其他菌屬的相對豐度顯著上升。與衰老組相比，原花青素B2組小鼠中norank-f-Bacteroidales-s24-7、Roseburia、Lachnospiraeae-NK4A136和Bacteroides菌屬的相對豐度顯著上升，而Blautia、unclassified-Lachnospiraeae和Ruminiclostridium的相對豐度顯著降低。

圖7 小鼠腸道微生物差異性菌屬Fig.7 Differential genus of gut microf l ora in mice

2.4 原花青素B2對小鼠糞便中SCFAs含量的影響

表2 原花青素B2對小鼠糞便中SCFAs含量的影響Table2 Effect of procyanidin B2 on SCFAs contents in feces of mice

如表2所示，衰老組乙酸、丙酸、丁酸、總酸的含量均顯著低于對照組（P＜0.05），在經(jīng)過原花青素B2干預(yù)后，小鼠糞便中各SCFAs含量顯著高于對照組與衰老組，這表明原花青素B2可調(diào)節(jié)產(chǎn)SCFAs菌群的豐度。

3 討 論

本研究發(fā)現(xiàn)原花青素干預(yù)的衰老模型小鼠腸道的T-AOC和SOD、CAT活力都顯著增加。當(dāng)機(jī)體發(fā)生衰老時，體內(nèi)自由基動態(tài)平衡失衡，會發(fā)生如脂質(zhì)過氧化、蛋白質(zhì)氧化、DNA突變等現(xiàn)象，從而產(chǎn)生氧化應(yīng)激，導(dǎo)致相關(guān)疾病的發(fā)生[11-13]。原花青素B2具有多個酚羥基，能有效地清除衰老小鼠體內(nèi)過多的超氧自由基、過氧化氫及過氧化物，抑制脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物堆積，從而延緩機(jī)體衰老進(jìn)程。

腸道菌群是由種類繁多的大量微生物組成的龐大復(fù)雜的生態(tài)系統(tǒng)，與宿主的生長、發(fā)育、物質(zhì)代謝和衰老有著密切的關(guān)系[14]。但如果機(jī)體內(nèi)的自由基動態(tài)平衡失調(diào)，過量的自由基會引起腸黏膜損傷，使機(jī)體遭受致病菌侵染[15-16]。本研究發(fā)現(xiàn)飼喂原花青素飼料后，小鼠腸道優(yōu)勢菌群為Bacteroidetes和Firmicutes這兩個細(xì)菌門，同時B/F值也顯著上升，與Bezirtzoglou等[17]的研究結(jié)果一致。Bacteroidetes可以分解植物中的糖類物質(zhì)，使其轉(zhuǎn)化為對身體有益的產(chǎn)物[18-19]。同時，在原花青素干預(yù)后，衰老小鼠體內(nèi)Bacteroides的相對豐度顯著提高，與對照組沒有顯著差異，這與Ley等[20-21]的研究結(jié)果一致，表明原花青素B2可調(diào)節(jié)衰老小鼠腸道中Bacteroidetes和Firmicutes的相對豐度，調(diào)整腸道菌群結(jié)構(gòu)，從而延緩衰老進(jìn)程。

本研究發(fā)現(xiàn)原花青素B2干預(yù)的衰老模型小鼠Roseburia和Lachnospiracea屬的相對豐度均顯著上升，其中Roseburia是一類在結(jié)腸代謝產(chǎn)生丁酸的革蘭氏陽性菌，其可以發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)生乳酸及少量乙酸[22]。據(jù)報道，身體虛弱的老年人[23]、結(jié)直腸癌患者[24]以及肝硬化患者[25]的糞便中丁酸鹽產(chǎn)生菌顯著減少。王芳[25]通過Illumina MiSeq測序分析發(fā)現(xiàn)百歲老人腸道中球狀梭菌類群的Roseburia屬相對豐度顯著增加，Zhao Liang等[26]也得到同樣的結(jié)果。unclassif i ed-Lachnospiraeae是厚壁菌門中產(chǎn)生丁酸鹽的重要類群，丁酸被證實能夠減輕腸炎對黏膜的損傷[27]，并且能夠緩解衰老導(dǎo)致的腸道炎癥[28-30]。原花青素B2干預(yù)后，衰老小鼠體內(nèi)SCFAs含量顯著上升。SCFAs尤其是丁酸能通過影響白細(xì)胞黏附分子的表達(dá)而起到抗炎作用，同時，SCFAs可保護(hù)黏膜細(xì)胞的正常功能，減少有毒物質(zhì)的吸收，增加細(xì)胞活性，延緩衰老[31-33]。原花青素可促進(jìn)小鼠腸道代謝產(chǎn)生SCFAs，調(diào)節(jié)腸道pH值，維持腸道內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，進(jìn)而改善衰老機(jī)體腸道菌群的平衡狀態(tài)，具有延緩衰老的作用。

本研究結(jié)果表明原花青素B2可以增強(qiáng)衰老小鼠腸道抗氧化活性，調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)，一定程度上增加了產(chǎn)生丁酸類有益菌的相對豐度，促進(jìn)SCFAs產(chǎn)生，維持腸道平衡，進(jìn)而延緩衰老進(jìn)程。